Dieses Protokoll ist aus zwei Hauptgründen von Bedeutung. Nummer eins, ermöglicht es einem Benutzer, die Zellzykluszustände von Hautzellen zu bestimmen, die aus einem Tiermodell isoliert wurden. Es ermöglicht uns auch, die Proteinexpression in den diskreten Phasen des Zellzyklus zu analysieren.
Im Vergleich zu früheren Methoden zur Bestimmung der Zellproliferation ermöglicht unsere Methode eine genauere Bestimmung der verschiedenen Phasen im Zellzyklus, und wir können auch mehr als 40 verschiedene Marker in den verschiedenen Stadien der Zellteilung analysieren. Dies verbessert die Anwendung und Vielseitigkeit der Methode erheblich. Dieses Protokoll kann in der Krebsforschung und in jeder anderen Art von Krankheit verwendet werden, wo es notwendig ist, Zellzyklus spezifische Proteinexpressionsmuster zu bestimmen.
Darüber hinaus kann dieses Protokoll an andere Zelltypen und an anderen Modellorganismen geändert werden. Das erste Mal Benutzer sollte sich darauf konzentrieren, die bestmögliche Qualität der Zellvorbereitung zu erhalten. Dies erfordert die rechtzeitige Verarbeitung der experimentellen Haut mit frischen Reagenzien, minimale Gewebeverdauungszeit und eine sorgfältige Entsorgung des Überstandes nach der Zentrifugation, um die Integrität und Menge der Zellen zu erhalten.
Entwerfen Sie zunächst ein mit Metall markiertes Antikörperpanel mit einer kostenlosen Online-Panel-Design-Software, wie im Manuskript beschrieben. Dann bereiten Sie eine IdU-Lagerlösung vor, indem Sie IdU-Pulver bei 10 Milligramm pro Milliliter in 0,1 normalem Natriumhydroxid bei 60 Grad Celsius auflösen. Nachdem Sie die IdU-Lagerlösung in Mikrozentrifugenrohre einfrieren, frieren Sie sie bei minus 20 Grad Celsius ein, um sie langfristig zu lagern.
Stellen Sie unmittelbar vor Gebrauch den pH-Wert der IdU-Lösung auf 7,5 mit 12 normaler Salzsäure ein, und testen Sie mit einem pH-Streifen auf einem Auswurf-Aliquot, um sicherzustellen, dass die Lösung bei pH 7,5 liegt. Zur Herstellung einer zwei x Paraformaldehyd-Fixierlösung fünf Milliliter 10 x PBS und einen Milliliter 16%PFA mit 44 Milliliterr reinem molekularem destilliertem Wasser kombinieren. Um 100 Millimolar Cisplatin-Stammlösung vorzubereiten, lösen Sie 300,5 Milligramm Cisplatinpulver in 10 Milliliter DMSO auf.
Für Experimente, die über einen Tag verwendet werden können, bereiten Sie eine 10 Millimolar Cisplatin Arbeitslösung vor. Wiegen Sie Mäuse und bestimmen Sie dann eine Dosis bei 0,1 Milligramm IdU pro Gramm Körpergewicht. Verabreichen Sie die berechnete Dosis von IDU durch eine intraperitoneale Injektion, und warten Sie zwei Stunden, bevor Sie Zellen ernten.
Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um das Ohr der eingeschläferten Maus, die zuvor mit IdU an der Basis des Ohres injiziert wurde, operativ zu entfernen. Legen Sie das Ohr auf eine trockene 100-Millimeter-Petrischale. Trennen Sie vorsichtig das Vorderteil von der hinteren Haut, indem Sie feine Zangen verwenden, um eine Tasche in der Mitte oder am Rand des Schnittbereichs zu erstellen, dann ziehen Sie die beiden Hautklappen auseinander, und fahren Sie mit den vorderen und hinteren Fellen fort.
Legen Sie die vorderen und hinteren Häute eines Ohres vorsichtig in einen Brunnen einer 12-Well-Kulturplatte, gefüllt mit einem Milliliter frisch zubereiteter Dispase/Kollagenase-Lösung, wobei die Hautseite die Lösung berührt. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die Haut zu verdauen. Legen Sie das verdaute Ohr oder die neonatale Haut in eine saubere Petrischale mit der Epidermisseite, die die Oberfläche der Schale berührt.
Mit Zangen, glätten Sie die Haut und schieben Sie die Dermis sanft von der Epidermis, indem Sie von der Mitte zu den Rändern in einem kreisförmigen Muster arbeiten. Mit Zangen die Epidermis an den Rändern greifen und sanft abheben, indem Sie sie von der Oberfläche der Petrischale abziehen. Legen Sie die Epidermis vorsichtig auf eine vorgewärmte Zellablösung in einem Blechbrunnen.
Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius oder 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie sterile Zangen, um die Epidermis und Peeling zu erfassen, indem Sie die Epidermis gegen den Boden der Schale ziehen, um Zellen zu dissoziieren. Fügen Sie einen Milliliter DMEM mit 1%FBS hinzu und durchlaufen Sie ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein Sammelrohr.
Spülen Sie gut mit zusätzlichen zwei Milliliter DMEM und fügen Sie die Zellsuspension hinzu. Nach dem Zentrieren bei 120 mal g für fünf Minuten, vorsichtig den Überstand aspirieren. Setzen Sie das Zellpellet in ein bis zwei Milliliter DMEM mit 1%FBS wieder aus, und pellet die Zellen wie bisher wieder.
Um Zellen zur Bestimmung lebender und abgestorbener Zellen zu kennzeichnen, setzen Sie ein bis drei Millionen Zellen in einem Milliliter DMEM, das 25 Mikromolar-Cisplatin enthält, wieder aus und brüten eine Minute lang. Quench durch Pipettieren mit einem gleichen Volumen von FBS. Nach der Zentrifugierung bei 120 mal g für fünf Minuten, dekantieren Sie den Überstand in einen Becher mit verdünnter Bleichmittel, und invertieren Sie die Rohre, um die restliche Lösung auf ein Papiertuch abzutropfen.
Setzen Sie das Zellpellet in zwei Milliliter bariumkationsfreiem PBS aus, und zentrifugieren Sie es wie zuvor beschrieben wieder. Um die Zellen zu fixieren, setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter bariumkationsfreier PBS wieder auf. Wirbeln Sie die Zellen unter kontinuierlicher niedriger Leistung und fügen Sie einen Milliliter der beiden x PFA Fixationspuffer tropfenweise hinzu.
Auf einer Schaukelplattform platzieren und bei Raumtemperatur 10 Minuten bebrüten. Nach der Zentrifugierung bei 500 mal g für fünf Minuten, den Überstand vorsichtig dekantieren. Waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern bariumkationenfreier PBS, Zentrifuge wieder unter den gleichen Bedingungen, und wiederholen Sie den Waschschritt.
Schließlich das Pellet in zwei Milliliterbarkationen-freiem PBS wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 mal g und dekantieren Sie den Überstand sorgfältig. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter eines x Fixationspuffers aus, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 10 Minuten und wiederholen Sie die Zentrifugation.
Um die Zellen zu waschen, fügen Sie einen Milliliter Barcode-Permeabilisierungspuffer hinzu. Während der Zellzentrifugation bei 500 mal g für fünf Minuten, bereiten Barcodes durch Hinzufügen von 100 Mikroliter Barcode Permeabilisation Puffer zu ihnen, und mischen Sofort. Setzen Sie das Zellpellet in 800 Mikroliter Barcode-Permeabilisationspuffer wieder auf.
Barcode-Lösung zu den Zellen hinzufügen, mischen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubieren. Zentrifuge bei 500 mal g für fünf Minuten. Waschen Sie Zellen in zwei Milliliter Zellfärbung Puffer und Zentrifuge wieder.
Als nächstes, resuspend ieren Ein bis drei Millionen Zellen in einem Milliliter der nuklearen Antigen-Färbung Puffer Arbeitslösung, und inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nach der Zentrifugierung bei 500 mal g für fünf Minuten, den Überstand vorsichtig dekantieren. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter kerniatischer Antigen-Färbungspermeabilisationspuffer und Zentrifuge wieder aus.
Nach wiederholter Resuspension und Zentrifugation das Zellpellet im Restvolumen mit sanftem Wirbel nieren. 50 Mikroliter intrazellulären Antikörpercocktail hinzufügen, mischen und bei Raumtemperatur 45 Minuten inkubieren. Fügen Sie zwei Milliliter Zellfärbungpuffer hinzu.
Zentrifugieren Sie unter den gleichen Bedingungen wie im vorherigen Schritt, und entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in zwei Milliliterzell-Färbepuffer, Zentrifuge bei 500 mal g für fünf Minuten wieder aufhängen und die Wiederaussetzung und Zentrifugation wiederholen. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter Intercalationslösung aus und lagern Sie sie ein bis drei Tage bei vier Grad Celsius.
Nach dem zentrieren der Zellen wieder, waschen Sie das Pellet mit zwei Milliliterzell-Färbepuffer, Zentrifuge unter den gleichen Bedingungen, und führen Sie zwei zusätzliche Waschungen mit zwei Milliliter Wasser, mit der gleichen Zentrifugation. Setzen Sie das Zellpellet mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter mit verdünnter EQ-Perlenlösung wieder aus, und führen Sie die Proben dann auf dem Massenzytometer aus. Erwartete Zellerträge und Lebensfähigkeit von erwachsenen Mausohr und neonatalen Haut werden bestimmt.
Die ungefähre Ausbeute hängt von der Oberfläche der Haut ab. Neonatale Haut ist eine bessere Wahl für Experimente, die eine größere Anzahl von Zellen erfordern. Die grundlegende Gating-Strategie zur Auswahl intakter, einzelner und lebensfähiger Zellen nach Normalisierung und Dekonvolution von Barcode-Massenzytometriedaten wird angezeigt.
Der Prozentsatz lebensfähiger Zellen kann auf die Qualität oder den Zustand der Zellen vor der Färbung hinweisen. Unterschiede in der Lebensfähigkeit zwischen kultivierten Karzinomzellen im Vergleich zu isolierten Maus-Ohrzellen werden ebenfalls gezeigt. Lebensfähige Zellen wurden auf Ereignislänge im Vergleich zu CD45 abgegrenzt, um hämatopoetische Zellen auszuschließen.
Die Einbeziehung von Linienmarkierungen ermöglicht die Auswahl von Zellpopulationen, die in verschiedenen Zellzyklusphasen von Interesse sind. Das grundlegende Zellzyklusprofil wird durch den Nachweis von BrdU im Vergleich zu PI in der fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie ermittelt. Die Einbeziehung anderer Proliferationsmarker mit Massenzytometrie ermöglicht jedoch eine genauere Identifizierung von Zellzyklusphasen.
Nach diesem Ansatz können Zellzyklusprofile für verschiedene Zelltypen oder experimentelle Bedingungen erstellt werden, z. B. für die Profile für CD45-Negativ- im CD45-positiven Zellen aus demselben Experiment. In einem anderen Beispiel ergab die Analyse von Markern, die die Signalwege EGFR und mTOR PI3K in der G-one-Phase definieren, ähnliche Expressionsprofile in CD45-Negativzellen, die in orange- und CD45-positive Zellen in Blau dargestellt sind. Massenzytometrie erfordert viele hochwertige Zellen.
Wenn ein Benutzer an einer seltenen Zellpopulation interessiert ist, kann eine höhere Anzahl von Zellen erforderlich sein. Isolierte lebende Zellen können für DNA- oder RNA-Analysen, biochemische Studien oder in der Gewebekultur vor der Fixierung und Färbung für die Massenzytometrie verwendet werden. Der Benutzer sollte bei der Arbeit mit Paraformaldehyd, Salzsäure oder Natriumhydroxid bei Bedarf persönliche Schutzausrüstung und einen Sicherheitsschrank verwenden.
