NGF entregado al cerebro es un reto. Aquí te presentamos un nuevo tipo de portador que permite una liberación segura y prolongada de la proteína bioactiva. Esta técnica permite una carga simple y eficiente de NGF en portadores de silicio poroso.
Se lleva a cabo a temperatura ambiente y sin utilizar disolventes orgánicos fuertes. Como el diseño del portador de silicio poroso es sintonizable, los portadores pueden servir como implantes de depósito de NGF para una liberación a largo plazo, pero también se pueden modificar para transportar otros factores y medicamentos. Para ingenieros y químicos, el proceso de fabricación puede ser más fácil de realizar.
Mientras que para la vida los científicos y los médicos, los procedimientos de cultivo celular deben ser relativamente fáciles de reproducir. Comience montando una oblea de silicio de un punto cinco por un punto de cinco centímetros con una resistividad bien caracterizada en una célula de grabado de etina de politetrafluro utilizando una tira de papel de aluminio como contacto posterior y una junta tórica para sellar la célula. El tejido es represistible para el uso de obleas de silicio con valores de resistividad similares cada vez.
Grabar electroquímicamente la muestra de silicio en una solución de tres a uno de ácido fluorhídrico akleus y etanol durante 20 segundos a una densidad de corriente constante de 250 miliamperios por centímetro cuadrado. A continuación, enjuague la superficie de la película de silicio poroso resultante con etanol tres veces antes de secarse bajo una corriente de nitrógeno. Cuando la muestra esté seca, oxidar térmicamente la muestra de silicio poroso recién grabado en el horno de tubo a 800 grados Celsius durante una hora en aire ambiente para formar un andamio de silicio poroso oxidado.
Cuando la muestra se haya enfriado, utilice una sierra de dicing para cortarla en una muestra de ocho por ocho milímetros. Para cargar las muestras con NGF, dispensar 52 microlitros de solución de carga de NGF recién preparada en la parte superior de cada muestra e incubar las muestras durante dos horas a temperatura ambiente en un plato cubierto en condiciones de alta humedad. Después de dos horas, recoja la solución encima de las muestras y diluya la solución de carga de NGF y las muestras de solución de carga posteriores recogidas en el rango de concentración adecuado para el kit de iliza.
Una vez diluidas todas las muestras, añada 100 microlitros de las muestras diluidas en muestras de curva de calibración a cada pocódi de captura de NGF recubierto de 96 placas de iliza de pozo para una incubación de dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave la placa cuatro veces y añada cien microlitros de un microgramo por mililitro de anticuerpo de detección biotentilado a cada pozo durante una incubación de dos horas a temperatura ambiente. Después de cuatro lavados, como se ha demostrado, añada 100 microlitros de peróxido de vecúster de Avidin-Horseradish a cada pozo para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente seguida de cuatro lavados en tampón de lavado como se ha demostrado.
Después del último lavado, añadir 100 microlitros de solución de sustrato a cada pozo para una incubación de desarrollo de color de 25 minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia a 405 nanómetros con la corrección de longitud de onda establecida en 650 nanómetros y determinar la concentración de NGF tanto en la solución de carga como en la solución de carga posterior recogida en función de la curva de calibración. Para la liberación de NGF In Vitro, incubar los portadores de silicio poroso oxidado cargados por NGF en dos mililitros de pbS molar cero complementado con un albaman sérico de la noche de un porcentaje en el punto cero cero dos por ciento de azida sódica a 37 grados Celsius y 100 rotaciones por minuto de adyatación orbital.
Recoger la solución cada dos días sustituyéndola por dos mililitros de PBS fresco después de cada aspiración. A continuación, congele las muestras de liberación recogidas en nitrógeno líquido durante menos 20 grados centígrados de almacenamiento hasta que el análisis de NGF por iíiza se muestre como acaba de demostrar. Para generar un feo cromo sitoma 12 o PC 12 diferenciado, cultivo celular, recoger la suspensión celular por sentripugation y suspender las células en cinco mililitros de medio de crecimiento básico fresco.
Después de una segunda sentribugación, re suspenda el paladar en tres mililitros de medio de crecimiento básico y utilice una jeringa de calibre 23 para aspirar las células 10 veces para separar cualquier grupo celular. Después de contar, la semilla de una a la cuarta celda por centímetro de área de trabajo cuadrada en un colligen tipo una placa recubierta en presencia de medio de diferenciación. Coloque las placas en la incubadora.
Después de 24 horas a 37 grados Celsius añadir fresco murino beta NGF o NGF cargado portador de silicio poroso a cada plato y devolver las placas a la incubadora. Para evaluar la viabilidad celular, incubar los cultivos con el 10 por ciento de una solución indicadora de viabilidad adecuada en puntos de tiempo representativos durante cinco horas a 37 grados centígrados y medir la absorbancia en un espectroetómetro a 490 nanómetros con la corrección de longitud de onda en 630 nanómetros. Para evaluar la diferenciación celular PC 12 en presencia de portadores de silicio poroso cargados por NGF, sembrar las células PC 12 en 12 placas recubiertas de colágeno bajo durante 24 horas en una incubadora de cultivo celular e introducir las muestras previamente obtenidas in Vitro en los pozos experimentales apropiados.
Después de una incubación de 24 horas, imagine las células por microscopía de luz y cuente manualmente el número de células con alkronuritas en cada pozo. Para el análisis morfométrico de las células diferenciadas de PC 12 adquieren imágenes de fase de las células cultivadas hasta tres días después del tratamiento con NGF y abren los archivos en la neurona J.Convertir el archivo de imagen a un formato de ocho bits y utilizar la barra de escala de imagen para medir la relación píxel a micrómetro. Utilice analizar y establecer la escala para establecer la escala y medir la longitud de cada neurita.
A continuación, cuente manualmente el número de puntos de bifurcación y el número de noúculas que se originan en cada soma de celda. Se muestran imágenes de microscopía electrónica de barrido de alta resolución de la película de silicio poroso oxidado resultante. Un micrográfico de visión superior de la película revela su naturaleza altamente porosa con poros de aproximadamente 40 nanómetros de diámetro.
Un micrografo transversal de una película cortada revela un espesor de capa porosa de dos puntos nueve micrómetros que se caracteriza por interconectar poros cilíndricos. Una liberación sostenida de NGF sin efecto de ráfaga se logra durante un período de un mes con una liberación más rápida de NGF durante la primera semana en comparación con una tasa de liberación mucho más lenta en los últimos días del período de lanzamiento. El tratamiento con portadores de silicio poroso cargados por NGF induce la formación de neuritas en redes neuronales ramificadas características en cultivos celulares PC 12.
Tenga en cuenta que incluso después de 26 días, el NGF liberado induce la diferenciación celular de más del 50 por ciento indicando que el encierro de NGF dentro del huésped poroso preserva la actividad biológica de la proteína durante un período de aproximadamente un mes. El análisis morfométrico de las poblaciones de células tratadas con silicio poroso cargado por NGF en los días uno y tres revela que las células PC 12 tratadas con Silicio poroso cargado por NGF exhiben valores morfométricos similares a los observados en los cultivos de tratamiento controlado para los tres parámetros probados. Seguir y cumplir adecuadamente los pasos presentados le proporcionará un sistema de administración de NGF ventajoso capaz de mantener la supervivencia y diferenciación de las células neuronales.
Actualmente estamos investigando el uso de portadores de silicio poroso NGF como implantes de liberación a largo plazo en el cerebro para estudiar su efecto protector normal y conocer enfermedades degenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Después de este procedimiento, también se puede estudiar el efecto de los portadores de silicio poroso cargados por NGF en un crecimiento normal de células de gangrena de madera dosificada. El silicio poroso es un nanomaterial prometedor que se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones.
Aparte de la que se presenta aquí, incluyendo sensores biológicos o químicos, diagnósticos e imágenes. Para descartar cualquier posible toxicidad de los portadores de silicio poroso, hacia su línea celular, asegúrese de realizar ensayos de separabilidad y esterilizar sus muestras de silicio poroso.
