אז היתרון העיקרי של הטכניקה החדשה שלנו, אנחנו מכנו את זה E פלוס E, אשר מייצג העשרה בתוספת התרחבות, היא שאנחנו יכולים להעשיר ולהרחיב את התאים האלה, תאים אנטיגן ספציפיים נדירים, בו זמנית. זה מאפשר לנו לפתח מספר מספיק של תאים שאנחנו הולכים להיות מסוגלים להשתמש כדי לחקור את תפקידם בהגדרות שונות ובמסגרות קליניות שונות או אפילו מאפשר לנו לפתח עכשיו מספר גדול של תאים שאנחנו יכולים לנצל עבור אימונותרפיה באופן שאנחנו לא יכולים לפני. השיטה שפיתחנו, E פלוס E זה, יכול לעזור לענות על שאלות מפתח באימונולוגיה בסיסית על נוכחות של neoepitopes.
מה הם ניאופיטופים? אלה הם epitopes אישית שאנחנו יודעים עכשיו חשובים מאוד במונחים של אימונותרפיה סרטן וגם דינמיקה ספציפית אנטיגן וכיצד גורמים אלה משפיעים על מצבי המחלה ועל טיפול תאי יעיל. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון אימונותרפיה, כיוון שתא אנטיגן מלאכותי ננו-חלקיקי יכול להיות מוצר מחוץ למדף המותאם בקלות לתגובות חיסוניות של מטופלים בודדים.
כדי ליצור תאים אנטיגן מלאכותיים ננו-חלקיקים, יש לעכל מחדש את החלקיקים הליופילים במיליליטר אחד של חיץ ההתלות מחדש ולמערבולת נמרצת את ההשעיה למשך 15 דקות לפחות עד שלא יהיו אגרגטים גלויים. חלקיקים שאינם מערבולת מספקת ו resuspended לפני התגובה עם חלבון יגרום חלקיקים מצטברים גדולים יותר שאינם מסוגלים להיות ניתקו. מניחים את החלקיקים המגנטיים על מעמד מגנטי כדי להסיר את העל-טבעי ולתלות אותם מחדש עם 0.5 מיליליטר של חיץ רב-הייה טרי.
מעבירים את מתלי החלקיקים לבקבוקון זכוכית למערבולת עד שלא נראים אגרגטים, ומוסיפים 0.1 מיליגרם של אותות ממריצים לכל מיליגרם אחד של חלקיקים תלויים מחדש. לאחר מערבולת, לאפשר את ההשעיה להגיב במשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מסובב, ואחריו תוספת של 0.1 מיליליטר של חיץ מרווה עבור דגירה נוספת של 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב. בסוף התגובה השנייה, מניחים את בקבוקון ההבלטה על הכן המגנטי ושוטפים את החלקיקים במיליליטר אחד של חיץ ההתפוגה ארבע פעמים, מסירים את החיץ כאשר הוא מתבהר לאחר כל שטיפה ומחליפים אותו במאגר ההתפוגה הטרי לכביסה הבאה על המגנט.
לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את הפתרון והוציאו את החלקיקים מהעמוד המגנטי, ואז אחסנו את החלקיקים במיליליטר אחד של מאגר רב-התישה טרי בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. כדי לבודד תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן, יש לבודד את הטחולים ובלוטות הלימפה מעכברי C57 שחורים מסוג פראי 6J באמצעות מסננת תאים סטרילית של 70 מיקרומטר עם שטיפות PBS תכופות ולהשתמש בערכת בידוד תאים CD8+T ללא מגע בהתאם להוראות היצרן לחסל את התאים שאינם CD8+T. לאחר הספירה, לאסוף את תאי CD8 + T מבודדים על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה ב 100 microliters של PBS בתוספת 0.5%Bovine סרום אלבומין ושני מילימולרים EDTA, לאחר מכן הדגירה את התאים עם תאים אנטיגן מלאכותי חלקיקי מציג כך שיש פעם אחת 10 כדי 11 פפטיד טעון MHC-ig לכל אחד פעמים 10 כדי השישי מבודד CD8 + T תאים סטריליים צינור פוליסטירן באורך 5 מיליליטר עם תחתית עגולה למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמשך.
בסוף הדגירה, לשטוף את ההשעיה תא ננו חלקיקי שלוש פעמים על הדוכן המגנטי כפי שהודגם, שימוש חוזר בתאים מלאכותיים מציג אנטיגן ותאי CD8 + T מועשרים ב 500 microliters של טרי, בתוספת בינוני עם 1%T גורם גדילה של התא לאחר הכביסה האחרונה. להתאוששות תאית מקסימלית, חיוני להשאיר את החלקיקים והתאים בעמודה המגנטית למשך שתי דקות לפחות ולשאף את המאגר בזהירות מבלי לשבש את החלקיקים והתאים הכפופים לשדה המגנטי. לאחר הספירה, זרעים 2.5 פעמים 10 כדי החמישי מועשר CD8 + T תאים תערובת חלקיקים מגנטיים לכל 160 microliters של מדיום בתוספת 1% TCGF בצלחת 96 היטב U-bottomed.
ביום השלישי, להאכיל את התאים עם 80 microliters של מדיום בתוספת עם 2%T גורם גדילה של תאים ל הבאר ולהחזיר את הצלחת החממה תרבות התא במשך ארבעה ימים נוספים. ביום השביעי, לקצור את התאים מגורה לתוך צינור חמישה מיליליטר עגול התחתון לספירה ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. תן את גלולה ב 0.5 מיליליטר של PBS בתוספת 0.05% נתרן אזיד ו 2% סרום בקר עוברי לספירה aliquot חמש פעמים 10 עד הרביעי עד חמש פעמים 10 לתאים החמישי לתוך צינורות חדשים חמישה מיליליטר עגול תחתית עבור כתמים ספציפיים אנטיגן.
סמן את הצינורות המתאימים עם MHC-ig biotinylated ו- CD8a נגד עכבר במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס, ואחריו לשטוף צנטריפוגה ב PBS טרי כדי להסיר כל אימונוגלובולין biotinylated עודף, ואז להכתים את הדגימות עם נוגדן משני מתאים streptavidin-conjugated ו זן התא המתים המתים מתאים לחיות-מת במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולקרוא את התאים על ציטומטר זרימה כדי לקבוע את הספציפיות ואת מספר תאי CD8 + T ספציפיים אנטיגן על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כאן הושגה התייחדות מוצלחת של חלבונים באמצעות שלוש שיטות שונות של חיבור חלבון לחלקיקים. אם צפיפות הליגנד של AAPC נמוכה מדי, לא יהיה גירוי יעיל של תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן.
בקרת איכות של dimer biotinylated ניתן להשלים על תאי CD8 + T מהונדסים כדי לאמת כתמים. לדוגמה, תוצאות מייצגות אלה ממחישות הכתמה חיובית בתאי CD8+T ספציפיים ל- GP100 עם תאי b6 CD8+T שאינם ספציפיים לאנטיגן כפקד רקע. כמו כן, הידע של כתם הרקע של dimer biotinylated הוא קריטי, כמו כל אחוז נמוך יותר מאשר כתמים זה צינורות מוכתמים קוגנט צריך להיחשב תוצאה שלילית.
לאחר שבעה ימים של העשרה והתרחבות, בין שתי פעמים 10 לרביעית ושתיים פעמים 10 כדי אנטיגן החמישי ספציפי וחמישה עד 50% CD8 + T תאים ניתן לצפות מחמישה פעמים המקורי 10 כדי השישי אנדוגני CD8 + T התא מתחיל האוכלוסייה. ניתן להשתמש באותה מתודולוגיה כדי לבודד ולעורר תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן אנושי עם עלייה דומה באחוזים ובמספרים של תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן שנצפו לאחר שבוע אחד בלבד של התפשטות לאחר העשרה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את בדיקות האיכות המתאימות של הריג'נט כמתואר.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ציטומטריית זרימה להכתמת ציטוקינות תאית או ביטוי חלבון פני השטח כדי לענות על שאלות נוספות על הפונקציונליות או הפנוטיפ של התאים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה הבסיסי לחקור את רוחב, עומק ודינמיקה של תגובות ספציפיות לאנטיגן בתחומים ביו-רפואיים אחרים כגון סרטן, מחלות זיהומיות או מחקר אוטואימוניות.
