שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחומים של יתר לחץ דם ומחלות לב וכלי דם כולל המחקר של תאים דנדריטיים חיוביים CD11c וכיצד הם potentiate את התפקיד של פגיעה יתר לחץ דם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הבידוד של תאים דנדריטיים חיוביים CD11c מאיברים מוצקים ואת המחקר של תפקידם הפיזיולוגי במצבי מחלה שונים. אז תהליך זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים חיסוניים מרובים, כולל לימפוציטים B, לימפוציטים T, מונוציטים, מקרופאגים.
הדמיה של הטכניקה היא קריטית להבנת בידוד תאים דנדריטיים, במיוחד תהליך ההעברה המאמץ לעכברים נמען. כדי להתחיל, לרסס את החזה ואת הצדדים של העכבר המתת דם עם 70% אתנול. בצד שמאל, בזהירות לפתוח את העור ואת חלל צפי כדי לחשוף את הטחול.
באמצעות מדפים קטנים, בזהירות להזיז את המעיים והכבד לצד שמאל של העכבר. לאחר מכן השתמש במספריים קטנים כדי למלמל בעדינות את הטחול. מניחים כל טחול excised לתוך צינור C שכותרתו המכיל שלושה מיליליטר של RPMI 1640 בינוני.
ראשית להוסיף קולגנס D ו DNase מוכן RPMI 1640 בינוני להכין את פתרון עיכול הטחול. מניחים את צינור C על homogenizer אוטומטי למחצה ולהבטיח כי הצינור ממוקם בחוזקה על הזרוע המסתובבת. לחץ על לחצן ההפעלה של homogenizer כדי להפעיל את פרוטוקול הטחול 04.01 למשך 60 שניות.
לאחר מכן, לנתק את הצינור מן homogenizer ולהדגר את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס תחת רציף ב 20 סל"ד במשך 15 דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי להעביר את הפתרון לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר לאחר סינון זה דרך מסננת 40 מיקרומטר. לשטוף את מסננת עם 10 מיליליטר של dPBS.
צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ואז לשאפת את supernatant לחלוטין לשטוף את גלולה על ידי השעיה מחדש אותו 10 מיליליטר של dPBS. צנטריפוגה ההשעיה ב 300 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
להשעות מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של dPBS. השתמש בהמוציטומטר ובהדרה כחולה של Trypan כדי לספור את מספר התאים. הצנטריפוגה הבאה ב 300 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה את התאים.
שאפו את העל-טבעי לחלוטין והשעו מחדש את גלולת הכדור ב-400 מיליליטר של חיץ מיון תאים המופעל מגנטית. לאחר מכן הוסיפו 100 מיליליטר של חיידקים CD11c לכל 100 מיליון תאים. מערבולת ההשעיה התא דגירה במשך 10 דקות במקרר בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של מאגר MACs לשטוף את התאים צנטריפוגה ב 300 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שאף את העל-טבעי לחלוטין והשהה מחדש את התאים ב- 500 מיליליטר של מאגר MACs. מניחים את עמודת ה- LS בשדה המגנטי של מפריד המג וממקמים צינור חרוט 15 מיליליטר מתחת לכל עמודה כדי לאסוף את הזרימה.
לאחר מכן, שטפו את העמודות בשלושה מיליליטר של חיץ. מקם את ההשעיה של התא על כל עמודה ואסוף את הזרימה שדרבה מכיל תאים ללא תווית. לשטוף את העמודים עם שלושה מיליליטר של מאגר MACs ולאסוף את התאים ללא תריס העוברים.
לשטוף את עמודות LS פעמיים נוספות באמצעות שלושה מיליליטר של מאגר MACs לכל לשטוף. לאחר מכן, הסר את עמודות LS מהמפריד המגנטי. הוסף חמישה מיליליטר של מאגר MACs לכל עמודה ומיד לצלול כל עמודה לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ברור כדי לשטוף את התאים המסומנים מגנטית.
השתמש בהמוציטומטר ובהדרה כחולה של Trypan כדי לקבוע את מספר ה- DC החיובי של CD11c כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן לדלל את דגימת התא בדילול אחד לאחד ב 0.4%פתרון כחול טריפאן. תחילה, הכן את כדורי התא במדיה של תרבות DC כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
פיפטה 900 מיקרוליטרים של ההשעיה DC לתוך צלחת בז תחתונה שטוחה 24 באר. הוסף 100 microliters של מדיה תרבות DC מלח גבוה לכל באר, עבור ריכוז נתרן סופי של 190 מילימולר. סמן את הצלחת והצב אותה באינקובטור פחמן דו חמצני לח ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
לאחר 48 שעות מוציאים את הצלחת מהחמה. פיפטה מדיה תרבות התא באר אחת למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את תקליטורי ה- DCs החיוביים של CD11c. העבר את כל ההשעיה הזו בצינור 1.6 מיליליטר תואם.
חזור על זה עבור כל באר בודדת כי היה מצופה. צנטריפוגה כל הצינורות ב 300 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שאפו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת DC עם 100 מיקרוליטרים של dPBS סטרילי.
לאחר מכן, צייר את פתרון DC מאחד הצינורות למזרק מיליליטר אחד, מצויד במחט 27 מד חצי אינץ '. הנח את הזכר הנאיבי בן 10 שבועות C57-black-6 עכבר תחת 2%isoflurane כדי להשיג מישור כירורגי יציב. בדוק את רמת ההרדמה עם חוסר רפלקס דוושה.
לאחר מישור כירורגי יציב מושגת, לאט ובזהירות להציג את המחט לתוך החלל רטרו מסלולית בזווית של כ 30 מעלות. מזריקים לאט ובחלקה את מתלי DC החיוביים CD11c. לאחר השלמת ההזרקה, הסר בזהירות את המחט לחלל רטרו-מסלולית, הקפד לא לפגוע בעין.
לאחר מכן להסיר את העכברים מן חרוט האף לפקח עליהם במשך כ 30 דקות במהלך ההתאוששות מן ההרדמה. ניתוח לחץ דם טיפוסי מוצג כאן בעקבות העברה מאמצת של DCs ומשאבות מיני osmotic שהושתלו עבור עירוי אנגיוטנסין II במינון נמוך. יש לציין כי זה מינון נמוך של אנגיוטנסין II הוא מינון מדכא שאינו מגביר את לחץ הדם בעכבר נורמלי.
עכברים המקבלים תקליטורים חיוביים CD11c שטופלו במלח שומרים על לחץ דם תקין במהלך העירוי, בעוד שהעכברים המקבלים תקליטורים חיוביים בעלי מלח גבוה מציגים עלייה בלחץ הדם הסיסטולי. ניתוח ציטומטריית זרימה מבוצע לאחר מכן תוך שימוש באסטרטגיית gating המוצגת כאן כדי לקבוע את הטוהר של התאים החיוביים המבודדים CD11c. העשרה מוגברת של התאים החיוביים CD11c נתפסת בהשוואה הטחול הכולל.
ריכוזי CD11c Microbead שונים מנוצלים לפתרון בעיות בפרוטוקול היצרן. הפרד מגנטי של טחול באמצעות 100 microliters של Microbeads מניב כ 65% של תאים חיוביים CD11c, תוך שימוש 200 microliters מניבה 55%ושימוש 300 microliters מניבה 50% חוסם FcR כלול יחד עם 100 מיקרוליטרים של Microbeads. בעקבות ההפרדה המגנטית, המצור של FcR מניב כ 65%CD11c תאים חיוביים.
כמה טחול לאחר מכן דגירה עם 100 microliters של Microbeads ומופרדים מגנטית דרך עמוד LS. התאים המופרדים דגירה עם 100 microliters נוספים של CD11c ומופרדים שוב באמצעות עמודת LS. תהליך בידוד כפול זה הניב תאים חיוביים של 92%CD11c.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לאשר את טוהר התאים המבודדים על ידי ציטומטריית זרימה. לאחר בידוד מגנטי של תאים דנדריטיים הם יכולים להיות מתורבתים כדי לקבוע את מצב ההפעלה שלהם על ידי טכניקות מולקולריות כולל פרוטומיקה וריווח תא יחיד. מאז התפתחותו, כעת ניתן ללמוד את הפונקציה ואת התפקיד הספציפי של תאים דנדריטיים ביתר לחץ דם.
החוקרים חוקרים כעת את האנטיגנים הספציפיים ביתר לחץ דם.
