שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחסום בדיקת הדם של תחומי הביולוגיה על מועמדים לגנים, וירוסים או רעלנים סביבתיים שעלולים להשפיע על תפקוד מחסום בדיקת הדם או על שלמותו. שלושה ימים לפני הניתוח, לטפל לפחות שמונה שבועות C57Black/6 עכברים זכרים מדי יום עם חמישה מיליגרם לכל קילוגרם משקל הגוף קדמיום כלוריד באמצעות הזרקה תוך-ניתוחית. ביום הניתוח, מניחים רקמה נקייה מעל אזור כירורגי מעוקר 75% אתנול ולהגדיר תנור תרמוסטטי ל 37 מעלות צלזיוס.
מניחים עכבר הרדמה על הרקמה, ולאחר מכן לאשר חוסר תגובה לצביטת בוהן. מגלחים את שיער הבטן עם מכונת גילוח, ומחטאים את העור החשוף עם 75% אתנול. בצע חתך בעור בסנטימטר אחד מעל בלוטות הקדם-ליחה כדי לחשוף את דופן הבטן, ולהשתמש בממטרים קטנים כדי להרים את העור כדי לבצע חתך של 0.5 ס"מ בצלע.
השתמש במטחנים כדי לחפש רפידות שומן סביב epididymis ו testis, בזהירות מושך את רפידות השומן החוצה כדי לחשוף אשך אחד מצורף. מניחים פיסת נייר באורך תשעה סנטימטרים מתחת לכריות השומן והאסטיס, ומעמיסים פיפטה מיקרו-ג'ינג'י עם תמיסת אינולין-FITC שהוכנה זה עכשיו. חבר את הפיפלט ליחידת מיקרומניפולטור, ולהשתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי להכניס בעדינות את קצה פיפטה microinjection מתחת אלביניה טוניקה.
סובב באיטיות את ידית ההפעלה כדי לספק 20 מיקרוליטרים של inulin-FITC לתוך האינטרסטיטיום של האשכים. אם המסירה תצליח, האשכים יהפכו צבע ירוק-צהוב בהיר. מיד להחזיר את האשכים לחלל הבטן, ולהזריק את האשכים contralateral עם 20 microliters של PBS, ולאחר מכן לסגור את העור עם תפר כירורגי.
ומ מניחים את העכבר על כרית החום של תנור תרמוסטטי. 40 דקות לאחר ההזרקה, להשתמש במספריים חדים כדי לאסוף את האשכים מכל עכבר, ולשטוף את הרקמות במיליליטר אחד של PBS קר כקרח. לאחר מכן, לתקן את האשכים ב 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס במשך 12 עד 24 שעות ואחריו שלוש שטיפות ב 1.5 מיליליטר של 1%PBS לכל לשטוף.
לאחר התייבשות סוכרוז של 30% במהלך הלילה, מעבירים את הדגימות למסגרות הטבעה בודדות, ומכסים את הרקמות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית. הגדר את הטמפרטורה של קריוסטט שלילי 20 מעלות צלזיוס ולמקום את המסגרות קריוסטט במשך כ 10 דקות עד OCT קפוא. לאחר מכן, מלא כל מסגרת הטבעה ב- OCT טרי עד שכל האשכים יכסו בכל תבנית.
כאשר השכבה השנייה של OCT קפאה, לרכוש חתך בעובי חמישה מיקרומטר של כל האשכים, לכידת קטעי הרקמה על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית כפי שהם מתקבלים. כדי לדמיין את הדגימות, חמם תחילה את השקופיות בתיבה לחה בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים מלוחים טריים לאגירה לכל לשטוף ולאפשר את החלקים להתייבש במשך חמש דקות מוגן מפני אור.
השתמש בנייר ללא אבק כדי להסיר את כל שאריות תמיסת מלח, והעלה את הדגימות עם מדיום הרכבה בתוספת DAPI. לאחר מכן, לכסות כל דגימה עם להחליק כיסוי הפוך, ותמונה הדגימות תחת המטרה 20X של מיקרוסקופ confocal. שלושה ימים של טיפול קדמיום כלוריד גורם נזק למחסום בדיקת הדם המאפשר דיפוזיה inulin-FITC מן התא הבסיסי לתא apical של האפיתל חצי שנתי.
לעומת זאת, דיפוזיה זו חסומה בבקרה אשכים שטופלו ב- PBS. היקף הנזק למחסום בדיקת הדם נקבע על ידי חישוב היחס בין המרחק של דיפוזיה אינולין-FITC לרדיוס של אותו צינור חצי שנתי. יתר על כן, מחסום בדיקת הדם שלם ב Rictor heterozygous floxed עכברי נוקאאוט בלוקים דיפוזיה inulin לאורך המחסום לתוך תא apical, בעוד עכברי נוקאאוט ריקטור מותנה להחזיק מחסום בדיקת דם בסכנה המאפשרת דיפוזיה inulin.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לספק אינולין-FITC מוכן ביום הניסוי ולשמור על הרקמה מוגנת מפני אור מאז FITC היא מולקולה רגישה לאור. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול של זרע לקוי כי הפונקציה של מחסום בדיקת הדם היא לספק microenvironment החיסיון החיסוני להשלמת meiosis ב spermatogenesis. לאחר התפתחותה, טכניקה זו מספקת דרך לחוקרים בתחום רפואת הרבייה לחקור תת פוריות ופוריות בעכברים.
אל תשכח כי עבודה עם paraformaldehydes יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות כגון לבישת בגדים ומסכות פנים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
