אנו מודים המועצה למחקר רפואי בבריטניה על ליבה מימון (U105115237) RRK.

1. הכנת תאים וחומרים
<ol><li>לטפח התאים או על פלטות אגר SM בשילוב עם חיידקים כגון קלבסיאלה aerogenes, או מזין בינוני כגון HL5 כפי שמתואר23. הערה: גידול מוטציות נוק אאוט זה הם פגומים ב macropinocytosis על חיידקים מסייע במניעת הצטברות מוטציות משני אשר עשוי להגדיל את קצב macropinocytosis. לשמור על מספר מעבר מתחת 4 לאחר ציפוי תאים מן המניות לקבלת תוצאות מיטביות. מוטציות יש לאחסנו מניות קפוא בהקדם האפשרי לאחר בידוד.</li>
	<li>לטפח תאים על פלטות אגר SM, לגדול ק' aerogenes הנהרות SM בינוני. להוסיף 200 – 300 μL של חיידקים על גבי צלחת אגר SM, להפיץ. קח לולאה סטרילי של תאים (בעת העברת עוד צלחת חיידקי), מורחים בקצה אחד של הצלחת. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס במשך שבוע.</li>
	<li>להמיס לתוספי טטרה-מתיל-rhodamine isothiocyanate (TRITC-) עד 50 מ"ג/מ"ל מים, סינון באמצעות מסננים μm 0.22 לתוך 1 מ"ל aliquots ולאחסן ב-20 ° C. Aliquots יכול להישמר ללא הגבלת זמן. הערה: 155 kDa הוא גודל אופייני בשימוש בשיטה זו, ניתן לרכוש בזול בכמויות, אבל dextrans קטנים יותר למדוד את macropinocytosis בצורה יעילה ב- Dictyostelium24. Dextrans quenchable שונים, כגון מפל כחול או אלקסה-647, הן חלופות אם fluorophores שונים נדרשים.</li>
</ol>2. המרת איכותי המידות כמותית (אופציונלי)
<ol><li>
ביצוע וזמינותו של ספיגת נוזלים באמצעות תאים ההשעיה.
	<ol>
<li>גלולה תאים axenically גדל ב g 300 x למשך 3 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, resuspend מזין בינוני 1 x 107 תאים/מ ל.... להוסיף TRITC-לתוספי 0.5 מ"ג/מ"ל, לנער-180 סל ד, 22 ° C.</li>
		<li>לדלל 0.8 מ לתוך 0.7 מ של KK כקרח2 -0, 30, 60, 90, 120 דקות לשטוף פעם ב- 1.5 מ של קרח KK2 מאגר23 צנטריפוגה benchtop, resuspend 1 מ ל מאגר באותו ודוגמאות לאחסן בקירור. הערה: לרחוץ באופן מיידי או לאחר שנאסף כל דוגמאות מניב תוצאות שוות ערך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קבע את עוצמת הקול של נוזל על ידי התאים.
	<ol>
<li>להגדיר את fluorimeter כדי למדוד קרינה פלואורסצנטית באמצעות אורך גל של עירור של גל nm ו פליטה 544 של 574 nm עם חתך nm 10. להגדיר סדרת דילול TRITC-לתוספי ולהשתמש בו כדי למדוד את קרינה פלואורסצנטית כי נתנו נפחי לתוספי. ליצור עקומת כיול.</li>
		<li>למדוד את זריחה על ידי התאים בסעיף 2.1 באמצעות 0.9 מ של התליה תא. חישוב הנפח של נוזלים הפנימו בכל תא באמצעות עקומת כיול24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לדלל את שאר התאים של כל נקודת זמן בנפרד לתוך 0.5 mL קרח קר KK2. לסנן דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינורות cytometry זרימה פוליסטירן מ. להגדיר את cytometer זרימה כך תאים לכל נקודת זמן נפרדים אחד מהשני ולהקליט שלהם קרינה פלואורסצנטית (ראו סעיפים 3.4 ו- 3.5).</li>
	<li>למדוד את זריחה של כיול חרוזים ב cytometer זרימה באמצעות ההגדרות לעיל, להקליט אותו. שימו לב: זאת ההתייחסות עבור כל המדידות פלורסצנטיות בעתיד על cytometer זרימה: לפני השימוש שוב להפעיל את החרוזים והתאם את ההגדרות אז הם צריכים את קרינה פלואורסצנטית אותו. זה ייתן לשיא מוגדר צר מאוד. לשים שער סביב הפסגה פלורסצנטיות יכול לעשות את זה יותר קל.</li>
	<li>אני חוזר שלוש פעמים, להתוות את הנתונים פלורסצנטיות תא שהתקבלו בסעיפים 2.2 ו- 2.3 אחד נגד השני. להתוות קו של מיטבית ולהשתמש המשוואה להמיר הנתונים האיכותיים cytometry זרימה ליחידות כמותית.</li>
</ol>3. מדידת ספיגת נוזלים
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig1.jpg"> איור 1: סכימטי של מדידת תפוקה גבוהה macropinocytosis. (א) לגדול Dictyostelium בצלחת SM נזרע עם ק' aerogenes חיידקים (צהוב). קציר תאים מהחזית האכלה (כתום), הימנעות התאים כבר מפותחים (ירוק), לתוך 25 מ של KK2 מאגר. מערבולת מביצועם, גלולה על ידי צנטריפוגה 3 דקות ב x 300 גרם, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב 50 מ ל מאגר2 KK, השמטת את תגובת שיקוע בכל פעם. Resuspend עונה 1 פרק 105 תאים/מ במדיום הגידול HL5 ולהוסיף 50 µL לתוך משלוש בארות לדגימה של צלחת 96-ובכן בתחתית שטוח. דגירה ב 22 ° C עבור ה 24 (B) שתדללו TRITC-לתוספי 1 מ ג/מ במדיום הגידול HL5 פתרון מניות של 50 מ"ג/מ"ל. להוסיף 50 µL כל דגימה (למעט הבארות שליטה ספיגת דקות 0), דגירה ב 22 ° C 1 h, אחרי אשר מוסיף את לתוספי לפקד ספיגת דקות 0. (ג) decant מיד את המדיה, לטפוח על הלוחית טישו כדי להסיר עודפי בינוני ויציפו באמבט קר כקרח מאגר2 KK, מילוי הבארות לשטוף. Decant המאגר, ומייבשים שוב. להוסיף 100 µL של 5 מ מ אזיד הנתרן מומס KK2MC כדי לנתק את התאים. לקחת לזרום cytometer למדידת קרינה פלואורסצנטית למביטה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58434/58434fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol><li>
להגדיר את צלחת שהונעו 96-ובכן-תרביות רקמה (איור 1 א'). להשתמש בתאים הגדלים על חיידקים, להעביר אותם לתוך HL5 בינוני (המכיל 100 µg/mL של dihydrostreptomycin, 100 µg/mL אמפיצילין µg 50/mL kanamycin) 24 שעות לפני וזמינותו; זה מאפשר macropinocytosis להיות upregulated של רמות נמוכות ראיתי בתאים גדל על חיידקים24. לחלופין, לדלל תאים ישירות מן התרבות axenic, המקננת במשך 24 שעות לפני וזמינותו, כדי להפחית שגיאות בגלל התאים להיות מדולל של צפיפויות שונות.<ol>
<li>קציר תאים מהחזית הזנה לתוך 25 מ של KK2 בשפופרת צנטרפוגה 50 מ. מביצועם תאים על-ידי vortexing צנפה ב x 300 גרם למשך 3 דקות. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ולשטוף 3 פעמים ב x 300 גרם במשך 3 דקות ב- 50 מ של KK2, השמטת את תגובת שיקוע בכל פעם כדי להסיר את החיידקים.</li>
		<li>לקבוע את צפיפות התאים (באמצעות hemacytometer או הפלאפון האחר ספירת מערכת), לדלל לתוך HL5 המכיל אנטיביוטיקה עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל.... פיפטה 50 μL בכל טוב, באמצעות שלוש בארות עבור כל תנאי. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס במשך 24 ה זכור להגדיר פקד ספיגת דקות 0. הערה: חלופה בינונית, למשל SIH, VL6 ניתן להשתמש במקום זאת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לטעון תאים עם TRITC-לתוספי (איור 1B).
	<ol>
<li>לדלל את לתוספי כדי 1 מ"ג/מ"ל ב אופן השימוש (זה יכול להיות עלה ל 2.5 – 5 מ"ג/מ"ל כאשר הערכת תאים עם ספיגה נמוכה מאוד). להוסיף 50 μL בכל טוב (ויתור ריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל TRITC-לתוספי) ולהחזיר את הצלחת עד 22 מעלות צלסיוס לשעה זה מאפשר הצטברות לתוספי משמעותית אך אקסוציטוזה של לתוספי טרם החלה. הערה: פיפטה משחזר מאפשרת שלב זה צריך להיעשות במהירות רבה יותר, צמצום שגיאות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכינו את התאים עבור cytometry זרימה (איור 1C).
	<ol>
<li>מייד לפני כביסה, להוסיף 50 μL המכילים לתוספי מדיה הפקדים ספיגת דקות 0.</li>
		<li>Decant של המדיום, ומייבשים על טישו. לשטוף מאת השוקע את הצלחת KK כקרח2ולאחר מכן decant. הערה: עלולים להתנתק זנים מסוימים עם הדבקות פגמים במהלך שלב זה, למשל פצצה של שני homologs של Talin (טאלה-/ אתר פרסום -)25. שימוש באזהרה בעת עבודה עם שורות תאים לקוי צרף, תשאף מדיה במידת הצורך.</li>
		<li>להוסיף 100 μL של 5 מ מ קרה כקרח אזיד הנתרן מומס KK2MC (KK2 + 2 מ מ MgSO4 ו- 100 μM CaCl2). התראה: אזיד הנתרן הוא רעיל מאוד. השתמש מסיכת אבק בטיחות משקפיים כשאתה עובד עם האבקה. תמיד ללבוש כפפות, חלוק המעבדה. להימנע חום, לא לערבב עם חומצה. הערה: תאים לנתק במהירות, אקסוציטוזה מנעו24. מיקרוסקופ ניתן לבדוק את זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מדד ספיגת הנוזלים על ידי cytometry זרימה
	<ol>
<li>אם התכנון להמיר ערכי יחסית לאלה מוחלטת, השתמש חרוזים לתקנן את הזרימה cytometer הגדרות (ראה סעיף 2). לחלופין, השתמש תאים עמוסה לתוספי כמו סעיף 2 על מנת להבטיח פיזור קדימה ואת הצד פיזור מוגדרים כראוי כדי לבודד תאים (איור 2 א), המבטיח שהמכונה אינה חסומה, (איור 2B) ולהתאים את הפרמטרים כדי למדוד את קרינה פלואורסצנטית למביטה (איור 2C).</li>
		<li>הצמד דגימה תפוקה גבוהה מערכת והוסף את הצלחת. להגדיר את פרוטוקול כדי למדוד את קרינה פלואורסצנטית (עבור TRITC-לתוספי משתמשים בלייזר ירוק-צהוב כדי לרגש ולמדוד בערוץ nm 582 או דומה) של עד 65 μL של התא ההשעיה, ריצה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניתוח תוצאות cytometry זרימה
	<ol>
<li>שער על תאים באמצעות פיזור קדימה ופיזור צד (איור 2 א). לחשב את קרינה פלואורסצנטית החציוני של התאים באמצעות האפשרות ' סטטיסטיקה '. הגדר פרמטרים אלה באמצעות דוגמא אחת ומוחלות על כל הדגימות. הערה: הפרופילים פיזור לצד פיזור קדימה יכול להשתנות בין מדגמים בעת שימוש מוטציות שונות או מעכבי.</li>
		<li>לקבוע הממוצע של הבארות שלושה עבור כל תנאי ולהחסיר את הפקד ספיגת דקות 0. גם להמיר לערכים כמותיים באמצעות המשוואה נקבע בסעיף 2 או לנרמל לפקד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ביצוע זמן ספיגת נוזלים-קורסים
<ol><li>להגדיר את התאים כמו בסעיף 3, עם שלוש בארות לכל נקודת זמן או מאמץ/תנאי.</li>
	<li>להוסיף בינוני עם תוויות ברורות לתוספי הבארות שונים ברצף. זמן-קורס טיפוסי מודד את ספיגת הנוזלים 0, 30, 60, 90, 120, 180 דקות להוסיף לתוספי המכילות בינוני וולס נקודת זמן 180 דקות, אחרי 60 דקות מאוחר יותר על-ידי הוספתו לפקודה הבארות עבור נקודת זמן מינימום 120, וכדומה (איור 3 א).</li>
	<li>ב 0 דקה, להוסיף 50 μL של לתוספי המכילות בינוני, מיד decant, לשטוף את הצלחת כמו סעיף 3.3. לנתח כמתואר בסעיף 3.5.</li>
</ol>5. במינון התגובה עקומות
<ol><li>הגדרת התאים כמתואר בסעיף 3, עם משלוש בארות לכל זן או תנאי.</li>
	<li>לדלל את המתחם עניין לתוך בינוני המכיל 1 מ"ג/מ"ל לתוספי- כפול הרצוי המרבי הסופי הריכוז של המתחם. הכן צינור השני המכיל בינוני עם לתוספי עם הפרופורציה של הרכב כמו הראשון. מערבולת לערבב.</li>
	<li>ליצור סדרה דילול של המתחם עניין ב- 200 μL לתוספי המכילות בינוני לכל דגימה (איור 4A). מערבולת לערבב. להוסיף 50 μL של המדיום כל מדגם טוב עבור 1 h.</li>
	<li>רוחצים את נתח כמתואר בסעיף 3.3 ואילך.</li>
</ol>6. phagocytosis ואת ספיגת ממברנה
<ol><li>כדי למדוד את ספיגת ממברנה, להכין את התאים כמתואר בסעיף 3. הוסף μL 50 בינוני המכיל FM μM 20 1-43 עבור ריכוז סופי של 10 μM. לאחר הטעינה, לשטוף ולהכין תאים עבור cytometry זרימה כמו סעיף 3.3. למדוד בתעלה 585 ננומטר או דומה, באמצעות לייזר כחול כדי לרגש. הערה: כמו קרום סחר היא מהירה יותר מאשר נוזל-פאזי, 10 דקות היא נקודת זמן מתאים יותר לשימוש מאשר 1 h26. צבעי חלופי לזרוח רק כאשר שולבו הקרום ניתן להשתמש במקום זאת.</li>
	<li>
להשתמש fluorescently שכותרתה חרוזים או חיידקים כדי למדוד phagocytosis. אין אפשרות להשתמש שמרים פלורסנט, כפי שהם באמת בלתי נפרד מן Dictyostelium על ידי העבר, לצד פיזור24. הגדרת התאים כמתואר בסעיף 3 ולנתח כמו שמתואר27.<ol>
<li>כדי למדוד phagocytosis של חרוזים להוסיף מתויג חרוזים כפי שמתואר בסעיף 3.2 כדי ריכוז הסופי של 5 x 107 חרוזים/mL (1.75 ו-2 μm) או עונה 1 פרק 108 חרוזים/mL (1 ל- 1.5 μm) עבור 1 h לפני שטיפה והכנת עבור cytometry זרימה כמו ירוק-צהוב סעיף 3.3. למדוד בערוץ nm 525 או דומה, באמצעות לייזר כחול כדי לרגש. הערה: ריכוז גבוה יוביל ניתוק התא.</li>
		<li>כדי למדוד phagocytosis של חיידקים, להוסיף שטקסס-אדום מתויג Escherichia coli bioparticles כפי שמתואר בסעיף 3.2 1 x 108 חיידקים/מ"ל לשעה לפני שטיפה והכנת עבור cytometry זרימה כמו סעיף 3.3. למדוד בתעלה 610 nm או דומה, באמצעות לייזר ירוק-צהוב כדי לרגש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bloomfield, G., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+and+abuses+of+macropinocytosis.">Uses and abuses of macropinocytosis.</a> Journal of Cell Science. 129 (14), 2697-2705 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocompatibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).</li><li>Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+typhimurium+encodes+an+activator+of+Rho+GTPases+that+induces+membrane+ruffling+and+nuclear+responses+in+host+cells.">S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells.</a> Cell. 93 (5), 815-826 (1998).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells.">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).</li><li>Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-phase+uptake+by+macropinocytosis+in+Dictyostelium.">Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium.</a> Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).</li><li>Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+ruffle+formation+and+closure+lead+to+macropinocytosis+in+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor-treated+cells.">Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells.</a> European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).</li><li>Buczynski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+two+Dictyostelium+discoideum+genes,+DdPIK1+and+DdPIK2,+encoding+proteins+related+to+mammalian+phosphatidylinositide+3-kinases,+results+in+defects+in+endocytosis,+lysosome+to+postlysosome+transport,+and+actin+cytoskeleton+organization.">Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization.</a> Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).</li><li>Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+the+completion+of+macropinocytosis+and+phagocytosis+by+macrophages.">A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).</li><li>Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+metabolism+during+membrane+ruffling+and+macropinosome+formation+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells.</a> Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).</li><li>Clark, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+uses+ether-linked+inositol+phospholipids+for+intracellular+signalling.">Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling.</a> The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).</li><li>Hoeller, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+functions+for+PI3-kinases+in+macropinocytosis.">Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis.</a> Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> Elife. 5, e20085 (2016).</li><li>West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+is+required+for+constitutive+macropinocytosis+by+dendritic+cells+but+does+not+control+its+downregulation.">Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation.</a> Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+fusion+and+microtubule-based+dynamics+in+the+early+endocytic+pathway+of+Dictyostelium.">Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium.</a> Traffic. 3, 791-800 (2002).</li><li>Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCL12-induced+macropinocytosis+modulates+two+distinct+pathways+to+activate+mTORC1+in+macrophages.">CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).</li><li>Rivero, F., Maniak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+microscopic+methods+for+studying+the+endocytic+pathway.">Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway.</a> Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).</li><li>Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum+mutants+with+temperature-sensitive+defects+in+endocytosis.">Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis.</a> Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).</li><li>Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2015:+Expanding+data+and+annotations+in+a+new+software+environment.">dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment.</a> Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).</li><li>Williams, T. D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+macropinocytosis+during+Dictyostelium+growth+and+development.">The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Tsujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+functions+of+the+two+talin+homologues+in+Dictyostelium.">Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium.</a> Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).</li><li>Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulation+of+the+plasma+membrane+in+Dictyostelium.">Circulation of the plasma membrane in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 4419-4427 (1999).</li><li>Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+phagocytosis+and+phagosome+maturation.">Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).</li><li>Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Dictyostelium+RasGEF+is+required+for+normal+endocytosis,+cell+motility+and+multicellular+development.">A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development.</a> Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).</li><li>Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mroh1,+a+lysosomal+regulator+localized+by+WASH-generated+actin.">Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin.</a> Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).</li><li>van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+cells+with+a+depolarized+plasma+membrane+potential.">Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential.</a> Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).</li><li>Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+myosin+I+double+mutants+exhibit+conditional+defects+in+pinocytosis.">Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+uses+macropinocytosis+and+apoptotic+mimicry+to+enter+host+cells.">Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells.</a> Science. 320 (5875), 531-535 (2008).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).</li><li>Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+stop+shop+for+everything+Dictyostelium:+dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center+in+2012.">One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

בעוד שיטות אחרות כדי להעריך את ספיגת הנוזלים תפוקה נמוכה, לשטוף את התאים בחיי עיר ושימוש של אזיד הנתרן להתנתק תאים הן לשלבים הקריטיים בשיטה זו, אשר מאפשרים מדידה תפוקה גבוהה של macropinocytosis, ספיגת קרום, או phagocytosis על-ידי Dictyostelium. כמו התאים מחוברים משטח, המדיום אינו, הם יכולים להיות נשאר מחובר ואילו המדיום סביבם קודם שיעיפו ואז השתנה על ידי טבילה במאגר ו שיעיפו שוב. אזיד הנתרן, אשר מכלה ATP הסלולר, depolarizes את קרום30, משמש לאחר מכן לנתק את התאים, גם מונע אקסוציטוזה מבלי להשפיע על התאים הכדאיות24.
בזמן השימוש cytometry זרימה כדי למדוד את macropinocytosis על ידי Dictyostelium מעניק מדידות מדויקות מאוד של ספיגת נוזלים במהירות רבה, כדי לקבוע את הסיבה מדוע זן מסוים או מצב של שינה ספיגת נוזלים, לקדם באמצעות חקירה מיקרוסקופ הוא נדרש24. יש גם לציין כי התוצאות שפורסמו בעבר, במקרים מסוימים, הראו הבדל ספיגת הנוזלים על ידי מוטציה זנים גדל גם על משטח (כמו במקרה זה), או לוחצים ההשעיה (כמו הפרוטוקול הסטנדרטי)31. בשיטה זו פירושה כי, במקרים נדירים, ספיגת נוזלים לכאורה פגמים הם החמיצו. בנוסף, בעת מדידת phagocytosis, ניתן להשתמש רק ריכוזים נמוכים של חלקיקים. הקצב המרבי של phagocytosis זה יכול להיקבע בטכניקה זו הוא הרבה מתחת מרבי אמיתי, למרות שזה עדיין אפשרי למדוד הבדלים רלוונטיים phagocytosis בין זנים ותנאים24. כדי לקבוע את השיעור המרבי של phagocytosis, ספיגת חייב להימדד לוחצים השעיה פרוטוקול חלופי27. התאים יש phagocytosed חרוזים הגדילו פיזור בצד, אז זה אמור להיפתר עבור בהתאם בעת הגדרת את cytometer זרימה.
Cytometry זרימה יכול לשמש כדי למדוד את ספיגת הנוזלים ב תאים בתרבית של32, אולם שיעור גבוה יותר של נוזל שלב ספיגת על ידי מסלולים endocytic אחרים מאשר אצל Dictyostelium היא דאגה. בנוסף, תאים בדרך כלל מנותקים באמצעות טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס, המאפשר יותר התקדמות endocytic של לתוספי למביטה. אזיד הנתרן כקרח אינו גורם מקרופאגים לנתק ממשטח (וויליאמס, שלא פורסמו תצפיות), ביצוע הטכניקה הזו לא תקפה בתרבית של תאים ללא נוספים מיטוב.
מדידת תפוקה גבוהה macropinocytosis יש פוטנציאל לשמש מסך במהירות ובזול על ההשפעות של מעכבי, מוטציה גנטית או גנים בתאי Dictyostelium . מוטציות צריך תמיד להשוותו הוריהם ישיר בלבד. אם הקורא אין העדפה מוקדמת לזן Dictyostelium , זנים שאינם axenic כגון DdB או NC4 יותר "פראי-סוג" מאשר אלו axenic, ניתן לטפל בצורה יעילה כמו זנים axenic33. אחרת, Ax2 זנים הם axenic זנים עם המצומצמות הגנום כפילויות34, בעוד זנים רבים של Ax4 Talin A הסתרה, צריך להיות להימנע במידת האפשר23. ניתן להזמין ביותר שפורסמו בעבר זנים Dicty מניות מרכז35.
טכניקה זו מאפשרת אפשרויות חקירה גדול יותר משהיה אפשרי לתוך ההשפעות של תנאים שונים, מעכבי מוטציות ב- macropinocytosis על ידי Dictyostelium.

בקנה מידה גדול ספיגת נוזלים שאינם ספציפיים על-ידי macropinocytosis חשוב בהקשרים ביולוגיים מספר1, כולל אנטיגן דגימה על-ידי החיסון תאים2, פתוגן כניסתו לתאים מארח3, סרטן התא התפשטות4 ו הפצת מחלות פריון5. מידע יונקים, תאים Dictyostelium , פאי אקטין6,7,9,8,P3 (3,4,5)10 (למרות טיב השומנים שונה בין שני11), מופעל ראס12,13ו-14,Rac מופעל15 חשובים עבור יעילות ספיגת הנוזלים על ידי macropinocytosis, למרות נותרו שאלות רבות ללא מענה על איך הוא התיקון macropinocytic נוצרו, מאורגן, למביטה בסופו של דבר. גילוי חלבונים יותר חשוב macropinocytosis ונחישות עוקבות של מה הם חשובים בהקשרים ביולוגיים שונים, לתת הבנה מקיפה יותר של macropinocytosis, העלול לאפשר התפתחות טיפולים יישוב למגוון רחב של מצבים.
Dictyostelium היא מערכת מודל אידיאלי ללמוד macropinocytosis. רמה גבוהה של macropinocytosis המכונן ב מעבדה סטנדרטיים זנים אומר שאת ספיגת הנוזלים הוא מעל 90% בשל macropinocytosis6. זה מאפשר macropinocytosis נמדד אך ורק על פי קביעת ספיגת נוזלים, בניגוד בתרבית של תאים כאשר שיעור ספיגת נוזלים עקב macropinocytosis הוא נמוך בהרבה. Macropinocytosis כל כך מוגדרת היטב, דמיינו בקלות12 במערכת זו דומה מציע יתרונות ברורים על חקירת ליבה שנשמרת מרכיבי macropinosome על פני מערכות אחרות שבהן עשוי להיות מספר אותות התקינה 16 , 17.
הטכניקה תקן המשמש למדידת macropinocytosis על ידי תאים בתרבית של כרוך בתיקון תאים לאחר הפועמים עם לתוספי לתקופה קצרה של זמן ואחריו מיקרוסקופ כדי לקבוע את האזור של תא מאוכלס על ידי לתוספי-חיוביות שלפוחית18. טכניקה זו אינו חשבון אולם לאפשרות של macropinosomes מתכווץ עם כניסתו התא, אשר דווחה Dictyostelium19, והיא רק לוקחת בחשבון מטוסים יחיד של התא, כלומר אמצעי האחסון הפנימו לא ברור. טכניקה חלופית, של ספירת מספר macropinosomes הפנימו בזמן נתון, יש חסרונות אותם20. השימוש Dictyostelium מונע בעיות אלה; עם זאת, קיימות טכניקות למדידת ספיגת הנוזלים על ידי Dictyostelium הם יחסית עמל רב, שימוש גדול כמות התאים והן לתוספי21. תאים שיש לחיצות על צפיפות גבוהה ב לתוספי פלורסנט ודוגמאות הוסר בנקודות שונות בזמן-לקביעת למביטה ידי קרינה פלואורסצנטית באמצעות fluorimeter. ניתן לנתח תאים שהוכנו בדרך זו על ידי cytometry זרימה כדי לזכות תא בודד, יותר מאשר האוכלוסייה ברמת, רזולוציה22, למרות שזה ישאר תפוקה נמוכה.
כאן, טכניקה סטנדרטית למדידת נוזלים למביטה באמצעות לתוספי פלורסנט כתווית הוא להתאים לתבנית צלחת 96-ובכן, עם הדגימות נותחו על ידי cytometry זרימה באמצעות קובץ מצורף תפוקה גבוהה דגימה (HTS). תאים ניזונים לתוספי פלורסנט-quenchable עבור אורך זמן, נשטף על ידי טבילה במאגר קר כקרח, מנותק תוך שימוש אזיד הנתרן 5 מ מ, אשר גם עוצר אקסוציטוזה שנקבע מראש. התאים היטב כל מנותחות ואז על ידי cytometry זרימה. שיטה זו נועדה להתגבר על המגבלות של השיטות שהוזכרו לעיל, לאפשר השוואה סימולטני של ספיגת הנוזלים של מספר גדול של זנים/תנאים תוך שימוש בפחות משאבים והקטנת העבודה מעורב.

<table><tbody><tr><td>LSR_II flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td>Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD</td></tr><tr><td>TRITC-dextran (155 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287</td><td>Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine</td></tr><tr><td>HL5 medium</td><td>Formedium</td><td>HLGCFG</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work</td></tr><tr><td>Dihydrostreptomycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1517</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium</td><td>Formdium</td><td>AMP50</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin monosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>VWR</td><td>103694M</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate hydrate</td><td>VWR</td><td>25169.295</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>VWR</td><td>1.02382.0250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phopshate</td><td>VWR</td><td>1.04877.1000</td><td></td></tr><tr><td>Di-potassium hydrogen phosphate</td><td>VWR</td><td>1.05104.1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>Perkin-Elmer</td><td>LS 50 B</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Thermofisher</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>09719-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>17687-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>09847-5</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; bioparticles</td><td>Thermofisher</td><td>E2863</td><td></td></tr><tr><td>Flow-set fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607007</td><td>Calibration Beads</td></tr><tr><td>SM agar</td><td>Formedium</td><td>SMACFG</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Elkay Laboratory Products</td><td>E25-PS22-50S</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom polystyrene tubes</td><td>Corning</td><td>352058</td><td>Use a tube that will fit onto your flow cytometer.</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Repeating pipette</td><td>Eppendorf</td><td>M4-SK</td><td></td></tr><tr><td>5 mL repeating pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>30089650</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LY294002</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>70920</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404-2MG</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry

בקנה מידה גדול ספיגת נוזלים שאינם ספציפיים על-ידי macropinocytosis חשוב ההתפשטות של תאים סרטניים מסוימים, אנטיגן דגימה, הפלישה התא המארח ואת ההתפשטות של מחלות ניווניות. זני מעבדה נפוץ אמבה Dictyostelium discoideum יש שיעור ספיגת נוזלים גבוהה מאוד כאשר גדל מזין בינוני, מעל 90% מהם נובע macropinocytosis. בנוסף, רבים של רכיבי ליבה ידוע macropinocytosis בתרבית של נוכחות גם הן, שהופך אותו מערכת מודל מצויין ללמוד macropinocytosis. כאן, טכניקה סטנדרטית למדידת נוזלים למביטה באמצעות לתוספי פלורסנט כתווית הוא להתאים לתבנית צלחת 96-ובכן, עם הדגימות נותחו על ידי cytometry זרימה באמצעות קובץ מצורף תפוקה גבוהה דגימה (HTS).
תאים ניזונים לתוספי פלורסנט-quenchable עבור אורך זמן, נשטף על ידי טבילה במאגר קר כקרח, מנותק תוך שימוש אזיד הנתרן 5 מ מ, אשר גם עוצר אקסוציטוזה שנקבע מראש. התאים היטב כל מנותחות ואז על ידי cytometry זרימה. השיטה גם ניתן להתאים כדי למדוד את ספיגת ממברנה של phagocytosis של חרוזים פלורסנט או חיידקים.
שיטה זו נועדה לאפשר מדידה של ספיגת הנוזלים על ידי Dictyostelium תפוקה גבוהה, דיני עבודה, משאבים באופן יעיל. היא מאפשרת השוואה בו זמנית של מספר זנים (למשל knockout מוטציות של גנים) ותנאים (למשל תאי מדיה שונים או מטופלים עם ריכוזים שונים של מעכב) במקביל ומפשט את הזמן-קורסים.

פעם הטכניקה בוצעה תאים הם עמוסה לתוספי ומוכן לניתוח (איור 1), להבטיח שזרימת cytometer אינה חסומה ולהתאים את הפרופיל פיזור לצד פיזור לפנים להיראות כמו התאים שמוצג באיור 2A. אם המכונה חסומה, זה ייראה יותר ככה באיור איור 2B , בטח החסימה לפני שתמשיך. להבטיח הפרמטרים להראות שליטה axenic תאים גבוהה לתוספי למביטה פלורסצנטיות בנקודות זמן ארוך יותר ויש קרינה פלואורסצנטית למביטה נמוך-אלה שורטר (איור 2C).
כאשר מחפשים הבדלים בין מוטנטים, סביר להניח כי יהיו אחד שלושה פנוטיפים. המוטציות יכול להיות נורמלי ספיגת נוזלים, להם פגם חלקית או ספיגת נוזלים יכול לבטל לחלוטין. איור דו-ממדי מראה על המתח עם ספיגת נוזלים נורמלית, במקרה זה המתח מעבדה סטנדרטיים Ax2, מוטציה עם ~ 50% להקטין את ספיגת הנוזלים (Ax2 rasG-14) וביטלה אחד עם ספיגת נוזלים (Ax3 gefB-28). להשיג את (סעיף 3.5) ממוצע חציון ספיגת נוזלים ולהשתמש בו כדי לחשב את עוצמת הקול של נוזל הפנימו (כמו דמות 3B) או להשוות את הנתונים לפקד (כמו דמות 4B ו- 4 C).
בעת ביצוע קורס זמן ספיגת נוזלים, כמו באיור 3A, ידי קרינה פלואורסצנטית למביטה צריך להגדיל 60-90 דקות, לאחר מכן לתוספי מתחיל להיות exocytosed, מישור זה להגיע (איור 3B). באמצעות 60 דקות כמו נקודת השעה הרגילה כאשר משווים macropinocytosis בתנאים/מוטציות שונות ולכן מאפשר קליטה טובה להיות מושגת, אין קליטה אובדת עקב אקסוציטוזה. מוטציות איפה אקסוציטוזה קשות נחסמת עשויה להימשך זמן רב כדי להגיע אל הרמה של29.
כאשר מתייחסים תאים עם מעכבי יעילים נגד macropinocytosis ב Dictyostelium (להקים כמו איור 4A), את לתוספי הפנימו ב 1 h יהיה ללכת למטה כמעט שום בריכוזים גבוהים מעכב ברוב המכריע של המקרים (איור 4B). כמה מעכבי לא יכול להיות יעיל ב-100 אחוז, לעומת זאת, למשל nocodazole מעכב רק עד 50% של ספיגת הנוזלים על ידי macropinocytosis בעת הוספת בחריפות (איור 4C). אם מעכבי אינם יעילים, התאים להפנים כמות דומה של לתוספי של הפקד, ירידה ברמת קרינה פלואורסצנטית לא ישודר. טכניקה זו מאפשרת מגוון גדול של מעכבי שונים, ריכוזי המדכא שיוקרנו השפעות על ספיגת הנוזלים על ידי macropinocytosis במהירות רבה, צמצום הזמן בילה ייעול הטיפול מעכב.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig2.jpg"> איור 2: הגדר של זרימת נתונים cytometer ונציג. (א) פיזור קדמי (FSC) ואת הצד פרופילים פיזור (האס) של תאים יש להגדירו כך התאים ניתן להבחין בקלות. דוגמה של איך צריך להיראות Ax2 התאים מוצג. (B) אם cytometer זרימה חסומה, כמו בדוגמה זו, התאים יש פיזור בצד נמוך מאוד. הלייזר לא יעוררו את fluorophores כראוי, המכונה החסימה לפני שתמשיך. צריך להיות מושלך נתונים שהושגו בעוד המכונה היה חסום. (ג) ידי קרינה פלואורסצנטית להגדיר כך מדגם ספיגת דקות 0 יש קרינה פלואורסצנטית נמוכה, אשר מגדילה כאשר יש כבר מתפשט תאים עבור יותר במדיום פלורסנט, כפי שמוצג בדוגמה זו שנלקחו וויליאמס & קיי 201824. (ד) דוגמאות של תאים יש כבר מתפשט עם TRITC לתוספי עבור h 1 עם macropinocytosis רגיל (Ax2, ירוק), מופחת macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM172614, כתום) וביטלה macropinocytosis (Ax3 gefB -, HM177628, כחול). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58434/58434fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig3.jpg"> איור 3: ביצוע זמן ספיגת נוזלים-קורסים ב 96-ובכן צלחות. (א) לתוספי צריכים להתווסף לכל קבוצה של דגימות ברצף, עם סיום באותו הזמן. אז תרחץ הבארות, לנתק, למדוד את קרינה פלואורסצנטית למביטה על ידי cytometry זרימה. דוגמה פעמים כדי להוסיף את לתוספי מוצגים כאן. (B) כמובן זמן ספיגת הנוזלים של תאים Ax2 הופיעה 96-ובכן צלחות. שנלקחו וויליאמס & קיי 201824, קווי שגיאה הצג השגיאה הסטנדרטית של 3 ניסויים עצמאית. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58434/58434fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig4.jpg"> איור 4: ספיגת נוזלים במינון התגובה עקומות. (א) להוסיף את המתחם של עניין, זה התיק PI3K מעכב LY294002, HL5 המכיל 1 מ"ג/מ"ל TRITC-לתוספי- זוגי הריכוז המרבי הסופי הרצוי. מערבבים עם מדיום הגידול HL5 + 1 מ"ג/מ"ל לתוספי המכיל את הרכב לבד בפרופורציות שונות כדי ליצור סדרת דילול בינוני 200 µL לכל תנאי. להוסיף בארות כרגיל לשעה לפני שטיפה ומדידת למביטה זריחה. (B) ספיגת נוזלים במינון עקומת בתגובה עבור תאים Ax2 מודגרות עם המדיום המכיל LY294002 מ- A. הותאם ויליאמס אנד קיי 201824. ספיגת נוזלים מנורמל לפקד שאינו מטופל. קווי שגיאה הצג השגיאה הסטנדרטית של 3 ניסויים עצמאית. (ג) ספיגת נוזלים במינון עקומת בתגובה עבור תאים Ax2 מודגרות עם nocodazole. הותאם ויליאמס אנד קיי 201824. ספיגת נוזלים מנורמל לפקד שאינו מטופל. קווי שגיאה הצג השגיאה הסטנדרטית של 3 ניסויים עצמאית. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58434/58434fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry at JoVE.com

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, בקנה מידה גדול ספיגת הנוזלים של שאינם ספציפיים, חשוב בתחומים רבים של ביולוגיה קליני כולל אימונולוגיה, זיהום, סרטן ומחלות ניווניות. . הנה, קיימות טכניקות הותאמו כדי לאפשר רזולוציה תפוקה גבוהה, תא בודד מדידה של macropinocytosis macropinocytosis דגם האורגניזם Dictyostelium discoideum באמצעות flow cytometry.

מדידת תפוקה גבוהה Dictyostelium discoideum Macropinocytosis על ידי Cytometry זרימה

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

high-throughput-measurement-dictyostelium-discoideum-macropinocytosis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

7.7K Views.  MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK. Macropinocytosis, בקנה מידה גדול ספיגת הנוזלים של שאינם ספציפיים, חשוב בתחומים רבים של ביולוגיה קליני כולל אימונולוגיה, זיהום, סרטן ומחלות ניווניות. . הנה, קיימות טכניקות הותאמו כדי לאפשר רזולוציה תפוקה גבוהה, תא בודד מדידה של macropinocytosis macropinocytosis דגם האורגניזם Dictyostelium dis...

Video: High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Immunology and Infection

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells maintain organismal homeostasis and immunity. Simultaneously, and in contrast to its homeostatic role, it can also drive various pathologies, including cancer and viral infections. Unlike other modes of endocytosis, the tools developed for studying the maturation of macropinosomes remain underdeveloped. Here the protocol describes newly developed tools for studying the redox environment within the lumen of early and maturing macropinosomes. Methodologies for using ratiometric fluorescence microscopy in assessing the pH, production of reactive oxygen species, and the degradative capacity within the lumen of individual macropinosomes in live cells are described. Single organelle measurements offer the advantage of revealing spatiotemporal heterogeneity, which is often lost with population-based approaches. Emphasis is placed on the basic principles of dual fluorophore ratiometric microscopy, including probe selection, instrumentation, calibration, and single-cell versus population-based methods.

We describe protocols for measuring pH, oxidative events, and protein digestion in individual macropinosomes in live cells. An emphasis is placed on dual-fluorophore ratiometric microscopy and the advantages it offers over population-based techniques.

מדידת ה-pH, הכימיות האדומות והיכולת המשפילה של מקרופאינוזום באמצעות מיקרוסקופיה רציומטרית דו-פלואורופור

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Neuroscience

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

בדיקות מבוססות ציטומטריה של זרימה עבור בליעה מיקרוגליאלית של חומרים סינפטיים

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

מחבר זרקור: קידום הבנה באמצעות חידושים טכנולוגיים בפסיכונוירואימונולוגיה

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Quantitative Assessment of Macropinocytosis in mTORC1-Hyperactive Cells using Flow Cytometry

Macropinocytosis is a highly conserved, actin-dependent endocytic process that allows the uptake of extracellular material, including proteins and lipids. In proliferating cells, macropinocytosis can deliver extracellular nutrients to the lysosome, processed into critical macromolecule building blocks. Recent studies have highlighted the dependence of multiple cancers on macropinocytosis, including breast, colorectal and pancreatic cancer. Ras mutations are thought to be the driver events behind macropinocytosis initiation, leading to the activation of cellular anabolic processes via the mTORC1 signaling pathway. Interestingly, mTORC1 can also be activated by macropinocytosis independently of Ras. Therefore, macropinocytosis represents a metabolic vulnerability that can be leveraged to target macropinocytic tumors by limiting their access to nutrients therapeutically.
In Tuberous Sclerosis Complex (TSC) and Lymphangioleiomyomatosis (LAM), mTORC1-hyperactivation leads to enhanced macropinocytosis and metabolic reprogramming. Here, we describe a flow cytometry-based protocol to assess macropinocytosis in mammalian cells quantitatively. TSC2-deficient MEFs are employed, which exhibit aberrant activation of mTORC1 and have been shown to have increased macropinocytosis compared to TSC2-expressing cells. Cells treated with pharmacologic inhibitors of macropinocytosis are incubated with fluorescently labeled, lysine-fixable, 70 kDa dextran, or fluorescently labeled bovine serum albumin (BSA) assayed by flow cytometry. To date, robust image-based techniques have been developed to quantitatively assess macropinocytosis in tumor cells in vitro and in vivo. This analysis provides a quantitative assessment of macropinocytosis in multiple experimental conditions and complements existing image-based techniques.

This protocol provides experimental tools to evaluate macropinocytic uptake of nutrients (carbohydrate and protein) by mTORC1-hyperactive cells. Detailed steps to quantify the uptake of fluorescently labeled dextran and bovine serum albumin (BSA) are described.

Macropinocytosis is a highly conserved, actin-dependent endocytic process that allows the uptake of extracellular material, including proteins and lipids. ...

מדידת תפוקה גבוהה Dictyostelium discoideum Macropinocytosis על ידי Cytometry זרימה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

מדידת ה-pH, הכימיות האדומות והיכולת המשפילה של מקרופאינוזום באמצעות מיקרוסקופיה רציומטרית דו-פלואורופור

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

Quantitative Assessment of Macropinocytosis in mTORC1-Hyperactive Cells using Flow Cytometry