עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק R35 GM118177 PND.

<ol>
	<li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+chemotaxis:+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility,+directional+sensing,+and+polarity.">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li><li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K,+cell+polarity,+and+directional+cell+movement.">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. -. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li><li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells.">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li><li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis.">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li><li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients.">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li><li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt/PKB+during+aggregation.">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li><li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell's+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis.">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li><li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3,4,5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis.">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li><li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration.">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li><li>Nishikawa, M., H&#246;rning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis.">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li><li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization.">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li><li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system.">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).</li><li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves,+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization.">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li><li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility.">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).</li><li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration.">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li><li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+towards+a+paradigm:+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes.">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li><li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation.">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li><li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling.">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li><li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids,+EGF+receptors,+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field.">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li><li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate.">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li><li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks.">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li><li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants.">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li><li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA.">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP3-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chemotaxis+in+Dictyostelium.">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum.">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li><li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2/3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells.">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li><li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells.">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li><li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Akt/PKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium.">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li><li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations.">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטות המתוארות כאן מציעים דרך נוחה כדי להעריך את האוכלוסייה והן תא בודד התנהגות בתגובה להטיה זרימה. חשוב, ואילו מחקרים קודמים ניתח לוקליזציה של המוביל, משתרך סמני קצה במהלך ההעברה, הגישה הנוכחית מאפשרת חקירת תופעות מיידית על-ידי החלת זרימת הטיה בחריפות. בשיטה זו אנו הוכיח כי, למעשה, התגוב?...

ההעברה של התאים האיקריוטים מוטה על ידי רמזים כימיים מגוונים בסביבה, לרבות מעברי צבע של chemoattractants מסיסים או מאוגד המצע, נוקשות משתנה של מצעים, שדות חשמליים או הטיה זרימה. אמנם היו הרבה התקדמות בהבנתנו המנגנונים המולקולריים נהיגה כימוטקסיס, פחות ידוע על סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, כמה אותות אלה מגוונים משולבים ברמה התאית לייצר מאוחדת נודדות תגובה.
ביים ההעברה לכיוון הגדלת ריכוז chemoattractant כוללת שלושה מרכיבים התנהגותיים: תנועתיות כיוונית חישה, קטביות1. תנועתיות מתייחס לתנועה אקראית של תאים מושגת על ידי בליטה pseudopod. כיוונים חישה היא היכולת של תא כדי לזהות את מקור chemoattractant, אשר יכול להתרחש אפילו באופן מתאושש תאים. קוטביות מתייחס ההתפלגות סימטרית יציבה יותר של רכיבים תאיים בין המוביל לבין לקרטע קצה תא, מה שמוביל התמדה מוגברת בתנועה.
תגובה תאית chemoattractant תלוי הפעילות של ארבע רשתות בקרה רגולטריות שהוגדר מושגית: קולטן / גרם חלבון, אותות, שלד התא אקטין, קוטביות1. Chemoattractant מחייב לקולטן G-חלבון בשילוב משדר את האות דרך heterotrimeric גרם חלבונים α וβγ לרשת התמרה חושית האות במורד הזרם, אשר מגביר את האות כיוונית. משעולים מרובות בתוך הרשת התמרה חושית אות לפעול במקביל, להאכיל לתוך הרשת שלד התא אקטין פלמור אקטין הסטייה ולאחר חדירת pseudopod הסוגר, בכיוון של מעבר הצבע. חשוב סמביוזה כימוטקסיס נמנים GTPase בראס, TorC2, phosphoinositide 3-קינאז (PI3K) homolog פוספטאז ו- tensin (PTEN), guanylyl cyclase. מנגנוני משוב בתוך הרשת התמרה חושית אות ובין אותות לבין אקטין שלד התא רשתות נוספות להגביר את התגובה. בסופו של דבר, הרשת קוטביות מוגדרת היטב מקבל קלט שלד התא אקטין, בהמשך biases האות התמרה חושית הרשת כדי לקדם את ההעברה מתמיד בכיוון של מעבר הצבע.
הרבה הבנתנו מכניסטית כימוטקסיס התאפשרה בשל התפתחות מתויג fluorescently ביולוגיים עבור רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות. הרגולטורים כימוטקסיס רבים יש של התפלגות סימטרית של המולקולה הרגולציה עצמה או הפעילות שלה. לדוגמה, ביולוגיים מזהה הופעלה גרסאות GTPases ראס קטן ולא Rap1 – ראס מחייב תחומים של Raf1 (המכונה "rbd" כאן), RalGDS, בהתאמה – בתרגום כדי בחוד החנית של2,תא chemotaxing3. באופן דומה, PI3K ו phosphatidylinositol המוצר שלה (3,4,5)-טריפוספט (PIP3), המוכר על ידי תחום הומולוגיה (PH) pleckstrin, גם להראות לוקליזציה בחזית תא4,5. לעומת זאת, PTEN 3-פוספטאז, אשר ממירה PIP3 בחזרה אל phosphatidylinositol (4.5)-bisphosphate, רגישה לקצה לקרטע תא6. חשוב, ביולוגיים אלה לשנות שלהם לוקליזציה בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant. הקצה המוביל סמנים, אשר cytosolic או על קצות בליטות בתא resting, relocalize אל קליפת המוח, ואילו מפגרות סמני קצה, אשר לוקליזציה קורטיקלית נעדרים מכל קצות בליטות בתא resting, הופכים cytosolic לאחר גירוי. ניתוח של התפלגות ביוסנסור בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant ממזער את התרומה של תנועתיות, קוטביות, אשר פעמים רבות וחיסול התצפיות. גירוי גלובלי או אחיד של השעיה תא עם chemoattractant משמש גם ככלי להערכת שינויים ברמת האוכלוסייה בהפעלת חלבון, לעיתים קרובות זוהה על ידי חלבון זרחון7,8,9 . Assay הביוכימי זה משמש בעיקר כדי להשיג מידע זמני, ואילו מיקרוסקופ משמש לאיסוף מידע זמני והן מרחבי על התנהגותם של רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות.
התמרה חושית אות הרשת משלבת תכונות של מערכת טמפרמנט10,11. תגובות לגירויים chemotactic העל-סף "all-or-none", להציג תקופות עקשן. תגובות מופעלות גם stochastically, יכול להראות התנהגות מתנדנדות. האות התמרה חושית אירועים הם נקודתיים לאזורים של קליפת המופצות גלים12,13,14,15. קדימה או אחורה, סמני את הנישה, או מביצועם מתוך, האזורים הפעילים של הגלים כציוד. בשל האזור עקשן נגררים אזור פעיל, הגלים מכוון הפוך להשמיד כאשר הם נפגשים. הגלים התמרה חושית אות כציוד ביסוד בליטות הסלולר המתווכות תא העברה10.
חלק גדול מהמידע הנ על כימוטקסיס הופיע במחקרים אמבה חברתית Dictyostelium discoideum, למרות מנגנונים רגולטוריים דומים חלים גם נויטרופילים, אחרים בתרבית של תאים סוגים16 . Dictyostelium הוא אורגניזם מודל ומבוססת שיש תגובה chemotactic חזקים במהלך רעב, כאשר אלפי תאים בודדים נודדים לכיוון מרכז צבירה, בסופו של דבר יוצרים גוף fruiting multicellular המכיל נבגי. כימוטקסיס חיוני גם בשלב הצמיחה תא בודד של האורגניזם לאיתור מקורות המזון חיידקי. חשוב, נדידה של תאים בודדים Dictyostelium דומה להפליא ההעברה. בתרבית של נויטרופילים או תאי סרטן גרורתי, אשר כולם עוברים העברה מסוג amoeboid מהירה מאוד. למעשה, שני הטופולוגיה הכוללת של רשתות רגולטוריות, כמו גם רבים מן המסלולים התמרה חושית אות בודדת מעורב כימוטקסיס נשמרים בין Dictyostelium בתרבית של לויקוציטים17. יתר על כן, תאים אחרים, כגון fibroblasts, להשתמש קולטן טירוזין kinases (RTK) במקום GPCRs; עם זאת, RTKs עשויים להאכיל לתוך רשתות דומות.
בניגוד כימוטקסיס, הבנה מעמיקה של המנגנונים איתות כי הכונן מצבי שונים של הגירה מכוון לוקה בחסר. בדומה לתאים בהעברה של מעבר הדרגתי chemoattractant מספר מחקרים דיווחו על הפעלה ו/או לוקליזציה של סמנים הקצה המוביל טיפוסי, כולל פלמור אקטין, PIP3 ו/או חוץ-תאית מוסדר אות קינאז (טיפשה) 1/2, ב הקדמי של תאים שעברו ביים ההעברה בתגובה להטיה זרימה או שינוי שדות חשמליים18,19,20,21. עם זאת, במחקרים אלה חשיפה מתמשכת הגירוי הביאה גם נדידת תאים, להשאיר פתוחה את השאלה אם, לדוגמה, הסימונים הקצה המוביל לשפה במיוחד בתגובה לגירוי, או אם הם פשוט להתאים לשפה בחוד בשל עלייה במספר pseudopods בחזית תא נודדים.
פיתחנו מבחני ומאפשרים לנו להתבונן התגובה של התאים חריפה ההפרעות מכני נמסר הטיה זרימה הן ברמת האוכלוסייה וכן תאים בודדים22. דומה גירוי גלובלית עם chemoattractant, stimula חריפהtion בתזרים הטיה מאפשר חקר תגובה תאית גירוי מכני ללא התרומה מבלבלים תנועתיות או קוטביות. שילוב של מבחני הביוכימי, מיקרוסקופית אלו עם לפליטת גנטית או תרופתי מאפשר לנו ללמוד על גירויים מכניים איך נתפסים משודר. יתר על כן, גישה זו מספק גם שיטה עבור הקשה לתוך המערכת במורד הזרם של הקולטן chemoattractant בהיעדר chemoattractant, ובכך לבודד את האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות מ הקולטן/G רשת חלבון.
תוך שימוש בטכניקות המתוארות להלן אנו לאחרונה הפגינו שגזירה חריפה הזה מוביל הפעלה של רכיבים מרובים של chemotactic האות התמרה חושית ואני אקטין שלד התא רשתות22. על-ידי החלת את הגירוי המכני חריפה במרווחי זמן שונים, להדגים, באופן דומה כדי chemoattractants, תגובה לגירויים מכני מפגין גם תכונות של מערכת טמפרמנט, כולל ההתנהגות all-or-none של התגובה תחת קולח תנאים ואת נוכחותם של תקופה עקשן. בסופו של דבר, על ידי שילוב של גירוי מכאני וכימי הראינו כי שני הגירויים לשתף האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות, המאפשרים סביר לשילוב של גירויים מרובים כדי נדידת תאים הסטייה.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Proteose peptone</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td></tr><tr><td>Peptone (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Use to prepare caffeine (step 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>Use to prepare cAMP (step 1.6)</td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Use to prepare folic acid (step 1.7)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td></tr><tr><td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Polyvinylidene fluoride membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2060</td><td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)</td><td>Pierce</td><td>PI46430</td><td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>K. aerogenes strain (non-pathogenic)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Use to grow &lt;em&gt;K. aerogenes&lt;/em&gt; (step 2.1.1), and to basalate and stimulate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.</td></tr><tr><td>10 cm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>Use to count &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells (step 2.1.2)</td></tr><tr><td>35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Use to plate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt;cells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)</td></tr><tr><td>Polystyrene cup (5 mL)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>Use to stimulate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)</td></tr><tr><td>Fluidic unit with pump (ibidi Pump System)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>Use to deliver mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td></tr><tr><td>Slide with a channel (&amp;mu;-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>Use to plate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)</td></tr><tr><td>50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td></tr><tr><td>Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).</td></tr><tr><td>Line for the drain (1.6 mm ID tubing)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).</td></tr><tr><td>Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Used to image &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)</td></tr><tr><td>UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40&amp;times;/1.25&amp;ndash;0.75 oil objective (or a comparable alternative)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>An alternative used to image &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells (step 4.1.4)</td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D and 5192000027</td><td>Use to deliver mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).</td></tr><tr><td>Micropipette (Femtotip; 1 &amp;mu;m outside diameter, 0.5 &amp;mu;m inside diameter )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>Use to deliver mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells by a micropipette (step 4.3)</td></tr><tr><td>Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)</td></tr><tr><td>1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Use to plate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)</td></tr><tr><td>8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Use to plate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td><td>Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)</td></tr><tr><td>Migration analysis software (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td><td>Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)</td></tr></tbody></table>

assessment of dictyostelium discoideum response to acute mechanical stimulation

כימוטקסיס, או העברה את הדרגה של chemoattractant, הוא מצב הבין בצורה הטובה ביותר של ההעברה מכוונת. מחקרים באמצעות אמבה חברתית Dictyostelium discoideum גילה כי מורכבות האות התמרה חושית רשת של מסלולים מקבילים מגביר את התגובה chemoattractants, מוביל פלמור אקטין משוחד בליטה של פסאודופוד ב הכיוון של מעבר צבע. לעומת זאת, המנגנונים המולקולריים נהיגה סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, לדוגמה, עקב חשיפה להטיית זרימה או שדות חשמליים, לא ידועים. הרגולטורים רבים כימוטקסיס התערוכה לוקליזציה המובילים או לקרטע קצה תא נודדים, כמו גם להציג שינויים חולף לוקליזציה או הפעלת בעקבות גירוי גלובלית עם chemoattractant. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של סוגים אחרים של ההעברה מכוונת פיתחנו שיטה המאפשרת בחינת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני המבוסס על חשיפה קצר (2-5 s) להטיית זרימה. יכול להיות מועברת לגירוי הזה בערוץ תוך הדמיה תאים המבטאים שכותרתו fluorescently ביולוגיים לבחון התנהגות תא בודד. בנוסף, האוכלוסייה התא יכול להיות מגורה צלחת, lysed, ו immunoblotted באמצעות נוגדנים לזהות גירסאות פעיל של חלבונים עניין. על ידי שילוב שני מבחני, ניתן לבחון מגוון רחב של מולקולות מופעל על ידי שינויים לוקליזציה subcellular ו/או זירחון. בשיטה זו אנו נקבע כי גירוי מכני חריפה מפעיל הפעלה של התמרה חושית האות chemotactic ורשתות שלד התא אקטין. היכולת לבחון תגובות תאית חריפה גירוי מכני חשוב להבנת האירועים ייזום הכרחי עבור גזירה זרימה-induced תנועתיות. גישה זו מספקת גם כלי לימוד chemotactic האות התמרה חושית הרשת ללא השפעת מבלבלים הקולטן chemoattractant.

זמני תגובה של הרגולטורים כימוטקסיס גירוי מכני חריפה
כדי להעריך את התגובה של תאי discoideum ד כדי גירוי מכני, תאים מצבור המוסמכים חסיד נחשפו דופק קצרה של זרימה הטיה. צבירת-כשיר ד discoideum תאים מפרישים מחנה, אשר יכול להיות חש על ידי תאים שכנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation at JoVE.com

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

assessment-dictyostelium-discoideum-response-to-acute-mechanical

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

6.9K Views.  SUNY Oswego. כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

Video: Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Genetics

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

מדידה של Allodynia משושים בדגם Murine של ערמונית קטריאלי

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Immunology and Infection

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

Neuroscience

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila larvae, customized metal nickel-titanium alloy (nitinol) filaments. These mechanical probes are similar to the von Frey filaments used in vertebrates to measure mechanical nociception. Here, we demonstrate how to make and calibrate these mechanical probes and how to generate a full behavioral dose-response from subthreshold (innocuous or non-noxious range) to suprathreshold (low to high noxious range) stimuli. To demonstrate the utility of the probes, we investigated tissue damage-induced hypersensitivity in Drosophila larvae. Mechanical allodynia (hypersensitivity to a normally innocuous mechanical stimulus) and hyperalgesia (exaggerated responsiveness to a noxious mechanical stimulus) have not yet been established in Drosophila larvae. Using mechanical probes that are normally innocuous or probes that typically elicit an aversive behavior, we found that Drosophila larvae develop mechanical hypersensitization (both allodynia and hyperalgesia) after tissue damage. Thus, the mechanical probes and assay that we illustrate here will likely be important tools to dissect the fundamental molecular/genetic mechanisms of mechanical hypersensitivity.

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

The goal of this protocol is to show how to perform an improved assay for mechanical nociception in Drosophila larvae. We use the assay here to demonstrate that mechanical hypersensitivity (allodynia and hyperalgesia) exists in Drosophila larvae.

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Behavior

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Medicine

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של<em&gt; Discoideum Dictyostelium</em&gt; באמצעות אגרגציה מבחנים

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video