שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת רקמות כלי הדם כגון ניטור הדינמיקה של צמיחת כלי הדם מהנדס שיפוץ במהלך התרבות לטווח ארוך. היתרון העיקרי של שימוש טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית, או OCT, היא כי היא זמינה, אסטרטגיה הדמיה בזמן אמת ולא הרסנית כדי לאפיין את התכונות המבניות ואת תהליך שיפוץ של כלי מהונדסים. הדגמת ההליך תהיה גם שאנגמין ליו, וונטאו מא, טכנאים מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל בהליך זה, לפברק את פיגום PGA כמתואר בפרוטוקול הטקסט לטבול פיגומים PGA בנתרן הידרוקסיד מול לליטר אחד במשך דקה אחת, כדי להתאים את המבנה spacial של הרשת. לאחר מכן, להשרות את הפיגומים במים ברמת תרבות רקמות שלוש פעמים במשך שתי דקות כל אחד. בכל פעם, בעדינות לטפוח לייבש את הפיגום עם נייר טישו.
לאחר מכן, לייבש את הפיגומים ברדס עם מפוח במשך שעה אחת. כדי להרכיב את bioreactor ואת y-צומת עבור הדמיה OCT, הראשון, להשרות את bioreactor גלילי זכוכית שפותחה עצמית, פיגומים PGA, צינור סיליקון, צינורות תואמי ביו, מחברים, בר ערבוב, וציוד להרכבה במיכל אתנול 95 אחוז במשך שעתיים. משוך את פיגום PGA דרך הזרועות הצדדיות של bioreactor מחובר לצד אחד עם מחבר, כמו גם לצד אחר עם צומת y המשמש כדי לספק את חוט מדריך OCT.
להרכיב פיגום PGA אחר בביורייקטור באותו אופן. התאימו את הפוליטטרה-שפעת לשפתיים הביו-ריאוקטוריות על ידי הידוקו בתפרים 4-0. שים את bioreactor במיכל האתנול שוב במשך שעה אחת לפני ייבוש אותו לילה במכסה המנוע עם מפוח על.
עכשיו, לבודד את עורק הטבור האנושי תאי שריר חלקים מעורקי טבור אנושיים על ידי טכניקות explant סטנדרטיות הגורם להצלת התאים לתוך פיגומים PGA, למנוע כל טפטוף של השעיית תא על החלק התחתון של bioreactor. כמו כן, לכסות את bioreactor עם מכסה פקק סיליקון בהקדם האפשרי לאחר ישיבה בתא כדי למנוע זיהום. הרחב ושמור על התאים במדיום צמיחת שרירים חלקה.
זרע את עורק הטבור האנושי חלק תאי שריר בריכוז של 5 מיליון תאים למיליליטר במדיום התרבות לעיל על פיגומים PGA. לאחר הצבת בר אדוני בביו-ריירקטור, כסו אותו במכסה פקק הסיליקון שיש לו צינור הזנה אחד ושלושה מקטעי צינורות קצרים שהוכנסו לחילופי גזים. חבר מסנני מיקרון PTFE 0.22 לכל צינור שינוי אוויר, והצמד כובע הפרין אחד לצינור ההזנה.
כווננו את בר הערבב במהירות ערבוב של 13 סיבובים לדקה. לאחר מכן, להרכיב את bioreactor זכוכית, מכסה פקק סיליקון, פיגום PGA לתוך מערכת התרבות. אפשר לתאים לדבוק במשך 45 דקות על ידי נטייה bioreactor כל 15 דקות עם עמדה שמאלה וי ימינה.
עכשיו, חבר את משאבת LOO-OH-YEE, שקית מלוחים עם אגירת פוספט, ונהג עם הצינורות תואמי הביולוגיה על מנת ליצור את מערכת שפע. פתח את הנהג כדי למלא את הצינורות עם PBS. מניחים את הביו-ריאקטור הכולל באינקובטור לח עם 5 אחוז CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.
מלאו את תא התרבות ב-450 מיליליטר של מדיום התרבות. לגדל את פיגומים זרעים תחת תרבות סטטית במשך שבוע אחד, שינוי מדיום התרבות כל שלושה עד ארבעה ימים על ידי שאפת מחצית המדיום הישן דרך צינור ההזנה ומילוי הכור עם כמות שוות ערך של מדיום תרבות טרי. כדי להכין את מערכת שפע עבור הדמיה OCT, משאבת נוזלים בשקית PBS להפיץ אותם דרך צינורות biocompatible ובחזרה לשקית.
פתח את כוחו של הנהג לווסת את הגדרת המשאבה עם תדירות של 60 פעימות לדקה ולחץ סיסטולי פלט של 120 מילימטרים של כספית. התאימו את הפרמטרים המכניים בהתאם לצרכים של תרבות כלי הדם להנדסת רקמות. לחץ על לחצן ההפעלה כדי לגרום למערכת שפע לפעול.
ספק את הסימולציה pulsatile לתקן לכלי הדם במשך שלושה שבועות על ידי לחיצה איטרטיבית על צינורות biocompatible לאחר שבוע של תרבות סטטית. השתמש במקור אור כדי להבטיח את הרזולוציה צירית של עשרה עד עשרים מיקרון ואת עומק התמונה של אחד עד שני מילימטרים כדי לזהות את המבנה של כלי הדם מהונדסים רקמות, או TEVBs, בהתבסס על תחום התדירות OCT מערכת הדמיה תוך וסקולרית. הפעל את מתג ההפעלה ופתח את תוכנת לכידת התמונה חבר את קטטר ההדמיה הסיבי האופטי למנוע הכונן ולבקר האופטי, עם פונקציית הנסיגה האוטומטית של הקטטר.
הגדר את הפרמטרים של קצב רכישת התמונה לעשר מסגרות לשנייה, עם מהירות נסיגה אוטומטית של עשרה מילימטרים לשנייה. עכשיו, חבר את קטטר ההדמיה לצומת y דרך כובע הפרין עם מחט 18 מד. מניחים את הקטטר לתוך צינור הסיליקון ולזהות את הידוק המבנה של רשת PGA לפני טעינת פיגום PGA על bioreactor.
עכשיו, שים את קצה הקטטר מעל אזור העניין. כוונן את התקן ההמשך ובדוק את איכות התמונה. לרכוש תמונות באחת, ארבע, שבע, עשר, 14, 17, 21, ו 28 ימים בתרבות עבור כל TEBV בודדים.
שמור תמונות אלה ברצף עם תצפית בזמן אמת של מיקרו-מבנה TEBV כולל מורפולוגיה של פני השטח, מבנה פנימי והרכב. חזור על המדידה שלוש פעמים כדי לקבל מדידה אמינה של כלי השיט המהונדסים בכל פעם. לכוד סדרה של תמונות לאורך כל הבדיקה באמצעות תוכנת לכידת התמונה.
כדי להשתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי למדוד את עובי הקיר של כלי הדם מהונדסים על ידי רקמות, בחר תחילה את התמונה שיש לנתח. לאחר מכן, לחץ על כלי המעקב כדי לזהות באופן אוטומטי את הצד הפנימי של כלי הדם מהונדס רקמות עם התוכנה ולשרטט באופן ידני את הצד החיצוני. דיאגרמה של עובי תופיע על המסך.
חזור על המדידה במשך חמש פעמים כדי לקבל מדידה אמינה של המבנים. שקול להשתמש בשני חוקרים עצמאיים המחויבים לקבלת מידע. פתח את מכסה פקק הסיליקון ממוקם מעל bioreactor כאשר התרבות היא סיימה, ולהשליך את מדיום התרבות.
שחררו את הפוליטטרה-שפעת מהשפתיים הביו-ריאה וחתכו את צינורות הסיליקון מהצד החיצוני של הפוליטטרה-שפעת עם מספריים. לקצור את TEBVs מן bioreactor, לחתוך אותם לחלקים לבדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים סריקה. משוך את צינור הסיליקון התומך, ותקן את החלקים עם פורמלדהיד כוח 4 אחוז.
בצע כתמים היסטולוגיים שגרתיים עם טריכרום של מעסה ואדום אדוני כדי לבחון את המורפולוגיה של קולגן ו PGA. כדי להעריך את התוכן PGA ורכיב קולגן, להתבונן דגימות היסטולוגיות עם כתמים אדומים אדוניים דרך מיקרוסקופ מקוטב. תמונות OCT מושווים עם ממצאים היסטופתולוגיים של טלוויזיות לאחר ארבעה שבועות של תרבות.
תמונת OCT מציגה מיקרו-מבנה קומפקטי ורכיבים ספציפיים בהשוואה להערכה היסטולוגית. מדיום התרבות, צינור הסיליקון, ה- TEBV ושבר ה- PGA נראים לעין. כתמי טריכרום של מאסון מדגימים סיבי קולגן המופצים בכיוון מסוים, יחד עם שרידי PGA בשכבת המדיה של כלי השיט המהונדסים.
כתמים אדומים של סיריוס חושפים שרידי PGA ורכיב קולגן באמצעות מיקרוסקופ מקוטב. מיקרוגרפים סריקה-אלקטרונים של כלי מהונדסים מדגימים מיקרו-מבנה קומפקטי. בינתיים, מודאליות הדמיה פנים-לשונית זו מאמצת ניטור לא הרסני וקל של טלוויזיות, כולל תהליך השיפוץ והמורפולוגיה החזותית בתרבות ארוכת שנים.
כפי שמוצג כאן, השיפוץ מתרחש מוקדם יותר והשינויים המורפולוגיים באים לידי ביטוי בצורה ברורה יותר בקבוצה הדינמית באמצעות השוואה של עובי TEBV. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת רקמת כלי הדם לחקור את תכונות המבנה ואת תהליך השיפוץ ארוך הטווח של כלי שיט מהונדסים. תצוגה ברורה של שרידים פולימריים על ידי מיקרוסקופיה מקוטבת בשילוב עם הדמיית OCT עשויה להיות שימושית להערכת השפלת פיגומים.
