אנחנו רוצים להודות ולדיסלאו Maier (BMG Labtech GmbH) בשל תמיכתו בהקמת בתסריט כתוב עצמית עבור הקורא צלחת. עבודה זו נתמכה על ידי האוסטרים "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) כדי PM (P24189) ואת התוכנית PhD "DK מולקולרית אנזימולוגיה" (W901) עד בערב.

1. עיצוב, הכנה, ומביע לאקס אופרון ב- Escherichia coli
הערה: ראה טבלה של חומרים למידע על קיטים מסחריים להשתמש בסעיף זה.
<ol><li>לצורך העברת את אופרון לאקס לתוך החיידק לבחור וקטור מחמד סטנדרטי עם הגבלה מתאימה לאתרים של עמידות לאנטיביוטיקה ג'ין עניין (למשל, pET28a; NcoI, XhoI, kanamycin).</li>
	<li>עיצוב השברים, חופפים תחל להרכבה גיבסון, המבוססת על רצף הדנ א של Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).</li>
	<li>להגדיר תגובה PCR סטנדרטי עם תחל את תוכנן, ה-DNA גנומי מבודד של Photobacterium mandapamensis 27561 כתבנית (ראה חומר משלים תחל ותנאים). הערה: בידוד של דנ א גנומי של המתח חיידקי המתאימים מגבירה יעילות ה-PCR.</li>
	<li>לטהר המוצר PCR דרך ספין עמודות טיהור.</li>
	<li>ביצוע של עיכול הגבלה של וקטור pET28a מבודדים עם NcoI ו XhoI ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.</li>
	<li>לטהר את הווקטור ליניארית, שברי PCR ויה agarose ג'ל אלקטרופורזה וטיהור ספין עמודות עוקבות.</li>
	<li>לקבוע את ריכוז הדנ א של כל שבר, הווקטור ליניארית, לחשב הכמויות של האופטימלית עבור ההרכבה על פי פרוטוקול20,21. הערה: היעילות של הרכבה תלוי פרגמנט הגודל והמספר, חייב להיות מותאם על פי היצרן פרוטוקול20,21.</li>
	<li>לאחר שילוב כל שברי המאגר בצינור PCR, דגירה התערובת ההרכבה במכונה PCR ב 50 מעלות לשעה.</li>
	<li>להפוך את המוצר וקטור שהורכב על פי פרוטוקולים סטנדרטיים טרנספורמציה עבור פלסמיד חיידקי e. coli הסתדרותי המתאים e. coli מערכת לשכפול פלסמיד תשואה גבוהה (למשל, e. coli TOP10 או XL-1).</li>
	<li>לבחור מושבות מן הצלחת השינוי פס על לוחיות הרישוי עבור בידוד של דנ א.</li>
	<li>לבודד דנ א פלסמיד לפי פרוטוקולים סטנדרטיים.</li>
	<li>כדי לוודא הרכבה נכונה של פלסמיד כולל כל חלקי, תחילה לבצע מושבה PCR על פי פרוטוקולים סטנדרטיים באמצעות תחל ספציפיים עבור כל קטע התאספו.</li>
	<li>בנוסף המושבה PCR ו agarose הבאים בג'ל, להכין כל כיווני ההרכבה המבודד עבור רצפי DNA לוודא הרכבה נכונה של רצפי דנ א נכונה.</li>
	<li>להפוך את פלסמיד מאומת על פי פרוטוקולים סטנדרטיים טרנספורמציה עבור פלסמיד חיידקי e. coli הסתדרותי המתאים e. coli מערכת לייצור חלבון תשואה גבוהה (e.g.,E-קולי BL21). הערה: להמשיך ישירות עם ביטוי בפרוטוקול להלן. לאחסון ארוך יותר, מומלץ הכנת מלאי גליצרול.</li>
</ol>2. הביטוי של זנים ששונה e. coli
<ol><li>להכין תרבות לילה (שוב) לביטוי על ידי חיסון של אמצעי אחסון המתאים של מדיום ליברות (למשל, 100 מ ל) עם המניה גליצרול בעבר מוכן של התאים e. coli BL21 הפך את פלסמיד שהורכב או ישירות צלחת טרנספורמציה. להוסיף 100 µL של kanamycin (50 מ"ג/מ"ל; גן עמידות לאנטיביוטיקה של pET28a), דגירה. סרטן שעומדים של 37 ° C ו 120 סל ד ב שייקר אינקובטור בן לילה.</li>
	<li>לחסן התרבות הביטוי העיקרי (למשל, 800 מיליליטר בינוני ליברות) עם 8 מ ל סרטן שעומדים ולהוסיף µL 800 של kanamycin (50 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>דגירה התרבות המרכזית ב 37 ° C ו 120 סל ד ב שייקר אינקובטור עד צפיפות התא מגיע עם יתר600 של 0.6 - 0.8 (כ- 2.5 שעות).</li>
	<li>לצמצם את הטמפרטורה הדגירה 28 ° C.</li>
	<li>זירוז ביטוי חלבונים על-ידי הוספת IPTG ריכוז סופי של 0.1 מ מ. הערה: מבחנים אמפיריים הראו כי ההפחתה של הטמפרטורה 28 ° C נתן עוצמת האור הגבוה ביותר.</li>
	<li>להתבונן תאים עד שהם מתחילים זוהר (כ ג 1). הערה: בהתאם למטרת הביטוי, התאים גדלים עד למחרת, נקצרים מכן, או התאים יכולים להיות כל הזמן רועד כל עוד הם דולקים (מקסימום 48 שעות). קציר את התאים ואת טיהור של כל החלבונים יכול להיעשות על-פי נהלי.</li>
</ol>3. הבעה של זני חיידקים זוהרים
הערה: זני חיידקים זוהרים לדרוש צמיחה ספציפיים בינוני/מלאכותי ים מים בינונית עבור גידול והפקה אור.
<ol><li>להכין בינוני מים ים מלאכותי, מורכב משני הרכיבים בינוני מוכן בנפרד. הערה: הכנת המדיום מים ים מלאכותי הותאמה מן הפרוטוקול המקורי22. הסיכומים שלהלן מיועדות בינוני נוזלי 1 ליטר או 1 ליטר אגר בינוני.<ol>
<li>ים מלאכותי מים בינוני, שוקלים המלחים הבאים: 28.13 g NaCl, 0.77 גרם אשלגן כלורי, 1.60 g CaCl2 · 2H2O. 4.80 g MgCl2 · 6-אייץ '-2O, 0.11 g NaHCO3ו- 3.50 g MgSO4 · 7 שעות2O.</li>
		<li>להוסיף 1 ליטר של מים מזוקקים, לפזר את כל הרכיבים.</li>
		<li>LB בינוני, שוקלים את המרכיבים הבאים: תמצית שמרים 10 גרם, 10 גרם peptone, ועבור לוחות אגר אגר 20 גרם נוספים.</li>
		<li>להוסיף 250 מ של מי ברז, להמיס רכיבים.</li>
		<li>אוטוקלב שניהם מוכן מדיה בנפרד ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
		<li>עבור לוחות אגר, לשלב 250 מ ל LB בינוני עם 750 מ של מדיום מים ים מלאכותי ישירות לאחר autoclaving והכן צלחות.</li>
		<li>בינוני נוזלי, לשלב 250 מ ל LB בינוני עם 750 מ של מדיום מים ים מלאכותי ישירות לאחר autoclaving, או התקררה. הערה: המדיום מים ים מלאכותי עשוי לקבל עכורים דרך משקעים מלח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צובעות את זני חיידקים זוהרים על צלחות בינוני אגר מים ים מלאכותי, דגירה בין לילה ב 24-30 º C. הערה: זמן האחסנה של זני חיידקים מושגת בדרך כלל באמצעות הקפאת גליצרול מניות של התרבות חיידקי. זנים צריך תמיד להיות רץ בעירום על פלטות אגר קודם כדי להבטיח תנאי התחלה אחיד עבור כל זנים, לפני השימוש עבור תרבויות נוזלי, עקב שלב פיגור בצמיחה לאחר מפשיר.</li>
	<li>הכן של סרטן שעומדים על ידי מזריקים 100 מ ל ים מלאכותי מים בינונית עם מושבה בודדת מהצלחת. דגירה על. סרטן שעומדים ב 24-30 מעלות צלזיוס ו 120 סל ד ב שייקר אינקובטור בן לילה.</li>
	<li>לחסן 800 מיליליטר ים מלאכותי מים בינונית עם 8 מ של עוד.</li>
	<li>דגירה של תאים חיידקיים ב 24-30 מעלות צלזיוס ו 120 סל ד ב שייקר אינקובטור. הערה: הפרופיל עוצמת האור של חיידקים זוהרים משתנה בחום עם הטמפרטורה. בהתאם מנגנוני הרגולציה של הפקת אור המתח חיידקי בהתאמה, פליטת אור עשוי להתחיל לאחר כ- 1-6 h.</li>
	<li>להתבונן תרבית תאים חיידקיים עד שהם מתחילים זוהר (כ ג 1-6). הערה: בהתאם למטרת הביטוי, התאים גדלים עד למחרת, נקצרים מכן, או התאים יכולים להיות כל הזמן רועד כל עוד הם דולקים. קציר את התאים ואת טיהור של כל החלבונים יכול להיעשות על-פי נהלי.</li>
</ol>4. in Vivo פעילות וזמינותו של זני חיידקים זוהרים וללחצים ששונה e. coli
הערה: זמן האחסון של זנים הוא בדרך כלל acieved באמצעות הקפאת גליצרול מניות של התרבות חיידקי. זנים צריך תמיד להיות רץ בעירום על פלטות אגר קודם כדי להבטיח תנאי התחלה אחיד עבור כל זנים, לפני השימוש עבור תרבויות נוזלי, עקב שלב פיגור בצמיחה לאחר מפשיר.
<ol><li>פס המתח חיידקים זוהרים הרצוי או ששונה e. coli מסננים על צלחת אגר, דגירה-28 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: הטמפרטורה הדגירה יכולה להשתנות זן זן ויש לו להערכה מדעית. כדי להיות היכולת להשוות בין זני חיידקים זוהרים, ששונה e. coli זנים, תנאי הגידול צריך להיות זהה.</li>
	<li>לחסן 3 מ"ל של מדיום עם המתח בהתאמה עם מושבה בודדת מתוך צלחת אגר, דגירה התאים-28 ° C ו- 180 סל ד ב שייקר אינקובטור עבור 1-2 h.</li>
	<li>למדוד צפיפות תא 1:10 דילול של התרבות נוזלי-650 ננומטר. לחשב את יחס נפח לתרבות 1 מ"ל עם יתר650 של 0.05. הערה: וזמינותו קורא צלחת הבאים יקבעו את צפיפות התאים-650 nm כדי למנוע הפרעה על ידי פליטת אור של הזנים.</li>
	<li>Pipette הנפח מחושב של תרבות, בינוני לתוך צלחת עם קירות שחור 24-ובכן עם קרקעית זכוכית. עבור ששונה e. coli זן, להוסיף 1 µL של kanamycin (עמידות לאנטיביוטיקה של וקטור pET28a) µL 1 של IPTG (אינדוקציה של ביטוי גנים) הדגימות. במקום מכסה על הלוח כדי למנוע התאיידות במהלך המדידות. הערה: כדי להבטיח כי וקטור pET28a המכיל את אופרון כל לאקס לא ללכת לאיבוד על ידי התרבות e. coli , kanamycin להתווסף כל מדגם e. coli ב הבארות צלחת ולהבטיח את הפקת האור e. coli התאים ניתן למדוד, בביטוי הגן חייב להיגרם על ידי IPTG. כדי למנוע הפרעה crosstalk ומדידה, עם קירות שחור צלחות היטב עם רצפת הזכוכית, מכסה שקוף הראו התוצאות הטובות ביותר. למרות זאת, יכול להיות שנצפו crosstalk ויש עמדות טוב להיבחר בקפידה.</li>
	<li>להתחיל את המדידה קורא צלחת. הערה: פרוטוקול קורא צלחת מבוסס על תסריט שפותחה במיוחד עבור זה assay (ראה חומר משלים) המשלבת שתי מדידות, ספיגת ביולומינסנציה. נקודות נתונים נאספים כל 10 דקות ברעידות קבוע בין המדידות על טמפרטורה קבועה של 28 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Widder, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+in+the+Ocean:+Origins+of+Biological+Chemical,+and+Ecological+Diversity.">Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity.</a> Science. 328 (5979), 704-708 (2010).</li><li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence,+Microbial.">Bioluminescence, Microbial.</a> Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).</li><li>Ulitzur, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+tetradecanal+as+the+natural+aldehyde+in+bacterial+bioluminescence.">Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).</li><li>Kurf&#252;rst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+postulated+structure+of+the+primary+emitter+in+the+bacterial+luciferase+reaction.">Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).</li><li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence.</a> Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).</li><li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Bioluminescence:+Organization,+regulation,+and+application+of+the+lux+genes.">Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes.</a> FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+Photobacterium+leiognathi+non-fluorescent+flavoprotein+with+limited+sequence+identity+to+bacterial+luciferase.">Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase.</a> J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+flavoprotein+related+to+the+subunits+of+bacterial+luciferase.">Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase.</a> EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+structural+features+of+the+luxF+protein+and+the+subunits+of+bacterial+luciferase:+Evidence+for+a+(&#946;&#945;)8+fold+in+luciferase.">Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (&#946;&#945;)8 fold in luciferase.</a> Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+refinement+of+the+non-fluorescent+flavoprotein+from+Photobacterium+leiognathi+at+1.60+&#197;+resolution.">Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 &#197; resolution.</a> J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).</li><li>Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+flavoprotein+FP390+from+a+luminescent+bacterium+Photobacterium+phosphoreum+refined+at+2.7+&#197;+resolution.">Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 &#197; resolution.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).</li><li>Bergner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+biochemical+properties+of+LuxF+from+Photobacterium+leiognathi.">Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi.</a> Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).</li><li>Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+quorum+quenching+in+Vibrio+harveyi:+Lessons+learned+from+in+vivo+work.">Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work.</a> ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).</li><li>Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Genetics of bacterial bioluminescence.</a> Annu Rev Genet. 28, 117-139 (1994).</li><li>Kelkar, M., De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+based+in+vivo+screening+technologies.">Bioluminescence based in vivo screening technologies.</a> Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).</li><li>Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+luciferase+reporters:+The+Swiss+army+knife+of+molecular+biology.">Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology.</a> Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).</li><li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioluminescence living lights, lights for living. , (2013).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).</li><li>Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , (2004).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הקמת פלסמיד ביטוי המכיל ארבעה קטעים להלחין את אופרון כל לאקס-צלעות של mandapamensis פ 27561 הושגה באמצעות גיבסון שיבוט. ביטוי גנים זה e. coli מבוסס לאקס מאפשר לתאים e. coli פולטים אור. הימנעות חישת רגולציה, תנאי הגידול לא סטנדרטיים הם יתרונות משמעותי של מערכת זו.
יתרונות השימוש אסטרטגיה שיבוט גיבסון הם הרכבה קלה של שברי DNA ליניארי מרובים, גמישות גבוהה, אין צורך הגבלה ספציפית אתרי18,19,20. שיטה זו מאפשרת לשנות בקלות את אופרון לאקס , למעט גנים יחיד או אשכולות גנים או החדרת גנים חדשים או החלפת גנים מהמאמץ אחד עם השני. תנאי הכרחי ליישום של שיטה זו הוא הזמינות של רצף גנטי אופרון בהתאמה lux . רק עבור מספר קטן של חיידקים זוהרים הוא רצף הדנ א מלאה של אופרון בהתאמה לאקס מוכרות ו/או זמינות. רבים של רצפי אלה הם מפוצלים כי מופקות באמצעות רובה רצף. במקרה של ובדוקים mandapamensis פ 27561 רצף הדנ א מלאה של אופרון לאקס הוא ידוע וזמין ממסד הנתונים של ג'ין NCBI (GenBank: DQ988878.2).
צעד קריטי בפרוטוקול של האסיפה גיבסון הוא חישוב ריכוז ה-DNA של השברים יחיד. בפרוטוקול הרכבה של היצרן הומלץ להשתמש 0.2 - 0.5 pmols, הנפח הכולל של 20 µL 4-6 קטעים20,21. במקרה שלנו, איפה luxCDABFEG-ribEBH מורכב מ 4 חלקים, ריכוזים של נפחים היו 0.1 pmol 45 µL, בהתאמה, בהתאם התשואה של מוצרי ה-PCR. מצד אחד, הריכוז היה צריך להיות מופחת, מצד שני, אמצעי האחסון היה צריך להיות מוגברת. ובכל זאת, מכלול עבדו היטב, רצפי DNA אישר את הכניסה הנכון על הניסיון הראשון. ממצא זה אישר גיבסון הרכבה כשיטה המתאימה ועמיד לחקירה שלנו, אשר יכול בקלות להיות שונה18,19,20.
צלחת שהוקם קורא וזמינותו הוא קל לטפל בשיטה. הוא מאפשר ניתוח ראשוני פשוטה של חדש (un-) ידוע זני חיידקים זוהרים ונותן כבר רמז ראשון על מנגנון רגולטורי אור הייצור (למשל, לג בהפריה חוץ גופית-צפיפות התאים נמוך). בנוסף, בקלות ניתן להעריך תנאי הגידול בשילוב עם ייצור אור פשוט על ידי שינוי מדיום הגידול או טמפרטורה.
המדידות עם הקורא צלחת בוצעו ב 28 ° C. הסיבה להגדרה זו יוצאת דופן היא הרגישות לטמפרטורה של זני חיידקים זוהרים, איפה טמפרטורות מעל 30 מעלות צלזיוס להוביל פחות או אפילו אין צמיחה ו/או פליטת אור. שימו לב, כי הקורא צלחת הוא מסוגל לשמור טמפרטורה מוגדרים לאורך זמן עם המגבלה של חסר הפעיל מערכת הקירור. לכן, טמפרטורת הסביבה של חייב להיות מתחת הטמפרטורה של המדידה.
מהווה הוכחה של המושג, ההשוואה של הבונה e. coli עם המתח זוהרים mandapamensis פ (איור 5) מצד אחד ומדידות הפניה (איור 4) לעומת בוצעו ואשר האמינות של המערכת שזה עתה הוקם. בנוסף, מדידה ארוכת טווח הבטיח את תוחלת החיים של פליטת אור (איור 6). אבל צריך לשקול כי יתר הערכים אינם אמינים מעל צפיפות אופטית מסוימים, בהתאם המאפיינים של המכשיר בשימוש מדידה (כ 15 h במקרה הנוכחי) שבו יהיה צורך של דילול המתאים עבור מדידה ב טווח ליניארי של הגלאי. אלה סטיות גבוהה יתר הערכים לבצע מדידות זמן אלה לא אמין. לכן, מדידות קצרות כגון 10 h מומלץ שימוש את הגדרת הניסוי דיווחו כאן.
איור7 ניתן לראות מגבלות של צלחת הוקמה קורא וזמינותו. הקושי הוא למצוא הגדרה מתאימה של המדידה. 'להרוויח ערך' מכווננת את הרגישות של הצינור מכפיל צילום (PMT). הוא ההגברה של האות ב- PMT, כלומר גורם רווח גבוה יותר יגדיל את האות. אם רווח ערך נמוך מדי, האות לרעש יחס הופך גדול יותר בעוצמות אור של "נמוך" חיידקים זוהרים זוהר שאי אפשר למדוד כל (אותות יותר קרובה לאפס, הנתונים לא מוצג). האתגר ב assay זוהרים הוא להגדיר את הרווח אז תוצאות המדידה עבור כל זני חיידקים להישאר בטווח של המכשיר. בנוסף, טווח מדידה עבור הפריה חוץ גופית תלוי זמן מרווח זמן המדידה (למשל, מקסימום 2,000,000 1 s).
הרווח הוגדר 2800, היה נבדק מדעית, שבחרת עבור הקורא צלחת ספציפיים השתמשו להקמתה של שיטה זו. ההגדרה בשימוש רווח מאפשרת ההקלטה של האור הנפלט המרבי על ידי ביולומנאסן מערכת e. coli , פ mandapamensis 27561 ו mandapamensis פ S1 ללא גלישה, אבל עבור זנים mandapamensis פ TH1 ו- (פ') harveyi 14126 הרווח היה גבוה מדי. לכן, אלה זנים השנייה חורגת מהמגבלה של זיהוי, לא ניתן למדוד את עוצמת האור ממש מקסימלי. מגבלה טכנית זו עלולה למנוע את ההשוואה של חיידקים זוהרים, המציגות וריאציות גבוהה בפליטת אור מקסימלית, למרות תנאי הגידול וצפיפות התא יכול להיות דומה.
מיצוב של זנים חיידקי שנותחה בתוך הלוחות טוב בשימוש יש לעבור הערכה מדעית. למרות הצלחות טוב שחור עם תחתית זכוכית שימשו, נצפתה crosstalk בין הדגימות. עוצמת האור של זנים מסוימים הוא כל כך גבוה, כי כל הבארות הסמוכים יראה שווא חיוביים פליטת אור (למשל, ריק). לכן, חשוב למדוד שני זנים שונים בנפרד או עם הפרדה מרחבית מסוים אחד לשני.
ישנם כבר רבים ששינה זני החיידק הידוע המכילים חלקים אופרון לאקס , הם בעיקר מוכוונת יישומים15,16,17. בשיטות המתוארות כאן, מכוון מחקר בסיסי, לדוגמה את האפשרות לנתח כל הגן לאקס בנפרד. למרות המחקר של ביולומינסנציה יש היסטוריה ארוכה, יש עדיין הרבה שאלות פתוחות. למעט או החדרת גנים מ אופרון לאקס , מחליפים את הגנים luxAB עם גנים של עוד מאמץ או ניתוח חלבון מכלולי מוטבע בתוך קל לטפל e. coli המערכת והיישומים נוספת של צלחת הקורא assay, יתכן ניתן להשיג מידע נוסף על תהליכים רגולטוריים, הפונקציות של גנים lux .

פליטת האור על ידי אורגניזמים (ביולומינסנציה) הוא תהליך מרתק נמצאו חיידקים, פטריות, חרקים, נמטודות, דגים ופירות דיונונים1. פליטת אור זוהרים מגיח לתגובה chemiluminescent שבו אנרגיה כימית (חלקית) הופכת אנרגיית האור ("אור קר"). בחיידקים זוהרים, מזרז לוציפראז אנזים heterodimeric את monooxygenation של שרשרת ארוכה, aldehydes אליפטיות, כגון tetradecanal, כדי חומצות התואם את בליווי פליטת אור עם מקסימום-490 nm2, 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2.jpg"> איור 1 : תגובה כללית בסכמה לוציפראז חיידקי. חיידקי לוציפראז (LuxAB) מזרז את monooxygenation של שרשרת ארוכה aldehydes (CH3(CH2)nצ'ו) על-ידי ניצול מופחתת פלווין mononucleotide (FMNH2), חמצן מולקולרי (O2), מניב את המוצרים זמן שרשרת חומצות (CH3(CH2)nCOOH), פלווין mononucleotide (FMN), מים (H2O), את פליטת האור מרוכז 490 nm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
האנרגיה שפורסמו במהלך חמצון זה גורם של עירור FMN-4a-הידרוקסיד, אשר משמש האור emitting luciferin4. החלבונים המעורבים ביולומינסנציה חיידקים, כלומר LuxCDABEG, מקודדות על ידי אופרון לאקס , מאוד נשמרים על זני חיידקים שונים2,5. הגנים luxA ו- luxB קידוד עבור לוציפראז heterodimeric; מוצרי גן של luxC של luxD, של לוקס הם מרכיבים של רדוקטאז חומצת שומן מורכבות; luxG מקודד עבור רדוקטאז פלווין6. מספר של ביולומנאסן Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) נושאים את הגן נוספים luxF . דווח כי LuxF הוא חלבון homodimeric המאגד פלווין יוצא דופן נגזרת 6-(3'-(R)-myristyl)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. גנים נוספים זוהו שהיו אחראים הריבופלאווין סינתזה (למשל, ribEBH), יתר על כן הרגולטורי הגנים דווח, כי תפקיד בוויסות חישה quorum של ביולומינסנציה, במיוחד עבור ויבריו פישרי ויבריו harveyi6,13. למרות סדר מאוד שנשמרת ג'ין, חיידקים זוהרים להראות וריאציות גבוהה במאפיינים כמו התנהגות גדילה, האינטנסיביות של פליטת אור, או ויסות ביולומינסנציה2,5,14 .
מספר זנים או פלסמידים המכיל חלקי או שלם lux operons ידועים, ניצול ביולומינסנציה כמערכות הכתב. יישומים שונים כגון קביעת מקדם פעילות, ניטור של חיידקי מציג בסביבת או דוגמאות מזון, ביולומינסנציה תהודה אנרגיה העברה (ברט), ויוו הדמיה של זיהומים היצורים האיקריוטים. pyrosequencing וכדומה היו הוקמה15,16,17. מעניין, שלושת תכוף כתב ביולומנאסן מערכות נגזרות של גחלילית בצפון אמריקה (Photinus pyralis) את הפתוגן המעית של נמטודות (Photorhabdus luminescens), אמנון ותמר ים (Renilla reniformis). אף אחד מערכות אלה ממקור חיידקי, אך השימוש לאקס גנים operons ממוצא חיידקי הוא צובר יותר עניין של מחקר יישומי16. היישום פחות בשפע של ביולומינסנציה חלבונים ממקורות חיידקי בעיקר עקב יציבות נמוכה יותר, תוחלת החיים של חיידקים נגזר חלבונים זורח, אשר יכול להיות קשור שלהם בתי גידול ימיים. חיידקים זוהרים של בתי גידול ימיים אינן cultivable תחת תנאי מעבדה סטנדרטיים. חיידקים אלו דורשות תקשורת צמיחה ספציפיים, תנאים, כגון טמפרטורות נמוכות ובינוניות צמיחה/דגירה מים ים מלאכותי (למשל, 28 ° C).
כדי לפשט את ההשוואה של לאקס אופרון מאפיינים או יחיד לאקס גנים של מגוון זני חיידקים שונים מייצרים אור, שיטה לתקנן את הביטוי אופרון לאקס וניתוח הוא תנאי הכרחי. לפיכך, הופיע הרעיון של שילוב של אופרון כל לאקס-צלעות החיידק תקן-מחקר Escherichia coli (e. coli). לענין זה, גיבסון הרכבה הוכיחה להיות כלי שימושי כדי לשלב מספר קטעים ליניארי, חופפים וקטור ביטוי אחד ללא צורך אתרי הגבלה ספציפית. שיטה זו מתאימה גם כשאתה מוסיף DNA גדולים מדי (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb אופרון גודל) הגברה באמצעות PCR. אופרון לאקס ניתן להפריד קטעים חופפים מרובים ולאחר מכן הניתנים להרכבה לתוך פלסמיד ביטוי אחד ונבדקה סוף סוף הרצף הרכבה המוצר יכול להיהפך ישירות לתוך המתאים e. coli מערכת עבור תשואה גבוהה חלבון ביטוי18,19,20. בנוסף קל לטפל e. coli המבוסס על ביטוי גנים לאקס , שיטה פשוטה המשלב הקלטה של צמיחת תאים, פליטת אור זוהרים נשארו שתוקם. השיטה המתוארת כאן מאפשר מדידה ב באתרו של צפיפות התאים והן פליטת אור של חיידקים זוהרים.
הניתוח של גנים לאקס לאקס אופרון וסדר. רגולציה של חיידקים שונים מייצרים אור עם, מצד אחד, מייצרים אור מלאכותי e. coli מערכת המכילה את אופרון כל לאקס-צלעות של פ mandapamensis יד 27561, מצד שני, וזמינותו קורא צלחת פיתח המשלב את ההקלטה בבאתרו של צפיפות התאים, פליטת אור, עוזר כדי לקבל מידע נוסף אודות חיידקי לאקס המערכות השונות. השוואה של luciferases ואנזימים הקשורים ואפיון היסוד הזה עלול להוביל חלופות למערכות כתב כבר הוקמה עם יציבות משופרת ופעילות.

<table><tbody><tr><td>NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>E2621S</td><td>for 10 rxn&lt;br/&gt; dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad</td></tr><tr><td>Phusion Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0721</td><td>for 50 rxn</td></tr><tr><td>Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193S/R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>for 250 rxn</td></tr><tr><td>Monarch DNA Gel Extraction Kit&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>#T1020S</td><td>for 50 rxn</td></tr><tr><td>GeneJet Plasmid Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td>for 250 rxn</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>24-well black sensoplate with glass bottom</td><td>Greiner Bio One</td><td>662892</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Omega plate reader&amp;nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMA/Mars Analysis Software</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Version 2.20</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2010</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard Incubator Shaker</td><td>Infors AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ measurement and correlation of cell density and light emission of bioluminescent bacteria

יש מספר ניכר של חיידקים שמסוגל לפלוט אור. כולם חולקים האשכול גנטי זהה, כלומר אופרון לאקס . למרות הדמיון הזה, חיידקים אלו מראים קיצוניים מאפיינים כמו התנהגות גדילה, האינטנסיביות של פליטת אור או ויסות ביולומינסנציה. השיטה המוצגת כאן היא assay פיתח המשלב הקלטה של צמיחת תאים ועוצמת פליטת אור זוהרים לאורך זמן ניצול קורא צלחת. הצמיחה וכתוצאה מכך ואת פליטת אור מאפיינים יכולים להיות מקושרים לתכונות חשובות של המתח חיידקי המתאימים, כגון חישת רגולציה. הטיפוח של מגוון רחב של חיידקים זוהרים דורש מדיום מסוים (למשל, מים ים מלאכותי בינוני), שהוגדרו טמפרטורות. קל לטפל, תקן-מחקר שאינם מייצרים אור החיידק Escherichia coli (e. coli), מצד שני, יכול להיות מעובדות בזול בכמויות גבוהות בקנה מידה מעבדה. ניצול e. coli על ידי החדרת של פלסמיד המכיל את כל לאקס אופרון יכולים לפשט את תנאי הניסוי, בנוסף ונפתח אפשרויות רבות עבור יישומים עתידיים. הביטוי של כל הגנים לאקס ניצול זן בביטוי e. coli הושגה על ידי בניית פלסמיד ביטוי דרך גיבסון שיבוט והוספה של ארבעה קטעים המכיל שבעה גנים לאקס , שלוש צלעות הגנים של אופרון לאקס-צלעות לתוך וקטור pET28a. E. coli המבוסס על ביטוי גנים לאקס המושרה ונשלט באמצעות תוספת איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) וכתוצאה מכך ביולומנאסן e. coli תאים. היתרונות של מערכת זו הם כדי למנוע חישת מגבלות רגולציה ויצירות בינוני מורכבים יחד עם תנאי הגידול לא סטנדרטיות, כגון שהוגדרו טמפרטורות. מערכת זו מאפשרת ניתוח של לאקס גנים והגומלין שלהם, על ידי הכללת הגן בהתאמה מ אופרון לאקס , או אפילו תוספת של הרומן גנים, מחליפים את הגנים luxAB של זן חיידקי אחד במשנהו, או ניתוח מתחמי חלבון, כגון luxCDE.

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria at JoVE.com

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

חיידקים זוהרים לווסת ייצור אור באמצעות מגוון רחב של מנגנונים, כגון חישת צפיפות. שיטה חדשנית זו מאפשרת החקירה ב באתרו של ביולומינסנציה הקורלציה של פליטת אור לדחיסות התא. מייצרים אור מלאכותי Escherichia coli מערכת מאפשרת אפיון lux operons, לאקס חלבונים והגומלין שלהם.

בחיי עיר ובחינת המתאם של צפיפות התאים ואת פליטת אור של חיידקים זוהרים

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

in-situ-measurement-correlation-cell-density-light-emission

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

11.5K Views.  Graz University of Technology. חיידקים זוהרים לווסת ייצור אור באמצעות מגוון רחב של מנגנונים, כגון חישת צפיפות. שיטה חדשנית זו מאפשרת החקירה ב באתרו של ביולומינסנציה הקורלציה של פליטת אור לדחיסות התא. מייצרים אור מלאכותי Escherichia coli מערכת מאפשרת אפיון lux operons, לאקס חלבונים והגומלין...

Video: In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Immunology and Infection

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Genetics

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Biology

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

גמיש מדידה של כתבים זוהרים באמצעות לוציפראז האורך אוטומטית של הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

אופטימיזציה של אנטרואידים במעיים אנושיים למחקרי שעון ביולוגי

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

מחבר זרקור: חקירות חוץ גופיות של מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

בחיי עיר ובחינת המתאם של צפיפות התאים ואת פליטת אור של חיידקים זוהרים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

"Bioluminescent" כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

הדמיה בקטריאלי bioluminescent

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

גמיש מדידה של כתבים זוהרים באמצעות לוציפראז האורך אוטומטית של הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין)

ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים

ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים