עבודה זו נתמכה על ידי קרן לב הבריטי ריצ'רד ברייט VEGF מחקר לבטוח, את MRC.

<ol>
	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli.">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li><li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice.">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li><li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research.">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier:+a+morphofunctional+study+in+the+rat.">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277 (2011).</li><li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השלבים הקריטיים בכל שיטה לאפשר ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, כולל הערכה של החדירות של הכליות בכללותה (uACR ופלסמה קריאטינין מידות), החדירות של glomeruli בודדים (glomerular LpA / Vאני), בדיקה של שינויים מבניים (PAS Trichrome כחול, EM), חלבון לוקליזציה (אם), וכן ביטוי גנים glomerular (RT-PCR ו סופג המערבי). שיטות אלה הם המפתח אישיותי של הפונקציה glomerular במודלים של העכבר של מחלת כליות.
כאשר מעריכים את החדירות של GFB, מחקרים רבים שבחרו להשתמש קונבנציונלית uACR או 24 שעות אלבומין הפרשה קצב אמצעי יעיל17,18. למרות שיטות אלה מאפשרות הערכת החדירות GFB בכללותה, זה אינו מאפשר הערכת הפרט חדירות glomerular והגיוון בין glomeruli. מחקרים קודמים מצאו מדידה של glomerular LpA / Vi להיות מדד רגיש יותר לשינויים GFB חדירות5,9. אכן, בתוצאות נציג הפגינו בעיתון הזה, ב- 14 שבועות לכתוב אינדוקציה של קו VEGF-A, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b עכברים יש של uACR נמוך באופן משמעותי בהשוואה ל- VEGF-A KO עכברים; אולם, תוצאה זו אינה משתקפת במלואה בתביעות glomerular LpA / Vאני מדידות, איפה VEGF-A165b לא משמעותית מנעו מגדילה GFB חדירות (איור 1 ואיור 2)5. זה מראה את החשיבות של שימוש מבחני מרובים כדי להעריך את החדירות הכליות וגם את החדירות של glomeruli בודדים. יתר על כן, glomerular LpA / Vאני oncometric assay מרמז כי החדירות של הפרט glomeruli מן הכליה באותו יכול להשתנות במידה רבה, במיוחד מחלות מודלים5,10, 19. מגבלה אחת כדי למדוד את glomerular LpA / Vאני הוא כי זה ניתן לבצע אך ורק במובילים ניסיוני; לפיכך, מדידות uACR רגילה נדרשים לתת אינדיקציה מובילים ניסיוני.
בנוסף הערכת של פנוטיפ פונקציונלי, השיטה הנוכחי מעודד גם הערכה של פנוטיפ ultrastructural מבניים. ניתן לבצע זאת באמצעות מבחר של כתמים כגון PAS, trichrome, כתמי כסף; כל אחד כדי להעריך היבטים שונים של המורפולוגיה glomerular. במודלים חריפה של מחלת glomerular, שבדרך כלל המקרה במודלים של העכבר, הוא יכול להיות קשה לזהות חריגות מבנית הגדולות באמצעות הכתמים האלה אלא אם כן אתה פתולוג מיומן כליות. לכן, בביצוע EM הוא הציע כדי להעריך את ultrastructure של GFB, אשר מאפשר את המדידה כמותית של פרמטרים כגון GBM, אנדותל fenestrae גודל, מספר וכן המאפיינים podocyte. מדידות כאלה דורשים הכשרה מינימלית כדי לבצע ומאפשר החוקר לקבוע את-הסוגים/מבנה התא מושפע מודל המחלה. כך, בדוגמה המוצגת בתוצאות נציג, העכבר VEGF-A KO נמצאה להיות דוגמנית מתון של מחלת glomerular, אין מומים מבניים עיקריים היו נוכחים בעת צביעת PAS. עם זאת, ספציפית podocyte VEGF-A קו זירוז את שינויים GBM, podocytes, תאי אנדותל כשבוחנים את אולטרה-מבנה glomerular5. למרבה הצער, ההכנה של הכליה EM שמתואר בשיטת ההווה אינו מאפשר זיהוי של glycocalyx אנדותל, אשר ידוע גם להיות השפעות משמעותיות על החדירות של GFB19. כדי למדוד במדויק את העומק glycocalyx, הכליות צריך להיות perfuse-קבועה עם 2.5% גלוטראלדהיד עם 1% Alcian כחול glycocalyx אנדותל labelling, כפי שמתואר ואחOltean19.
פעם היה להעריך את פנוטיפ פונקציונלי ומבניים, וצריך להעריך את דפוסי ביטוי/הפעלה של גנים שונים מסלולים ואז בפרט glomeruli. הערכת אולטרה מבניים מוקדמת יכול לתת מידע על התא מעורב, המציין אם podocyte אנדותל ספציפיים או גנים/מסלולים צריך להיבדק glomerular/סוגי מבנים. לדוגמה, בתוצאות נציג של העכברים VEGF-A KO, ירידה במספר fenestrae אנדותל נצפתה (איור 3D); לכן, הביטוי glomerular חלבון של סמן אנדותל ידוע להיות מעורב מסלול VEGF-A נבחנה; VEGFR-2 (איור 4B)5. בנוסף הביטוי של חלבונים ב glomeruli, לוקליזציה שלהם גם להיות visualized באמצעות אם. במחקר על-ידי ג'אנג ואח20, ביטוי ספציפי podocyte של GLUT1 אושרה podocytes על ידי אם שותף ההתאמה לשפות אחרות של GLUT1 מוגברת עם podocin.
לעומת שיטות אלטרנטיביות הציג בספרות כדי להעריך את הפונקציה glomerular, השימוש בשיטת המתוארות במאמר זה כדי להעריך את תפקוד הכליות במודלים של העכבר של מחלת glomerular מאפשר את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה של היבטים מרובים. באמצעות שיטה זו, החוקר הוא מסוגל לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון של המחלה נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה. בשיטה זו ניתן בקלות ליישם בעתיד חקירות פונקציה glomerular הערכה של המחלה פנוטיפים ואת הרפוי פוטנציאליים.
לסיכום, פרוטוקול זה כלליים וישימה מתאר כליות מלא עבודה-up עבור העכבר מודלים של המחלה glomerular, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

השימוש של מודלים מאתר לחקות מחלת כליות האדם הופך נפוץ יותר ויותר. הדגמים מאתר כזה כוללים מודלים ספונטנית כגון באופן ספונטני עם יתר לחץ דם עכברושים (שומר)1, streptozotocin (STZ)-induced סוכרתית חולדות, עכברים2והקלד db/db בעכברים סוכרתיים II3, מודלים מהונדס גנטית כגון ראשי ספציפי podocyte מוקד סגמנטלי glomerular טרשת נפוצה (FSGS) מודלים4, podocyte ספציפיים כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF-A) הנוק-אאוט (קו VEGF-A) דגם5, תסמונת אלפורט מודלים6והיא רכשה מודלים כגון כריתת כליה 5/67 ו- ureteral חד צדדית את החסימה (UUO) מודל8. על מנת להעריך את ההיבטים השונים של הפונקציה glomerular במודלים אלה, מספר טכניקות זמינים. מטרת הנייר בשיטה זו היא להדגים מקיף העבודה מעלה כי יש לבצעו במודלים של העכבר של מחלת כליות כדי להעריך באופן מלא פונקציה glomerular.
הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו הוא שהם מאפשרים את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה היבטים מרובים. זה כולל הערכת את החדירות glomerular, חלבון וגם כדי מים, מומים מבניים glomerular ו שינויים הביטוי/שחבור של mRNAs, חלבונים חיוניים לתפקוד נורמלי glomerular. באמצעות שיטה זו, החוקר הוא מסוגל לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון המחלה, אשר נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה.
בספרות, זה תופעה שכיחה יוצגו עם דגם העכבר של מחלת glomerular איפה פנוטיפ נקבעת על-ידי רמה מוגברת של אלבומין בשתן. עם זאת, אין עדות לכך כי שיטה אחת לקביעת glomerular פונקציה אינה תמיד יעילה; מדידת קצב הפרשת אלבומין בדרכי השתן או על יחס השתן אלבומין קריאטינין (uACR) רק מספק מידע על תפקוד הכליות הכולל, ולא מתוך glomeruli בודדים. מחקרים קודמים הראו כי החדירות יכול להשתנות glomeruli שונה מן באותה כליה5,9,10. בנוסף, הערכה של החדירות של הפרט glomeruli היא דרך רגישה יותר להעריך פונקציית glomerular; הטכניקה של מדידה של חדירות מים glomerular בודדים (LpA / Vאני) הראתה להיות רגיש יותר לשינויים בתפקוד glomerular מאשר מדידה uACR9. Assay הזה הוא מועיל במודלים עכבר, כי הם עמידים בפני פרוטאינוריה, כגון אלה על רקע c57BL/611. היתרון של המאמר הנוכחי של השיטה היא כי זה בוחן הן את החדירות כליות מוחלטת כדי אלבומין, כמו גם את החדירות glomerular בודדים למים.
בחינה של מומים מבניים glomerular מוערך לעתים קרובות על ידי סוללה של כתמים כגון חומצה המחזורית שיף (PAS), trichrome, ואת כתמי כסף. אלה מאפשרים כליות פתולוג מיומן להעריך את הרמה של מחלת כליות באמצעות שיטת הניקוד. למרות כל שיטות טובות, שינויים במבנה-המאקרו glomerular הם לא תמיד נצפו אי-ספיקת כליות חריפה מודלים12. שיטה זו מציעה כי בנוסף בביצוע טכניקות היסטולוגיה כליות שתוארו לעיל, האולטרה-המבנה glomerular גם וצריך להעריך באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). פקעית מוכתם יכול להיראות נורמלי יחסית במיקרוסקופ אור רגיל; עם זאת, בעת הערכת עם EM, שינויים קטנים רוחב גלומרולרי במרתף (GBM), podocyte הרגל תהליך הצטנעות, fenestrations אנדותל וכיסוי של sub-podocyte שטח ניתוח. לכן חיוני כי glomerular אולטרה-מבנה והן -מבנה שקובעת כדי לקבוע המנגנון של תפקוד glomerular.
בנוסף להערכת מומים מבניים glomerular, שינויים ב- mRNA, ביטוי חלבונים שחבור, וכן הפעלת חלבון (למשל, זרחון), צריך להיבדק להבהיר עוד יותר על מנגנוני המחלה glomerular. כאשר מסתכלים על מחלת glomerular, או, לדוגמה, כאשר קו/over-expressing גן בפרט glomerular תאים, כגון ספציפי podocyte VEGF-A KO העכבר5, זה חשוב כי השינויים חלבון ה-mRNA נבדקים רק בהישג תאים glomerular, לא כל הכליה. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבה glomeruli מבודדים מן קליפת הכלייה העכבר, ולאחר מכן החלבון/רנ א הם מבודדים. זה מאפשר ניתוח ספציפי של dysregulation חלבון/mRNA glomeruli של מודל המחלה.
פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

השימוש של מודלים מאתר לחקות מחלת כליות האדם הופך נפוץ יותר ויותר. המחקר שלנו מתמקדת להערכת הפונקציה glomerular סוכרת כלייתית ועכברים podocyte ספציפיים של VEGF הנוק-אאוט; לכן, פרוטוקול זה מתאר כליות מלא העבודה לשימוש במעבדה שלנו לצורך הערכת מודלים אלה העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. לעומת שיטות אלטרנטיביות הציג בספרות כדי להעריך את הפונקציה glomerular, השימוש בשיטת המתוארים במאמר זה מאפשר את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה היבטים מרובים. באמצעות שיטה זו, החוקר יכול לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון של המחלה נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה. השיטות לאפשר להערכה תפקודית מפורט של המכשול glomerular סינון באמצעות מדידה של השתן אלבומין קריאטינין יחס חדירות מים glomerular בודדים, וכן בדיקה מבנית והן אולטרה מבנית באמצעות חומצה המחזורית שיף הכתם מיקרוסקופ אלקטרונים. יתר על כן, ניתוח של dysregulated גנים ברמת mRNA, חלבון מאפשר ניתוח מכניסטית של הפונקציה glomerular. פרוטוקול זה מתאר את השיטות כלליים אבל יכולת הסתגלות ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

שתן נאסף באמצעות כלובים מטבוליים פראי סוג (WT), inducible podocyte ספציפיים של VEGF מדהימה (קו VEGF-A), VEGF-A קו X Neph-VEGF165b עכברים (VEGF-A KO עכברים המבטאים יתר על המידה את isoform b VEGF-A אנושי165ב podocytes ב אופן המכונן). על מדידה של יחס השתן אלבומין קריאטינין שבועות 0, 4, 10 ו- 14 לאחר דוקסיציקלין אינדוקציה של VEGF-A קו, קו VEGF-A עכברים שפיתח albuminuria מתקדמת 10 שבועות לעומת WT littermate שולט. ניתן לראות את הערכים המוחלטים איור 2A, ו מנורמל לקו הבסיס של כל הערכים העכבר איור 2B. עם זאת, albuminuria, לא נצפו בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (איור 2), המציין את VEGF-A165b הוא מגן הדגם של albuminuria5.
Glomerular LpAVאני נמדד glomeruli בודדים sieved מ- WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A165b הכליות. דוגמה איך נתפסת פקעית הצטמקות נצפתה כאשר perifused עם 8% BSA מוצג איור 3 א. הצטמקות זה משמש לאחר מכן כדי לקבוע את glomerular LpA / Vאני עבור כל פקעית (איור 3B). עכברים KO VEGF-A היה משמעותי מוגברת glomerular LpA / Vאני בגיל 14 שבועות להציב אינדוקציה VEGF-קו בהשוואה WT שליטה glomeruli. למרות התחתון בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, מוגברת glomerular LpA / Vאני לא סוכלה ע י ביטוי יתר של VEGF-A165b ב- 14 שבועות5.
צביעת PAS סעיפים קליפת הכלייה 14 שבועות לאחר אינדוקציה של VEGF-A קו שלא גילתה שום מומים מבניים glomerular בעכברים VEGF-A קו או VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (איור 4A). עם זאת, לאחר ניתוח של האולטרה-מבנה glomerular ויה EM, עכברים VEGF-A קו היה שפותחה על רוחב GBM גדל ירד מספר fenestrae אנדותל, ירד SPS כיסוי, עלה הממוצע podocyte חתך רוחב (איור 4C-4F ). כף הרגל podocyte הממוצע לעבד רוחב ומספר חריצים נותר ללא שינוי (איור 3B ו- 3g). ביטוי יתר של VEGF-A165b בעכברים VEGF-A KO מנעה את השינויים כדי GBM ולאחר חתך רוחב (איור 4C ו- 4F). עם זאת, VEGF-A165b לא היתה השפעה על fenestrae שינו את המספר של SPS כיסוי (איור 4D ו- 4E)5.
RT-PCR שבוצעה ב- RNA מופק sieved glomeruli גילה כי האדם VEGF-165לחצ mRNA קיים רק בעכברים VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (איור 5A). בעת חילוץ חלבון sieved glomeruli והערכה רמות חלבונים באמצעות סופג המערבי, ביטוי חלבונים glomerular של VEGFR-2 נמצאה הניתנות להפחתה בעכברים VEGF-A קו, אשר נמנעה על ידי ביטוי יתר של VEGF-A165b ( איור 5B ו- 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> איור 1. Diagrammatic הקים של המתקן glomerular חדירות (Lpא). (א) פקעית נתפס (ב') micropipette בתוך מחזיק באמצעות שאיבה, אשר היא להדק על הר ליציבות. (ג) microslide מלבני. (ד) 4 X מטרת מיקרוסקופ עם מצלמת וידאו. (ה) 1% פתרון BSA התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. (נ) 8% BSA פתרון התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. (G) מרחוק הקש על שורות המכילות perifusate שני לה להתנהגות, מה שמקנה exchange perifusate מהירה. המסלול (H) של perifusate לכיוון microslide, אשר לאחר מכן מתרחץ של פקעית. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> באיור 2. השתן אלבומין קריאטינין יחס. (א) הערכים uACR שבועות 0, 4, 10 ו- 14 לאחר אינדוקציה של VEGF-A KO בעכברים b165WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A. (ב') אותם ערכים uACR מנורמל לערך בסיסית (לשבוע 0) של כל עכבר בודדות. UACR גדל באופן משמעותי בעכברים VEGF-A KO שבועות 10 ו- 14 לעומת WT littermate שולט, אשר נמנעה בעכברים b165VEGF-A X Neph-VEGF-A (* p < 0.05; אנובה דו-כיווני, תיקון להשוואה בין זוגות; n = 4-12 עכברים לכל נקודת זמן; קווי שגיאה: שגיאת התקן של הממוצע [SEM]). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח5. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> איור 3. מידת חדירות מים glomerular. (א) פקעית נתפס. את micropipette באמצעות שאיבה; perifusate הוא החליף מ- 1% BSA (Ai) 8% BSA (כל), התכווצות glomerular נצפית. (B) מדידות נלקח לפני ואחרי הבורר BSA 8% משמשים כדי לקבוע את glomerular LpA / Vאני. (ג) עכברים VEGF-A KO לפתח של מוגברת glomerular LpA / Vאני בגיל 14 שבועות להציב אינדוקציה של VEGF-A קו לעומת WT שולט. זה לא היה משמעותי מנעה בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A, b165(* p < 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 4-9 עכברים, glomeruli 15-30; קווי שגיאה: SEM). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> באיור 4. ניתוח מבנה glomerular. (א) צביעת PAS של קליפת הכלייה לא מצביעים על חריגות מבנית ב glomeruli מ- WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A165b עכברים (Ai - iii). EM גילה מומים מבניים אולטרה ב glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (ב') FPW הממוצע לא השתנו בין קבוצות. (ג) ה GBM גדל glomeruli VEGF-A KO, אשר נמנעה על ידי VEGF-A165ב' (ד) מספר fenestrae ירדו ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נותרה שהודעה על ידי VEGF-A165 (E) נולד ב- SPS הכיסוי היתה ירידה ב VEGF-A KO glomeruli, אשר גם נשאר ללא שינוי על ידי VEGF-A165ב' (נ) הממוצע חתך רוחב הוגדל ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נמנעה על ידי VEGF-A165ב' (G) המספר שסע היה ללא שינוי בין שלוש הקבוצות (* p < 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 3 עכברים, 9 glomeruli; קווי שגיאה: SEM). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח5. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> איור 5. ביטוי mRNA וחלבון סמנים. (א) RT-PCR הראה כי הביטוי mRNA b165VEGF-A האנושי היה רק ניכר glomeruli sieved מ- VEGF-A קו X Neph-VEGF-A165b עכברים. (B) סופג המערבי ציין כי ביטוי חלבון VEGFR-2 היה למטה מוסדר ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נמנעה ב VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p < 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 3 - 6 עכברים; קווי שגיאה: SEM). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח5. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר של מחלת glomerular. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

assessment-of-kidney-function-in-mouse-models-of-glomerular-disease

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

17.4K Views.  University of Exeter. פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר של מחלת glomerular. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

Video: Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of cardiovascular disease. Although molecular biology is necessary in identifying key changes in the signaling pathway, it is not a surrogate for functional significance. While physiology can provide answers to the question of function, combining physiology with biochemical assessment of metabolites in the intact, beating heart allows for a complete picture of cardiac function and energetics. For years, our laboratory has utilized isolated heart perfusions combined with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to accomplish this task. Left ventricular function is assessed by Langendorff-mode isolated heart perfusions while cardiac energetics is measured by performing 31P magnetic resonance spectroscopy of the perfused hearts. With these techniques, indices of cardiac function in combination with levels of phosphocreatine and ATP can be measured simultaneously in beating hearts. Furthermore, these parameters can be monitored while physiologic or pathologic stressors are instituted. For example, ischemia/reperfusion or high workload challenge protocols can be adopted. The use of aortic banding or other models of cardiac pathology are apt as well. Regardless of the variants within the protocol, the functional and energetic significance of molecular modifications of transgenic mouse models can be adequately described, leading to new insights into the associated enzymatic and metabolic pathways. Therefore, 31P NMR spectroscopy in the isolated perfused heart is a valuable research technique in animal models of cardiovascular disease.

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Langendorff-mode isolated heart perfusion, in conjunction with 31P NMR spectroscopy, combines the fields of biochemistry and physiology into one experiment. The protocol allows for the dynamic measurement of high energy phosphate content and turnover in the heart while concurrently monitoring physiologic function. When performed correctly, this is a valuable technique in the assessment of cardiac energetics.

הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש 31 P NMR ספקטרוסקופיה

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Small animal magnetic resonance imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial tissue. The high heart rates of small animals (200 to 600 beats/min) have previously limited the role of CMR imaging. Small animal Look-Locker inversion recovery (SALLI) is a T1 mapping sequence for small animals to overcome this problem 1. T1 maps provide quantitative information about tissue alterations and contrast agent kinetics. It is also possible to detect diffuse myocardial processes such as interstitial fibrosis or edema 1-6. Furthermore, from a single set of image data, it is possible to examine heart function and myocardial scarring by generating cine and inversion recovery-prepared late gadolinium enhancement-type MR images 1.
	The presented video shows step-by-step the procedures to perform small animal CMR imaging. Here it is presented with a healthy Sprague-Dawley rat, however naturally it can be extended to different cardiac small animal models.

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Contrast enhanced cardiac magnetic resonance (CMR) imaging allows comprehensive in vivo assessment of the heart in small animal models of cardiovascular disease. Here we detail the procedures to perform CMR imaging, reconstruction and analysis using Small Animal Lock-Locker Inversion Recovery (SALLI) in rats.

הערכה של תפקוד לב ומורפולוגיה שריר הלב באמצעות שחזור קטן בעלי חיים תראו-הלבשה היפוך (SALLI) בדיקת MRI בחולדות

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

הערכה של מבנה הנכון חדרית ותפקוד בעכבר הדגם של תעוקת עורק ריאה על ידי Transthoracic אקו

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

הערכה של תפקוד כלי דם בחולים עם מחלת כליות כרונית

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

השתלת כליה עכבר: מודלים של דחיית השתל

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

שימוש ב- MRI שדה Ultra-גבוה במודלים של מכרסמים קטנים של מחלת כליות פוליציסטיות ל<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור phenotyping ותרופות

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

הערכת Transcutaneous של תפקוד כלייתי במכרסמי Conscious

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated measurements over weeks or months of accessory respiratory muscle activity while simultaneously measuring ventilation in a non-anesthetized, freely behaving mouse. The technique includes the surgical implantation of a radio transmitter and the insertion of electrode leads into the scalene and trapezius muscles to measure the electromyogram activity of these inspiratory muscles. Ventilation is measured by whole-body plethysmography, and animal movement is assessed by video and is synchronized with electromyogram activity. Measurements of muscle activity and ventilation in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are presented to show how this tool can be used to investigate how respiratory muscle activity changes over time and to assess the impact of muscle activity on ventilation. The described methods can easily be adapted to measure the activity of other muscles or to assess accessory respiratory muscle activity in additional mouse models of disease or injury.

This paper introduces a method for repeated measurements of ventilation and respiratory muscle activity in a freely behaving amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mouse model throughout disease progression with whole-body plethysmography and electromyography via an implanted telemetry device.

מדידה חוזרת של פעילות שרירי הנשימה ואת אוורור בעכברי מודל של המחלה שרירית

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively affect skeletal muscle. This can result in a loss of muscle mass (atrophy) and/or loss of muscle quality (reduced force per unit of muscle mass), both of which are prevalent in chronic disease, muscle-specific disease, immobilization, and aging (sarcopenia). Skeletal muscle function in animals can be evaluated by a range of different tests. All tests have limitations related to the physiological testing environment, and the selection of a specific test often depends on the nature of the experiments. Here, we describe an in vivo, non-invasive technique involving a helpful and easy assessment of force frequency-curve (FFC) in mice that can be performed on the same animal over time. This permits monitoring of disease progression and/or efficacy&#160;of a potential therapeutic treatment.

Measurement of rodent skeletal muscle contractile function is a useful tool that can be used to track disease progression as well as efficacy of therapeutic intervention. We describe here the non-invasive, in vivo assessment of the dorsiflexor muscles that can be repeated over time in the same mouse.

הערכה בלתי פולשני של תפקוד השרירים Dorsiflexor בעכברים

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש³¹ P NMR ספקטרוסקופיה

שיטה פשוטה של אינטובציה ריאות המאוסות

הערכה של תפקוד לב ומורפולוגיה שריר הלב באמצעות שחזור קטן בעלי חיים תראו-הלבשה היפוך (SALLI) בדיקת MRI בחולדות

הערכה של מבנה הנכון חדרית ותפקוד בעכבר הדגם של תעוקת עורק ריאה על ידי Transthoracic אקו

הערכה של תפקוד כלי דם בחולים עם מחלת כליות כרונית

השתלת כליה עכבר: מודלים של דחיית השתל

שימוש ב- MRI שדה Ultra-גבוה במודלים של מכרסמים קטנים של מחלת כליות פוליציסטיות ל

הערכת Transcutaneous של תפקוד כלייתי במכרסמי Conscious

מדידה חוזרת של פעילות שרירי הנשימה ואת אוורור בעכברי מודל של המחלה שרירית

הערכה בלתי פולשני של תפקוד השרירים Dorsiflexor בעכברים

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש 31 P NMR ספקטרוסקופיה

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

הערכה של תפקוד לב ומורפולוגיה שריר הלב באמצעות שחזור קטן בעלי חיים תראו-הלבשה היפוך (SALLI) בדיקת MRI בחולדות

הערכה של מבנה הנכון חדרית ותפקוד בעכבר הדגם של תעוקת עורק ריאה על ידי Transthoracic אקו

הערכה של תפקוד כלי דם בחולים עם מחלת כליות כרונית

השתלת כליה עכבר: מודלים של דחיית השתל

שימוש ב- MRI שדה Ultra-גבוה במודלים של מכרסמים קטנים של מחלת כליות פוליציסטיות ל

הערכת Transcutaneous של תפקוד כלייתי במכרסמי Conscious

מדידה חוזרת של פעילות שרירי הנשימה ואת אוורור בעכברי מודל של המחלה שרירית

הערכה בלתי פולשני של תפקוד השרירים Dorsiflexor בעכברים

הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש³¹ P NMR ספקטרוסקופיה

שיטה פשוטה של אינטובציה ריאות המאוסות