אנו מודים דניאל חן מ דיגיטלית וידאו הפקה צוות של בוכהולץ מהתיכון. סיוע בעריכת הוידאו. מחקר זה על תאי המשמר stomatal, פרוטאומיקס, גליקומיקס במעבדה חן היא נתמכה על ידי מענקים אותנו הקרן הלאומית למדע (0818051, 1158000 ו- 1412547). קונג Wenwen נתמך על ידי המועצה מלגה סין. ד ר Qiuying פאנג נתמך על ידי סין מלגת מועצה נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31570396).

1. גידול צמחים
<ol><li>לנבוט הגרעינים תערובת השתילה. לגדל צמחים בתוך תא הצמיחה של עוצמת האור של 140 µmol פוטונים מ'−2 s − 1 , של photoperiod של 8 שעות אור באורך 22 ° C ו- 16 h כהה ב 18 ° C 2 שבועות</li>
	<li>השתלת שתילים בגדלים דומים באופן אינדיבידואלי לתוך 4 סירים קוטר המכיל את האדמה ולגדול במשך 3 שבועות באותם התנאים נוספים שמתואר בשלב 1.1. הערה: מים צמחים עם ברז מים פעמיים בשבוע כדי לשמור על לחות הקרקע.</li>
</ol>2. הכנת הפיוניות מועשר
<ol><li>להסיר את העלים של צמחי לבנה א 5 - בן שבועיים בודדים עם אזמל.</li>
	<li>לצרף כל עלה שתי חתיכות של דבק ברורה, עם חתיכה אחת הקפדה על הצד (נמוך יותר) abaxial, החלק השני הקפדה על adaxial (עליון) בצד של העלה. עזוב את הקלטת על העלה עבור 5 s.</li>
	<li>עדין קליפת בנפרד שתי חתיכות של קלטות בעזרת האגודל והאצבע על כל יד כדי להפריד בין הצד abaxial עם המדרכה, משמר תאים, הצד adaxial עם תאים mesophyll.</li>
	<li>המקום קליפות מהצד abaxial של העלים ב 60 מ של הפיוניות פתיחת מאגר (50 מ"מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MES-KOH, מותאם pH 6.2 עם 1 מ' KOH) בגודל 40 מ מ × 12 מ מ פטרי מנות כפי שהם שנאספו.<ol>
<li>חזור על השלבים שלעיל עד כל מדגם קליפות נאספים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם את פטרי המכילות את קליפות אל החדר גדילה בתנאים אור הצהיר בשלב 1.1. להשאיר את קליפות תחת אור כבר שעתיים לחלוטין פתוח הפיוניות.</li>
	<li>המקום קליפות לתוך 150 מ מ x 20 מ מ פטרי המכילות 50 מ של דופן התא לעכל תערובת אנזימים (0.7% cellulase R-10, 0.025% macerozyme R-10, פוליוינילפירולידון 0.1% (w/v)-40 ו- 0.25% (w/v) שור אלבומין ב- 55% כתמיסה (0.55 מ' בסורביטול, 0.5 מ מ CaCl2, 0.5 מ מ MgCl2, חומצה אסקורבית 0.5 מ מ, 10 מיקרומטר ח'2PO4, 5 מ מ 4-morpholineethanesulfonic חומצה (MES) ב- pH 5.7 מותאם עם 1 מ' קו).</li>
	<li>לנער את קליפות על מטרף הדדיים בצלחת פטרי ב-50 סל ד כעשרים דקות.</li>
	<li>להסיר קליפות של אנזים פתרון עם פינצטה לאחר 20 דקות להעביר את קליפות 150 מ"מ x 20 מ"מ גודל פטרי המכילות 50 מ ל מים.</li>
	<li>באמצעות פיפטה העברה, לשטוף קליפות 15 s פעמיים עם 10 מ"ל של מים כדי להסיר כל פתרון אנזים שיורית.</li>
	<li>השתמש פינצטה כדי למקם את קליפות בצלחת פטרי בגודל 150 מ מ x 20 מ מ עם 50 מ של הפיוניות טריים פתיחת מאגר משמש בשלב 2.4. תקופת דגירה של h 1 בתנאי אור הצהיר בשלב 1.1 כדי לאפשר הפיוניות להתאושש.</li>
</ol>3. חומצה אבציסית (ABA) טיפול ואת וזמינותו תנועה הפיוניות
<ol><li>בצלחת פטרי בגודל 150 מ מ x 20 מ מ. דגירה של קליפות הפיוניות מועשר ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב 50 מ של המאגר הפתיחה stomatal או ב- 50 מ של המאגר הפתיחה stomatal עם ריכוז סופי של 10 מיקרומטר ABA הפעם הטיפול המתאים.</li>
	<li>במקום קליפות על מטרף ב-50 סל ד 5, 15, 30 דקות. לאחר כל מרווח הזמן להסיר את קליפת עם פינצטה, בצע את השלבים הדמיה בשלב 3.3.</li>
	<li>קח תמונות של הפיוניות לפני טיפול ABA, בנקודות זמן שונות לאחר טיפול ABA עם מיקרוסקופ אור.<ol>
<li>. קח את קליפת והנח אותו על משטח זכוכית מיקרוסקופ.</li>
		<li>למקם את השקופית על הבמה מיקרוסקופ ולהתאים את הבמה כך ניתן לאבחן את התמונה של קליפת.</li>
		<li>התאם את הקנס, כמובן המוקד על המיקרוסקופ כדי לקבל תמונה ברורה של תאי המשמר.</li>
		<li>לקחת כמה תמונות של הפיוניות מרובים בהגדלה X 40.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למדוד 60 פתחים stomatal משתמש ImageJ8.</li>
	<li>לחשב את שגיאת התקן והמשמעות -ערך-p < 0.05 את המידות צמצם stomatal 60.</li>
</ol>4. חלבון החילוץ והפרדה מרחביות-דף
<ol><li>לטחון את קליפות 15 s בחנקן נוזלי מספיק כדי לכסות את קליפות באמצעות ומכתש צוננת.</li>
	<li>לכל 50 קליפות, להוסיף 3 מ"ל של טריס רווי פנול (pH 8.8) 3 גרם חלבון החילוץ חיץ (0.9 M סוכרוז, 0.1 M טריס-HCl, 0.01 M EDTA, 0.4% מרקפטואתנול, 10 µL של מעכב פרוטאז, פוספטאז 1 מ"מ) עם פיפטה כדי המליטה ואז לטחון את קליפות של אילן גרינברג 5 דקות אינפורמטיבית בשכונה fume.</li>
	<li>להעביר את תמצית באמצעות פיפטה ואת קליפות באמצעות פינצטה מתכת כדי Oakridge צנטריפוגה tube להתסיס על מטרף ב-50 סל ד עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר את קליפות מהצינור צנטריפוגה Oakridge, centrifuge את התמצית ב g 5,000 x למשך 10 דקות. לאחר מכן העברה בעל תאים פנוליים השלב העליון צינור נקי מיקרו-צנטריפוגה באמצעות פיפטה.</li>
	<li>התמיסה פנול חילצה חלבונים על-ידי הוספת 5 כרכים של קרח אצטט אמוניום 0.1 M ב- 100% מתנול. מערבולת בקצרה דגירה בין לילה ב-20 ° C.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 20,000 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, decant את תגובת שיקוע על ידי לאט נשפכים זה הצינור ולשמר בגדר חלבון בצינור.</li>
	<li>לשטוף בגדר חלבון פעמיים עם 0.1 M אמוניום אצטט, מתנול, ולאחר מכן פעמיים עם אצטון 80% ופעם אחת עם אצטון 100% קר. הערה: מנקי נעשים על-ידי הוספת 10 מ"ל של ריאגנט מסוים הצינור של חלבון. להתסיס על מטרף ב-50 סל ד במשך 5 דקות, ואחריו צנטריפוגה ב g x 15,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ואז שופכים הכימית יצאה מהשפופרת שמירה רק בגדר חלבון.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של אצטון 100% קר בגדר והשהה מחדש על ידי לאט pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>להעביר ההשעיה חלבון באמצעות פיפטה שפופרת מיקרו-צנטרפוגה 2 mL ואז צנטריפוגה ב 20,000 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>להסיר אצטון על-ידי decanting זה מהצינור ויבש בגדר בשכונה fume למשך 10 דקות.</li>
	<li>להמיס החלבון של שפופרת מיקרו-צנטרפוגה עם µL 200 התפרקות מאגר (אוריאה 8 מ', 0.5% מרחביות, 30 מ מ טריס-HCl ב- pH 8.5) ו מערבולת במשך 30 דקות צנטריפוגה ב 20,000 g x-15 מעלות במשך 20 דקות ולאסוף תגובת שיקוע צינור חדש.</li>
	<li>לכמת את ריכוז חלבון בעקבות פרוטוקול כימות9חלבון.</li>
	<li>השתמש דגימות חלבון הפרדת חלבונים על ידי אלקטרופורזה בג'ל בעקבות פרוטוקול ה-10.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

משמר תאים הם מערכת מודל לימוד האות מנגנוני התמרה חושית בצמחים וזה חשוב לוודא כי הכנת דוגמאות השתמשו במחקר הוא המתאים ביותר כדי לענות על שאלות ביולוגיות. למרות העניין הגובר והולך משמר תאים בתוך קהילת המחקר צמח, יש אין שיטה אוניברסלית באיך להכין stomatal תאי המשמר שיאפשר תנועה stomatal והן פיזיולוג...

הפיוניות יש תפקיד חשוב ב פיזיולוגיה והכושר הכללי של צמחים. מבנים ספציפיים אלה צמח זעיר נוצרות על ידי שני תאים באפידרמיס מיוחדים המכונה תאי המשמר, מצויים בשפע ביותר על פני השטח abaxial של עלים. הפיוניות נחוצים לצורך עסקת חילופי גזים בין הצמח, האווירה, כמו גם השליטה של אובדן מים באמצעות דיות. תאי המשמר לווסת את הפיוניות צמצם באמצעות שילוב בין חיצוניים שונים (למשל, אור, לחות, קשר הפתוגן, רמות פחמן דו-חמצני) ופנימיים (למשל., הורמונים אנדוגניים) גירויים1,2. ב-20 השנים האחרונות, סוג התא הזה הפך מערכת מודל עבור תא לומד איתות תהליכים במפעלים. תאים אלה מהווים חלק קטן של התאים הכולל עלה; לפיכך, לחקור שלהם סלולרי ייחודי, מאפייני הביוכימי והמולקולרי בצורה מתא בודד, יש צורך לבודד אותם מכל סוגי תאים אחרים עלה. בעבר, מחקרים משמר תא יש לעיתים קרובות מעורבים הכנת משמר תא protoplasts (GCP)3,4,5. זה בדרך כלל דורשת השימוש בכמויות גדולות של דופן התא משפילים אנזימים ו/או שיבושים מכניים באמצעות מיזוג, הוכיחה להיות יקר וארוך כמו בדרך כלל זה לוקח שעות רבות כדי להכין מדגם GCP, לעתים קרובות פעמים עם תשואה קטנה. וחשוב מכך, כי תאי המשמר לשמש מלאה זוגות כדי לווסת את הפיוניות הצמצם, ניתן לראות את השימוש GCP כמערכת מלאכותי ללמוד איתות התא משמר.
. הנה, פיתחנו שיטה להכין הפיוניות בו תאי המשמר שלם מועשרים, לשמור על תגובות פיזיולוגיות לגירויים. שיטה זו בהשראת שיטה שבה השתמשת כדי לבודד mesophyll תא protoplasts6,7. בשיטה שלנו, הפיוניות מוכנות תוך שימוש ברור דבק להפריד תחילה את רוב התאים mesophyll מחובר השכבה adaxial של העלה מהשכבה abaxial המכילות את המדרכה ואת משמר תאים. פעולה זו מתבצעת על ידי הדבקות נייר-דבק לשני הצדדים של העלה פילינג אותם בנפרד. התאים מהשכבה abaxial מותר לשחזר תחת אור במאגר פתיחת הפיוניות. מאוחר יותר תאים המדרכה מוסרות באמצעות כמות קטנה של דופן התא משפילים אנזימים, משאיר מאחורי תא משמר כי הם מועשרים בקלטת.
בשיטה זו פשוטה, התאים משמר stomatal כי הן קיימא מגיב יכולים במהירות, ביעילות תהיה מוכן, לוקח פחות משעה להשיג מועשר בתאי המשמר stomatal מקליפות 50 בעלות מינימלית. השיטה כאן מטיל פחות נזק לתאי הצמח מאשר שיטות קודמות איפה protoplasts מוכנים. בנוסף, החומרים נאספו מ כמויות חלבון רצויה זו שיטת התשואה. והכי חשוב, כי העלה שלא עובר מיזוג או עיכול ממושך פעמים ותאים משמר נותרו ללא פגע, תוצאות ללמודי הדוק יותר יהיו רלוונטיים לזה של הביולוגיה של התא משמר טבעי. בשיטה זו, תנועות stomatal ישויך בזמן אמת עם שינויים ברמה המולקולרית. לפיכך, הידע שנרכש ממחקרים בשיטה זו הכנה יהיה חשוב להבנה מקיפה יותר של איתות התא משמר.
השתמשנו הצמח תודרנית לבנה כמודל; אולם פרוטוקול זה ניתן ליישם את העשרת של stomatal תאי המשמר מינים אחרים כגון כרוב napus עם שינויים קטנים בזמן העיכול. מהווה הוכחה של המושג, הראו כי תאי המשמר stomatal מועשר באמצעות שיטה זו הם קיימא מגיב לגירויים כפי שמוצג על ידי fluorescein diacetate (FDA) assay לימודי ניצול של חומצה אבציסית הורמון צמחי (ABA), בהתאמה. בנוסף, הראו כי חלבונים באיכות גבוהה יכול להיות מבודד תאים אלה משמר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט של תהליך זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

המחקר של תאי המשמר חיוני הידע של תרומות ספציפיות מסוג זה תא לתפקוד הכללי של צמחים. עם זאת, לעתים קרובות קשה לבודד, וכך לומד אותם לעתים קרובות מספק אתגר.
מחקר זה יוצר שיטת העשרה תא המשמר stomatal. הפרוטוקול מנצל דבק בידוד תאי המשמר ולחלץ חלבונים מהתאים. שיטה זו משפרת את תקינות ואת התשואה של משמר תא במהלך בידוד ומספק מדגם אמין לחקר תהליכי איתות התא, איך הם תשבחות פנוטיפים התנועה stomatal. בשיטה זו, העלים צמח למחיצות בין שני חלקים של הקלטת, קלוף לחתיכות כדי להסיר את הצד abaxial. פרוטוקול זה הוחל על רקמת העלה תודרנית בידוד תאי המשמר. התאים טופלו עם fluorescein diacetate (FDA) כדי לקבוע את יכולת הקיום ועם חומצה אבציסית (ABA) כדי להעריך את הפיוניות התנועה בתגובה ABA. לסיכום, פרוטוקול זה מוכיח שימושי עבור הכנת תאי המשמר stomatal מועשר ובידוד חלבונים. איכות תאים וחלבונים מתקבל כאן אפשר פיזיולוגיים, מחקרים ביולוגיים אחרים.

תמונת הנציגה של תודרנית לשמור תאים לפני ואחרי עיכול של mesophyll, תאים אפידרמיס מוצג באיור1. תא משמר הכדאיות לפני ואחרי הסרת mesophyll, תאים אפידרמיס ניתן לצפות באמצעות ה-FDA כדי למדוד פעילות אנזימטי ותקינות קרום התא (איור 1B וד' 1). <strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנת מועשר בתאי המשמר stomatal שימושי עבור מחקרים ביולוגיים פיזיולוגיים ואחרים.

הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

stomata-tape-peel-an-improved-method-for-guard-cell-sample-preparation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Views.  University of Florida. פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנת מועשר בתאי המשמר stomatal שימושי עבור מחקרים ביולוגיים פיזיולוגיים ואחרים.

Video: Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

העצרת, טוען, ואת המערך של תא ultracentrifuge אנליטית לדוגמא

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים<em&gt; דרוזופילה</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...