אנו מודים לתוכנית הדוקטורט החיים מולקולרית (MOBI), המחלקה לביולוגיה-התיכון טנסי המדינה האוניברסיטה (MTSU) על מתן המימון למחקר זה. הפרויקט גם מומן בחלקו על ידי מענק לפרויקטים מיוחדים מוענק D.E.N. על ידי קרן MTSU.

הערה: neoformans ג . חיידק אבטחה ברמה 2 (BSL-2), בעובדים לזה לנקוט אמצעי זהירות נאותה. נהלים מפורטים על איך כדי בבטחה בעבודה עם פתוגנים BSL-2 ניתן למצוא באתר המרכז לבקרת מחלות של (CDC) באתר, אך חשוב לציין כי כל אדם לבוא במגע עם neoformans ג כראוי בקיצור בטיפול סוכני פתוגניים, רצוי שתלבש המתאים ציוד מגן אישי (PPE), בדרך כלל לטקס או nitrile כפפות. עוד יותר, רוטורים-צנטריפוגות צריך להחתם כדי למנוע חשוד דגימות ונוזלים יש לנקות באופן מיידי באמצעות פתרון של 10% מלבין28.
1. אינדוקציה כמוסה
הערה: כל השלבים צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר אלא אם נכתב אחרת.
<ol><li>תרבות neoformans ג בשמרים peptone דקסטרוז (YPD) מרק (pH 6.5 + /-0.2), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות עד שהם נמצאים בשלב של יומן (כ ח 18-36).</li>
	<li>צנטריפוגה תאים ב x 870 g למשך 5 דקות ב 21 ° C, לשטוף שלוש פעמים בתמיסת פוספט buffered (PBS).</li>
	<li>השתמש של hemocytometer (או מונה הניתן תא אוטומטית) כדי למנות את התאים resuspend ב 2 x 105 תאים/2 מ ל תקשורתי חיוני מזערי של Dulbecco (DMEM).</li>
	<li>כדי לעודד את הקפסולה, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 18 h. הערה: השילוב של העדר של חומרים מזינים בתקשורת ואת נוכחותם של CO2 מגרה צמיחה כמוסה neoformans ג .</li>
	<li>שלאחר הדגירה, לקצור את התאים על ידי צריך שתוציאו (לעיל) והסרה של כל 5-10 µL supernatant. במקביל, לקצור מדגם האו ם המושרה תא המתאימים עבור כל זן שברצונך למדוד. להשתמש כפקדים שלילי. הערה: כדורי התא יהיה קטן מאוד, עלול להיות קשה לראות. היה זהיר בעת כ רפה בעברית תגובת שיקוע.</li>
	<li>כתם דיו הודו (סעיף 2.1) או צבעי פלורסנט (סעיף 2.2).</li>
</ol>2. צביעת
<ol><li>
צביעת עם רק אינדיה אינק
	<ol>
<li>כדי להכתים את השמרים עם דיו הודו, resuspend בגדר, תגובת שיקוע הנותרים ולהוסיף 4μL (בערך חצי) של הבולם תא, 4μL של הודו דיו על זכוכית מיקרוסקופ. בעדינות לערבב ולהימנע קצף.</li>
		<li>החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לסגור קצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת עם רק צבעי פלורסנט
	<ol>
<li>כתם השמרים עם צבע פלורסנט-resuspend בגדר תא ב- PBS µL 50 עם 1% אלבומין שור (BSA).</li>
		<li>דגירה התרבות עם אמצעי אחסון שווה של Calcofluor לבן (CFW) (1 µg/mL), mAb כמוסה 18B7 (ראה טבלה של חומרים) מצומדת כדי AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) במשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>צנטריפוגה תאים ב x 870 g למשך 5 דקות ב 21 ° C שלאחר הדגירה, תשאף תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend תא גלולה ב- PBS 10 µL עם 1% אלבומין שור (BSA).</li>
		<li>פיפטה 8 µL של התא השעיה על זכוכית מיקרוסקופ.</li>
		<li>החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לסגור קצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט
	<ol>
<li>להשוות יותר ישירות את היעילות של דיו הודו מכתים לזה של צבעי פלורסנט, שיתוף כתם האוכלוסייה באותו תא עם שני סוגים של הכתם. לשם כך, תחילה תדגור תאים עם הקפסולה פלורסנט והן הכתם דופן התא, לפי שלבים 2.2.1 - 2.2.3</li>
		<li>בשלב הבא, פיפטה נפחים שווים (4 µL) של תא fluorescently ויטראז'ים ההשעיה, דיות על זכוכית. מערבבים בעדינות.</li>
		<li>החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לאטום את הקצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. התמונה רכישה/מיקרוסקופ
<ol><li>
הדמיה תאים מוכתמים אינדיה אינק.
	<ol>
<li>לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל (100 X הגדלה).</li>
		<li>תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי. הערה: מספר התאים לכל שדה ישתנו, זה מקובל. חשוב, עם זאת, חופפים את התאים להישמר לכל הפחות, כמו אלה שקשה למדוד (הן באופן ידני והן עם תוכנה אוטומטית). לניסויים אלה, נרכשו תמונות בעומק של 16 סיביות עם פעמים חשיפה ממוטבת כדי למקסם את הניגוד בתמונה תוך מזעור הטשטוש הנגרמת על ידי תנועות קטנות של התאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדמיה תאים צבעונית עם צבעי פלורסנט
	<ol>
<li>כדי דמות בתאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, פתח המיקרוסקופ תוכנות ליצירת תמונות ובחר המתאימים עירור, פליטה אורכי הגל עבור fluorophores בשימוש (CFW ו AF488 מתרגשים באמצעות 405nm את האורות 488 ננומטר, בהתאמה). לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ זריחה.</li>
		<li>תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי. הערה: מספר התאים לכל שדה ישתנו, זה מקובל. חשוב, עם זאת, חופפים את התאים להישמר לפחות כמו אלה שקשה למדוד (הן באופן ידני והן עם תוכנה אוטומטית).</li>
		<li>רוכשים סדרת תמונות z-מחסנית התאים כדי להבטיח כי הקוטר קפסולה המרבי עבור כל תא בתוך שדה נתון מתקבל.<ol>
<li>תוכנת שליטה של מיקרוסקופ, לחץ על שורת "z-מחסנית" כדי לפתוח את לוח הבקרה "z-מחסנית", ולאחר מכן בחר באפשרות "ראשון/אחרון" בפינה השמאלית העליונה של החלונית.</li>
			<li>השתמש הפקד בסדר-המוקד על המיקרוסקופ להתמקד ברמה שמתחת הרחב של תא יחיד שמרים, הקפסולות עבור כל בתוך שדה הראייה הנוכחי, לחץ על "הגדר הראשונה".</li>
			<li>להשתמש בפקד מיקוד פיין להתמקד מעל לנקודת הרחב ביותר של גוף התא באותו התא, של הקפסולה עבור כל התאים בתוך שדה הראייה הנוכחי ולחץ על "קבע אתמול".</li>
			<li>לאחר מכן, לחץ על "להתחיל ניסוי" בכרטיסיה "רכישת" לרכוש המחסנית-z עבור המיקום הנוכחי. חזור על התהליך-תפקידים מרובים עד z-אוסף תמונות של מינימום של 50 תאים להיות רכש. הערה: לניסויים אלה, חריר קונאפוקלית נקבע ל- 1.0, AU ו- z-סדרות חופפים של 10-20 פרוסות כיסוי 0.7 מיקרומטר נרכשו על המיקומים שנבחרו. AU = יחידת אוורירי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בשלב הבא, להמיר כל סדרה z-מחסנית לתחזיות העוצמה המקסימלית (MIP) באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה. הערה: מיליוני הוראות בשניה פרוייקט העוצמה הגבוהה ביותר-כל המטוס של תמונה מוערמים29. יצירת מיליוני הוראות בשניה מאפשרת לייצר ייצוג דו-ממדי של תמונות התואמות התאים המרבי, קוטר כמוסה בתוך הערימה תלת-ממד שנלכדו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדמיה תאים צבעונית עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט
	<ol>
<li>לרכוש תמונות באמצעות widefield (40 X הגדלה) או מיקרוסקופ קונפוקלי (63 X או 100 X הגדלה). עבור תאים צבעונית עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט, לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ widefield מצויידים הבמה מבוקרת מחשב, שמן טבילה אובייקטיבי. הערה: המיקרוסקופ בשימוש צריך להיות נשלט באמצעות תוכנת הדמיה של CFW. קרינה פלואורסצנטית נרגש דרך מסנן עירור 340-380 nm, ויש הנפלטים אור שיזוהו דרך מסנן מכשול nm 435-485 שמשתקף במראה ודיקרואיק זוהר 400 ננומטר. זריחה AF488 יכול להיות שמחים דרך מסנן עירור 465-495 ננומטר, האור הנפלט יכול להתגלות דרך מסנן מכשול nm 515-555 שמשתקף במראה ודיקרואיק זוהר 505-nm.</li>
		<li>תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי עבור כל שיטת ההגדלה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ידני מדידה של קפסולה
<ol><li>עבור תאים צבעונית עם דיו הודו או כתמים פלורסנט, להשתמש תוכנת המדידה תא כדי באופן ידני למדוד כמוסה ותא קוטר (ראה טבלה של חומרים). כדי לעשות זאת, עבור אל 'קובץ' > 'פתח תמונה' > "מדידה" ושימוש הסמן כדי לצייר קו ישר דרך נקודת הרחב ביותר של התא כולו (קוטר סה כ).</li>
	<li>לאחר מכן, לחץ שוב על "מידה", לצייר קו ישר דרך הגוף תא (גוף התא קוטר). הערה: מדידות הם שנשמר באופן אוטומטי אל התאים.</li>
	<li>חזור על תהליך זה עבור כל התאים (מינימום של 50/קבוצה).</li>
	<li>כדי לשמור תמונות, ברגע שהם נמדדים, לחץ על "קובץ" > "שמירה בשם" ותן שם את התמונות כראוי.</li>
	<li>בחר את הקבצים לאחרונה נמדד, ייצוא נתונים לתוכנת הגיליון האלקטרוני.</li>
	<li>לחשב את הקוטר קפסולה הממוצע באמצעות המשוואה: ([קוטר הכולל] - [גוף התא קוטר]).</li>
</ol>5. ממוכנות מדידה של קפסולה
הערה: למדידה אוטומטית מוצלחת, להשתמש בתמונות 16 סיביות עם רמה גבוהה של ניגוד, אשר מתמקדים כראוי יחד עם תוכנה ניתוח התמונה המתאימה (ראה טבלה של חומרים). כאשר הדמיה neoformans ג למדידה קפסולה, חשוב להתמקד על הטבעת כהה על הגבול בין התא לבין כמוסה. פעולה זו מאפשרת לתוכנה כראוי ניסחו את התא ואת כמוסה.
<ol><li>היפוך וליצור עותק של כל הודו דיו צבעונית תא תמונות בעזרת תוכנה לעריכת תמונות המתאימות (ראה טבלה של חומרים). כדי לעשות זאת, לחץ על 'קובץ' > 'פתח' כדי לפתוח הודו דיו צבעונית תמונות ולאחר מכן "לשלוט" + "אני" כדי להפוך את התמונה. לחץ על "קובץ" > "שמירה בשם" כדי לשמור את התמונה ההפוכה.</li>
	<li>כדי לייבא המקורי והן הפוך תמונות לתוך התוכנה לחץ על "קובץ" > "רצף לייבא" > "טען תמונה" > "הגדרת רצף (ידנית)" > "מידות (ערוץ)" > "יבא" > "החל". הערה: neoformans ג תא וגופי קפסולות ניתן לזהות, רעולי פנים באמצעות אלגוריתמים מסוימים - המכונה 'מתכונים' - המצורף לתוכנה.</li>
	<li>להשתמש במתכון "מנתח המושבה (זריחה)" על התמונה הפוכה לשם זיהוי של מסיכה בגוף התא ולאחר מכן לחץ על "החל". בתמונה ההפוכה, הטבעת כהה את הגבול של התא neoformans ג הופך בהיר יותר הקפסולה שמסביב.</li>
	<li>להשתמש במתכון "מנתח המושבה (זריחה)" על התמונה הפוכה כדי לפלח את הגופות תא neoformans ג מ קפסולות שלהם ולאחר מכן לחץ על "החל". זה יוצר מסכה ספירה. שינוי שם מסיכה זו ספירת "גוף התא" בלחיצה ימנית על הכרטיסיה בשם "ספירת המסכה". הערה: המתכון מורכב של מספר תמונות צעדים עיבוד: רקע להסרת, זיהוי אובייקט, האובייקט ההפרדה וסינון משנה.</li>
	<li>הבא, להשתמש במתכון "התפשטות תאים" על התמונה המקורית ויוכל להסתיר את הקפסולה ולאחר לחץ על "החל". זה יוצר מסכה ספירה. שינוי שם מסיכה זו ספירת "קפסולה" בלחיצה ימנית על הכרטיסיה בשם "ספירת המסכה".</li>
	<li>באמצעות את המתכון, 'כמוסת מחיצה', ליצור מסכה חדשה על גבי התמונה המקורית מחיצות קפסולות סמוכים אחד מהשני. כדי לעשות זאת, לחץ על "הקפסולה מחיצה" מתוך התפריט הנפתח מתכון. בתיבה מחיצה כמוסה, לבחור המסכה ספירת עכשיו ששמן שונה "(5.5)" קפסולה עבור אזור כמוסה. בחר המסכה ספירת עכשיו ששמם "גוף התא" אנוסים תאים (5.4). לבחור "אורגינל" עבור ערוץ קלט, ו- "יצירת מסכת קפסולה Partitioned. לחץ על "החל הערה: המתכון יוצר התא ואת קוטר קפסולה, המוגדר כממוצע של הצירים הארוכים והקצרים מעבר למרכז של התא, כמוסה, וכן אזור מדידות של זיהוי מסכות. למצוא את הפלט הממוקמים תחת הכרטיסיה גיליון אלקטרוני בתוכנה זו. חזור על תהליך זה עבור כל התמונות (מינימום של 50 תאים/קבוצה). הפרמטרים של המתכון יכול להיות מכוון כדי למטב את גילוי של תמונות בודדות או אופטימיזציה עבור איתור אצווה של תמונות מרובות. מדידות נוספות ניתן לחשב לפי מתכון ואפיון מקיף של התא לבין המורפולוגיה של הקפסולה.</li>
	<li>ייצוא נתונים לתוכנת הגיליון האלקטרוני של בחירה עבור ניתוח נוסף.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+life+of+Cryptococcus+neoformans.">The intracellular life of Cryptococcus neoformans.</a> Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).</li><li>Rajasingham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+disease+of+HIV-associated+cryptococcal+meningitis:+an+updated+analysis.">Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis.</a> Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).</li><li>Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+infections+in+HIV/AIDS.">Fungal infections in HIV/AIDS.</a> Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crisis+in+Infectious+Diseases:+2+Decades+Later.">Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later.</a> Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).</li><li>McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).</li><li>Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+versus+alternative+macrophage+activation:+the+Ying+and+the+Yang+in+host+defense+against+pulmonary+fungal+infections.">Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+and+melanin+formation+as+indicators+of+virulence+in+Cryptococcus+neoformans.">Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans.</a> Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).</li><li>Vecchiarelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+immunological+function+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).</li><li>Murphy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cryptococcal+antigens+on+cell-mediated+immunity.">Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity.</a> Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).</li><li>Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+structure+of+glucuronoxylomannan+in+isolates+from+patients+with+recurrent+cryptococcal+meningitis.">Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis.</a> Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).</li><li>Collins, H. L., Bancroft, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Cryptococcus+neoformans+impairs+antigen-specific+T-cell+responses.">Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses.</a> Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).</li><li>Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+sizes+of+Cryptococcus+neoformans+capsular+polysaccharide+on+phagocytosis.">Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis.</a> Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+ex+vivo+capsule+size+is+associated+with+intracranial+pressure+and+host+immune+response+in+HIV-associated+cryptococcal+meningitis.">Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+behavior+of+capsule+enlargement+by+Cryptococcus+neoformans.">Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).</li><li>O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+a+sword+and+a+shield.">The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield.</a> Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).</li><li>McClelland, E. E., Smith, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+specific+differences+in+the+immune+response+to+infection.">Gender specific differences in the immune response to infection.</a> Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).</li><li>McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+virulence+factor+expression+to+evolved+virulence+in+mouse-passaged+Cryptococcus+neoformans+lines.">Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines.</a> Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+capsule+growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+mammalian+serum+and+CO(2).">Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2).</a> Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).</li><li>Vartivarian, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cryptococcal+capsular+polysaccharide+by+iron.">Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron.</a> J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).</li><li>McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsule+structural+heterogeneity+and+antigenic+variation+in+Cryptococcus+neoformans.">Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).</li><li>Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+capsule+structure+evolution+in+vitro+and+during+murine+infection.">Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection.</a> Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).</li><li>Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).</li><li>Pontes, B., Frases, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+lessons+from+the+use+of+optical+tweezers+and+other+biophysical+tools.">The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools.</a> Front Microbiol. 6, 640 (2015).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+gene+expression+in+individual+cells+and+cell+compartments.">Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments.</a> J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).</li><li>Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+processing+and+analysis+of+dynamic+fluorescence+image+data.">Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data.</a> Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).</li><li>Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+live+cell+images:+Methods,+tools+and+opportunities.">Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities.</a> Methods. , 65-79 (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).</li><li>Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+intensity+projection+using+bidirectional+compositing+with+block+skipping.">Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping.</a> J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).</li><li>Janbon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+and+transcriptome+of+Cryptococcus+neoformans+var.+grubii+reveals+complex+RNA+expression+and+microevolution+leading+to+virulence+attenuation.">Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).</li><li>Bisson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

המחבר, Hoyin לאי, הוא מנהל המוצר ב DRVision אשר מפרסם התוכנה ניתוח התמונה האוטומטי, Aivia.

במשך עשרות שנים, כבר הקפסולה והמוקד העיקרי של המחקר הן mycologists והן קלינאים מעוניין neoformans ג cryptococcosis בשל תפקידה כגורם מרכזי התקפה אלימה על המחלה. באמצעות מיקרוסקופ כדי למדוד את ההבדלים בגודל קפסולה בין זנים, תחת גידול שונים תנאים יכול לספק מידע חשוב על המחלה ועל התגובות לגירויים שונים (<em...

משפיע על רבע מיליון אנשים כל שנה, וכתוצאה מכך 180,000 יותר מקרי מוות מדי שנה, קריפטוקוקוס neoformans הוא שמרים פתוגניים, תאיים, סוכן סיבתי של cryptococcosis1,2, 3. שנפגעו הם חולי HIV-חיוביות במדינות עניות שאין להם גישה מוכן לטיפול תרופתי, עושים אותם רגישים בחריפות המחלה4,5,6. נתוני ה-CDC מציינים כי ב אפריקה שמדרום לסהרה, neoformans ג הורג יותר אנשים שחפת מדי שנה, יותר מדי חודש יותר מכל התפרצות אבולה רשומה1. תוואי החשיפה השכיחה ביותר מתרחשת משאיפת נבגים מיובש השגורה הסביבה7. עם כניסתו אל הריאות, ישנם מספר גורמים התקפה אלימה אשר תורמים להצלחת neoformans ג בתוך אנשים נגועים. הקפסולה רב-סוכר נחשבת הגורם של החיידק העיקרי התקפה אלימה, כמו זנים acapsular אינן מידבק8.
הקפסולה cryptococcal מורכבת של שלושה מרכיבים עיקרון: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), ו- mannoproteins (MPs)9. בעוד MPs הם קלים יחסית רכיב הקשורים דופן התא של הקפסולה, הם immunogenic, יכול לקדם מענה בעיקר פרו דלקתיים9,10. לעומת זאת, GXM ו GalXM לעשות את החלק הארי של הקפסולה (> 90% לפי משקל) ויש תופעות לדיכוי המערכת החיסונית11. בנוסף השפעותיו immunomodulatory, הגדלה מהירה של ה קפסולה ויוו יוצר מחסום מכני בליעה על ידי המארח תאים phagocytic (קרי, נויטרופילים ומקרופגים)12. הקפסולה neoformans ג ו הסינתזה שלו הם מורכבים, אבל באופן כללי, הגדלת קוטר קפסולה הוא מתואם עם התקפה אלימה מוגברת6,13,14. נתון זה, חשוב לחוקרים neoformans ג שניתן יהיה במהירות ובדייקנות לכמת מדידות כמוסה.
תא neoformans ג והן כמוסה רב-סוכר שלה הם מבנים דינמיים ולהראות שינויים לאורך זמן15. הקפסולה יכול שינוי צפיפות, בגודל הרכבה בתגובה לשינויים17,1816,סביבת המחשב המארח. ברזל נמוך או רמות מזין, חשיפה סרום, ה-pH אנושי פיזיולוגי ו CO מוגבר2 ידועים ליזום צמיחה קפסולה16,18,19,20. יתרה מזאת, חוקרים יש הראו שינויים מבניים וכתוצאה מכך הבדלים משמעותיים immunoreactivity במהלך זיהום, ההלוואות יתרון כדי neoformans ג על המארח שלו21,22. דבר זה ידוע כי הארכיטקטורה של הקפסולה neoformans ג נותחה במגוון דרכים. מיקרוסקופ אלקטרונים, לדוגמה, חשפה כי הקפסולה יש מטריצה הטרוגנית עם שכבת צפיפות אלקטרונים הפנימית מתחת לשכבה החיצונית, יותר חדיר23. פיזור אור ושימוש של מלקחיים אופטיים אפשרו החוקרים להבהיר עוד יותר את מאפייני macromolecular24. ניתוח התוצאות של שתי מדידות פיזור אור סטטיים ודינמיים, אנו יודעים כי הקפסולה רב-סוכר יש מורכבות מסעף מבנה23. מלקחיים אופטיים שימשו כדי לבחון את הנוקשות של המבנה, כמו גם להעריך את תגובתיות של נוגדן24. אולם, ניתוח מועסקים לעיתים קרובות ביותר של הקפסולה neoformans ג הוא מידת גודלו.
כדי לכמת את גודל קפסולה, חוקרים משתמשים מה צריך להיות מדידה פשוטה: הקוטר ליניארי של הקפסולה. מיקרוסקופ דיגיטלי משמשים כדי ללכוד תמונות של neoformans ג מספר תאים (בדרך כלל מאות) צבעונית עם דיו הודו או צבעי פלורסנט. הגודל של כל תא בגוף, כמוסה שמסביב נמדד. הנתונים נאספים, קוטר ממוצע של הקפסולה מחושבת על-ידי חיסור הקוטר לגוף התא של הקוטר התא כולו (תאי גוף + כמוסה). עד לנקודה זו, מדידות אלה נעשו באופן ידני. בעוד בדרך כלל מדויק, בשיטה זו יש חסרונות לחוקרים. ערכות נתונים גדולות יכול לקחת ימים או אפילו שבועות כדי לנתח באופן ידני. כי מדידות אלה נעשים באופן ידני, סובייקטיביות, טעות אנוש משפיעה על התוצאה.
ניתוח אוטומטיות תמונות חישובית הפך כלי הכרחי עבור חוקרים בתחומים רבים של ביולוגיה מולקולרית של התא, המאפשר ניתוח מהיר ואמין יותר של תמונות ביולוגי 25,26,27. טכניקות ניתוח תמונה מדויקת יש צורך לכרות כמותיים של מה הם לעיתים קרובות ערכות נתונים מורכב ועמוק. עם זאת, כמה מדידות, במיוחד את המדידה של הקפסולה ג neoformans , היה קשה להפוך לאוטומטי. זיהוי במדויק את הממשק בין התא לבין קפסולה, אשר בדרך כלל מופיע כעיגול כהה כאשר צילמו על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, יכול להיות בעייתי לפתור באמצעות סף פשוטה. יתרה מזו, neoformans ג תאים בתרבות נוטים להתאחד ואת פילוח מדויק של התאים הוא הכרחי עבור מדידות מדויקות.
מטרת הפרויקט היתה להמחשת (i) אחד מהפרוטוקולים סטנדרטי עבור אינדוקציה קפסולה ב neoformans ג, (ii) השוואה וחדות אינדיה אינק ולפתח פלורסצנטיות צביעת דגים קפסולת מידות קוטר, (iii) פשוט, שיטות למדידת קוטר הקפסולה באמצעות תמונות של הודו דיו צבעונית תאים באמצעות ניתוח תמונה של התוכנה, ו, (iv) להעריך על יתרונותיה וחסרונותיה של מדידת קוטר קפסולה באופן ידני באמצעות תוכנה אוטומציה. לנו למצוא את זה אחת מהשיטות מכתימים שני, פלורסנט תיוג של דופן התא, כמוסה, בעוד אורכת זמן רב, סיפק את התוצאות הכי עקבי בין ניסויים. עם זאת, שתי השיטות אפשרו לנו להבחין בהצלחה בין מעבדה קלינית neoformans ג זנים מפגין אחר קפסולת גדלים. יתר על כן, הצלחנו להפוך לאוטומטי את המדידה של קוטר קפסולה של הודו דיו צבעונית תמונות גיליתי שזו אלטרנטיבה מעשית מדידה ידנית של הקפסולה.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Induction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. neoformans cells&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&amp;nbsp; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td></tr><tr><td>DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Falcon</td><td>CL5335-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td>MaxQ6000</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend XTR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>India ink</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-910-56</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td><td></td><td></td><td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td></td><td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Corning</td><td>2855-18</td><td>#1.5 thickness</td></tr><tr><td>Clear nail polish or other non-toxic sealant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Image Acquisition&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Cargille&amp;nbsp;</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope with immersion oil objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td></tr><tr><td>Light microscope camera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td></tr><tr><td>Confocal microscope with oil immersion objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope software</td><td>Zen 2009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope camera</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Widefield imaging software</td><td>Nikon Elements (Nikon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Measurement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image editing software</td><td>Photoshop (Adobe)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software for manual measurement</td><td>Axiovision (Carl Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software for automated meesurement</td><td>Aivia (DRVision Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Excel (Microsoft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

הקפסולה רב-סוכר של קריפטוקוקוס neoformans היא הגורם העיקרי התקפה אלימה ולמד ביותר בדרך כלל ההיבטים של שמרים החולני הזה. גודל קפסולה יכולה להשתנות בין זנים, יש את היכולת לצמוח במהירות כאשר הציג בפני תנאים מזין מלחיץ או נמוך, יש כבר בקורלציה חיובית עם זן התקפה אלימה. מסיבות אלו, הגודל של הקפסולה הוא עניין רב לחוקרים neoformans ג . הצמיחה של הקפסולה ג neoformans הנגרמת במהלך הבדיקה פנוטיפי כדי לעזור להבין את ההשפעות של טיפולים שונים על שמרים או גודל ההבדלים בין זנים. כאן נתאר באחת השיטות סטנדרטי של קפסולה אינדוקציה והשווה שני המקובלים שיטות של צביעת ומדידת קוטר קפסולה: אינדיה אינק (i), כתם שלילי, בשימוש יחד עם מיקרוסקופ אור קונבנציונלי ו (ii) שיתוף מכתים עם צבעי פלורסנט הן של דופן התא והן את הקפסולה ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית. לבסוף, אנו מראים איך מדידה של קוטר קפסולה מדגימות שהוכתמו אינדיה אינק יכול להיות אוטומטי באמצעות ניתוח תמונות חישובית.

כדי להמחיש אינדוקציה קפסולה תא מכתים, הדמיה, טכניקות מדידה, היינו שלושה זנים של neoformans ג: המעבדה משותף, מאופיין היטב להתאמץ, H99S30ושני זני קלינית מבודדת בעבר קוטר קפסולה לא ידוע, B18 ולא B5231.
זרימת העבודה של אינדוק...

Watch this Scientific Journal Video about Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

גודל ענייני: מדידה של הקפסולה בקוטר של neoformans קריפטוקוקוס

הקפסולה רב-סוכר הוא הגורם העיקרי התקפה אלימה , קריפטוקוקוס neoformans , גודלו בקורלציה עם זן התקפה אלימה. מידות קוטר קפסולה משמשים בבדיקות פנוטיפי וכדי להעריך את היעילות הטיפולית. כאן מוצגת שיטה סטנדרטית האינדוקציה קפסולה, שתי שיטות של צביעת ומדידת קוטר מושווים.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K Views.  Middle Tennessee State University. הקפסולה רב-סוכר הוא הגורם העיקרי התקפה אלימה , קריפטוקוקוס neoformans , גודלו בקורלציה עם זן התקפה אלימה. מידות קוטר קפסולה משמשים בבדיקות פנוטיפי וכדי להעריך את היעילות הטיפולית. כאן מוצגת שיטה סטנדרטית האינדוקציה קפסולה, שתי שיטות של צביעת ומדידת קוטר מושווים....

Video: Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

הפרדת חיידקים על ידי כמות הקפסולה באמצעות הדרגה צפיפות מקוטע

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Genetics

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

חזותי exocytosis ללא ממס של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em&gt; מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

מדידה אוטומטיות של Cryptococcal מינים רב-סוכר כמוסה וגוף התא

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

אוטומציה של מדידות מיקרוסקופ כוח ביו-אטומי על מאות תאי C. אלביקנס

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Bioengineering

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

מרק Microdilution במבחנה הקרנה: שיטה קלה ומהירה כדי לזהות תרכובות חדשות נגד פטריות

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

ניתוח כמותי של אספרגילוס nidulans קצב הצמיחה באמצעות מיקרוסקופיה חיה ותוכנה בקוד פתוח

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The widespread use of antifungals in clinical settings, their use in agriculture, and strain hybridization have led to increased evolution of resistance. This rising rate of resistance against antifungals is a growing concern among clinicians and scientists worldwide, and there is heightened urgency to develop novel antifungal therapies. For instance, C. neoformans produces several virulence factors, including intra- and extra-cellular enzymes (e.g., peptidases) with roles in tissue degradation, cellular regulation, and nutrient acquisition. The disruption of such peptidase activity by inhibitors perturbs fungal growth and proliferation, suggesting this may be an important strategy for combating the pathogen. Importantly, invertebrates such as mollusks produce peptidase inhibitors with biomedical applications and anti-microbial activity, but they are underexplored in terms of their usage against fungal pathogens. In this protocol, a global extraction from mollusks was performed to isolate potential peptidase inhibitors in crude and clarified extracts, and their effects against classical cryptococcal virulence factors were assessed. This method supports the prioritization of mollusks with antifungal properties and provides opportunities for the discovery of anti-virulence agents by harnessing the natural inhibitors found in mollusks.

The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans produces a variety of virulence factors (e.g., peptidases) to promote its survival within the host. Environmental niches represent a promising source of novel natural peptidase inhibitors. This protocol outlines the preparation of extracts from mollusks and the assessment of their effect on fungal virulence factor production.

הערכת התכונות האנטי-קריפטוקוקליות המשוערות של תמציות גולמיות ומזוקקות מרכיכות

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

גודל ענייני: מדידה של הקפסולה בקוטר של neoformans קריפטוקוקוס

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video