עבודה זו היא נתמכה על ידי מענק של הקהילה האירופית [פרוייקט האיחוד FP7-אנשים-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].

כל הפרוטוקולים ניסיוני אושרו על ידי הוועדה האתית אוניברסיטת פרארה לניסויים בבעלי חיים על ידי משרד הבריאות איטלקית. יגיעו (חיה מחקר: דיווח ב- Vivo ניסויים11) הנחיות הופעלו.
1. הכנת קוורץ מחטים
<ol><li>לנקות ולחטא את הנימים קוורץ (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הצבתם עבור 5 דקות במים מזוקקים, 5 דקות אתנול 99% ו- 5 דקות בדיאתיל אתר.</li>
	<li>השאר נימים מתחת למכסה המנוע לפחות שעה לתת להם להתייבש לחלוטין.</li>
	<li>הכינו את המחטים באמצעות של פולר לייזר בהתאם לפרמטרים לאפשר הייצור של מחט מספיק זמן, מספיק דק, בהתאם לצרכים בודדים. הערה: אנו משתמשים של פולר לייזר (ראה טבלה של חומרים). השתמש בתוכנית שתי שורות עבור משיכת. השורה הראשונה משתמשת מתח גבוה, אורך הסריקה הגדולים (תואם לערך חוטים), אין כוח מושך. שילוב זה של פרמטרים מוביל אל כור ההיתוך של החלק הגדול ביותר של נימי עם מהירות סיומת הנמוך ביותר, המאפשרות עיצוב מחט ארוכה עם גודל פנימי/חיצוני גדול, מופחתת shank. בדרך זו, המחט שומר על עמידות מכנית גבוהה בעלת קוטר פנימי רחב המאפשר המעבר של תאי גזע או נגיפים ללא סתימת. מהירות ועיכוב של הקו התוכנית צריך להפסיק את הסיומת נימי לפני הטיפ הופך להיות קטן מדי ולא ארוכה, חסר מכני נדרש ומאפייני הצורה. השורה השניה של התוכנית מושך מבוצע באופן אוטומטי, ברגע הקוורץ מתקררת (5 s). הפרמטרים של כוח, הלהט, משיכת כוח פונקציונליים לחתוך טיפ עם נשק תלול, הימנעות ההפרדה של שתי מחטים עם קרע עצה לאורכה עצה אפשרית הקצר. באופן שגרתי, עם הציוד שלנו אנו משתמשים הבאות: (א) קו 1 = כוח 990, נימה 5, מהירות 130, עיכוב 110, אינץ למשוך 0; (ב) קו 2 = כוח 970 פילמנט 3, מהירות 0, עיכוב 70, למשוך 0.</li>
	<li>! תניח את המחטים בצלחת פטרי בעבר לנקות עם אתנול 70%.<ol>
<li>מכסים את סרט פרפין פלסטיק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חותכים את נימי הדם המיקרו-בניתוח.<ol>
<li>בהפעלה של, תן את לייזר להפעיל תהליך autocalibration כדי לוודא כוח ואנרגיה נמסר. לאחר מכן הגדר את פרמטרי חיתוך. הערה: אנו משתמשים של מיקרו-בניתוח (ראה טבלה של חומרים) והפרמטרים הבאים: לייזר כוח פולס אנרגיה (63 µJ), קוטר אלומת לייזר של 20% של הצמצם המקסימלי (צמצם מקסימלי: 1.0 מיקרומטר), ומהירות חיתוך של 10% מהירות מירבית (מקסימלי מהירות: 30 מיקרומטר/s).</li>
		<li>בחוזקה לתקן את המחט על השולחן מיקרוסקופ ומקם את קצהו במרכז של מסך המחשב.</li>
		<li>בשורת התפריטים, לחץ על סמל העיפרון ולהשתמש בו כדי לצייר סימן לחיתוך לייזר של המחט. הערה: החתך צריך להיות בזווית של 45 מעלות ביחס השטח המחט.</li>
		<li>הפונקציה בר לצד, בחר את הדגל המכיל לחצן "התחל CUT" כדי לאפשר את הלייזר לחתוך את המקום בעבר מסומנים.</li>
		<li>אם יש צורך, חתך צד hole(s) חוזרת בהליכים המתוארים תחת 1.5.2-3; יש צורך למקם מחדש את המחט (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>פוסט-חותכים ניקוי.<ol>
<li>לחבר את המחט משאבה void דרך צינור פלסטיק.</li>
		<li>הפעל את המשאבה ולאחר להגדיר באופן ידני את קצב זרימה קדימה במהירות בינונית (3 µL/דקה).</li>
		<li>האחות האתנול 99% הראשון ולאחר מכן את מים מזוקקים להסרת זיהומים עקב חיתוך.</li>
		<li>האחות האתנול 99% שוב כדי להקל על ייבוש. הערה: כל שלב צריך להימשך לפחות 3 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אחסן את המחטים צלחת פטרי המכוסה כראוי עד היום של הניתוח.</li>
	<li>מחטים ניתן להשתמש מחדש; בסוף הניסוי, לנקות עם אקונומיקה, אתנול כדי להסיר את שאריות רקמת פתרון ואפשרי. להשלים את הניקוי, תניח את המחטים בתוך צנצנת אחסון micropipette עם קצה מצביע כלפי מטה, למלא את הצנצנת במים מזוקקים עד הטיפים מכוסים, מרתיחים 1.5 דקות להסיר את כל שאריות של רקמות, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול.</li>
</ol>2. הליך
<ol><li>בעקבות ההוראות שסופקו על-ידי המדריך למשתמש משאבה, בחר בתפריט ' הגדרות ' כדי לכייל את המשאבה על פי הנפח/הקוטר של המזרק microinjection ולהגדיר את קצב הזרימה ב- µL 0.3/דקה.</li>
	<li>ממלאים מזרק 10-mL (המצוידים מחט בוטה (למשל, המילטון מחט, 30 גרם), צינור טפלון קצר) במים סטריליים ולהשתמש בו כדי למלא את המזרק microinjection (לאחר כך הוסר בזהירות את הבוכנה) ואת הזריקה קיט חלקים הרכבה על המשאבה microinjection ידנית (MMP). הערה: ערכת MMP משמש בצורה מאובטחת לטעון את המחט בתוך המסגרת סטיאוטטי (איור 2). הערכה כוללת: אבובים טפלון, סכינים סטריליים-כדי-אבובים מצמד, מחזיק פיפטה, אטמים עבור פיפטות עם קטרים שונים החיצוני.</li>
	<li>לחבר את המחט ערכת MMP.<ol>
<li>ריקון מים בכל המערכת דרך המזרק 10-mL, לבדוק אם המים שיוצא המחט. הערה: הקפד להסיר את כל בועות האוויר בתוך המערכת על ידי המדרגות מילוי חוזר.</li>
	</ol></li>
	<li>נתק את המזרק 10-mL המזרק microinjection בעת לאט דוחף את הבוכנה כדי להשאיר טיפת מים בחלק העליון של המזרק microinjection. הכנס את הבוכנה במזרק microinjection.</li>
	<li>להתחבר המזרק microinjection המשאבה ולהגדיר את קצב הזרימה ב- µL 0.3/דקה. הערה: המתן עד שיתפנה טיפה דולף מהקצה של המחט, אז תעזבו את זה בשביל עוד 3 דקות.</li>
	<li>להעביר את הזרימה ב- 0.1 µL/דקה ולהתחיל בהליך ניתוח. המשאבה צריכה להיות שוטף בעת ביצוע הניתוח. הערה: עבור הניסויים דיווחו במאמר זה, אנו משתמשים חולדות ספראג Dawley הגברי של 300 גרם (3 חודשים של גיל). עם זאת, הנוהל הוא החלים על מינים אחרים, עכברים בפרט.</li>
	<li>לגרום הרדמה כללית באמצעות שיטה שאושרו על-ידי תקנות מקומיות. הערה: אנו משתמשים שילוב של הזרקה בקרום הבטן (i.p.) של 85 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 8 מ ג/ק ג חריגות השירותים הווטרינריים עבור 20-50 דקות של הרדמה. חשוב כי צובט זנב ו/או הבוהן משמשים על מנת להבטיח שהחיה היא הרגעה. רמת בסיסיים החיוניים והרדמה הם העריכו לפני הניתוח מתחיל ולעקוב אחר כל 10 דקות תוך כדי ביצוע הניתוח. טמפרטורת הגוף החי נשמר קבוע לפני, במהלך ואחרי ניתוחים באמצעות מים מחדש במחזור כרית החימום. חיות מנוטרים עד החלים לחלוטין (למשל הם ישר ועם אמבולטורי). בנוסף, בעלי החיים מקבלים משככי כאבים (טרמדול, 5 – 7 מ"ג/ק"ג i.p.) וכאב לאחר הניתוח כל 24 שעות במשך שלושה ימים.<ol>
<li>לגלח את הראש של החיה ולהתכונן כראוי באתר כירורגית ניתוח אספטי. לבצע קרצוף בשני שלבים עם יוד מבוססי פתרון (Betadine) ואחריו 70% אתנול. יתר על כן, כדי לשמור על asepsis, לעטוף את האתר כירורגית עם תלוי כירורגי (וידאו הושמט למטרות הדגמה).</li>
	</ol></li>
	<li>מקמו את החולדה במסגרת stereotaxic מים מחדש במחזור חימום שמיכה. כדי לספק הקלה בכאב נוספים, באתר של ניתוח להחיל פתרון לידוקאין 0.5% (לא יעלה על 7 מ"ג/ק"ג). מראש לעקר כל מכשירי ניתוח באמצעות immerging את הציוד בחדר או 2% גלוטראלדהיד בתוספת 7.05% פנול (Sporodicin או Cidex) חרוז קר מעקר או נוזל חיטוי ואחריו שטיפה עם מים סטרילי או תמיסת מלח. יש לבצע חיטוי אפילו בין הליכים. לבצע חתך האורך על הגולגולת באמצעות אזמל מעוקר. להיות עדין כדי למנוע דימום יתר. לפתוח את הקרקפת באמצעות מרית שטוחה ולהחיל כירורגיים על המשק של העור כדי להשאיר אותה פתוחה. מאוד בעדינות, ניתוק קרום העצם כדי לחשוף את bregma ואת האזור של הגולגולת שדרכם יתווסף את המחט.</li>
	<li>לטעון את הזרוע על המסגרת stereotaxic (בעוד הזרם הוא מתמשך) ולהעביר את קצה המחט בדיוק מעל bregma, תשומת לב לא לשבור את קצהו. ביאור את הקואורדינטות גישה antero-אחוריים ו medio-הצד של bregma, לתרגם נקודות הציון הרצוי. מונחה על ידי stereomicroscope, להנמיך את המחט עד את קצהו כמעט נוגעת הגולגולת, מארק קידוח ספוט לאחר שהקים קצת את הזרוע stereotaxic</li>
	<li>תרגיל (לקדוח עצה Ø: 0.8 מ"מ; מהירות התרגיל: 1,000 סל ד) הגולגולת על המקום המסומן. חייבים להקפיד לא לחדור את השכבה הקשה של המוח במהלך ההליכים קידוח. במהלך קידוח, לטפטף תמיסת מלח סטריליים כדי למנוע נזק לעצם נמק.</li>
	<li>לחתוך חתיכה קטנה של פרפין פלסטיק הסרט ומניחים אותו על הגולגולת. שימוש של pipet µL 10, גורם טיפה של הפתרון להזריק על הסרט פלסטיק פרפין. לעצור את המשאבה, מעט לאחזר הסוחר של המשאבה, ליצור בועת האוויר קצת נימי על-ידי מושך בעדינות את הבוכנה של המזרק microinjection.</li>
	<li>. תנמיכי את הזרועות סטיאוטטי עד קצה המחט מגיע הירידה לצייר את הדגימה על ידי משיכת (לאט לאט) את הבוכנה של המזרק microinjection, הימנעות כל היווצרות בועה. להחליף את הסוחר משאבת בקשר עם הבוכנה, תדליק את המשאבה בספיקה של 0.3 לדקה µL לחכות עד היווצרות של טיפה (מספר דקות) לפני שתמשיך לשלב הבא. הערה: דוגמה לניסוי הנוכחי, נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) היה חדורים ב סטריאטום (AP: +1.5, ML: ±2.7; DV:-5.0), בהיפוקמפוס הגבי (AP:-3.5, ML: ±2.1; DV:-3.5; במ מ דורא), µL 2/האתר. כדי להקל על ההשוואה בין הזרקת שתי השיטות, כל אזור המוח היה חדורים באמצעות מחט קוורץ באונה אחת, עצה 26 גרם בוטה או מחט נירוסטה מסגרת משופעת-עצה 30 G ביד השניה.</li>
	<li>הנמך את זרימת µL 0.1/min, ניק השכבה הקשה של המוח עם מחט שיקוע-טיפ פלדת אל-חלד, הורידו לאט את היד סטיאוטטי על הגרזן dorso-הגחוני /, הזנת על רקמת המוח. כאשר במיקום הרצוי, פתח למטה מ מ 0.1 נוספים, לעצור את המשאבה, להעלות את הזרוע סטיאוטטי על ידי 0.1 מ מ, הפעל שוב את המשאבה-זרימת µL 0.3/min. הערה: הסיבה כדי לשמור על זרימה איטית תוך כדי הנמכת המחט היא להבטיח לחץ חיובי זה מונע חדירה של קטעים קטנים של רקמות במחט עצמה. אירוע כזה להכשיל הטיפ, ופוגע המסירה של פתרון. מאז קצב הזרימה איטית מאוד אמנם מנמיך את המחט ואת המהירות של הנמכת כ-10 מ"מ/s, זה מרמז כי הכמויות של פתרון שנותרו לאורך המסלול המחט הם זניחים בהשוואה לאלו מוזרק באתר היעד. ייתכן להימנע אמצעי זהירות בעת שימוש מחטים עם חורים בצד.</li>
	<li>להתחיל את הטיימר ולא לחכות את הזמן הדרוש בהתאם לנפח הרצוי כדי להזריק (לדוגמה, 6 דקות 40 s אם הזרקת 2 µL). לפקח על התנועה בועה בזמן הזרקת. בסוף, עוצרים את המשאבה, להמתין 5 דקות לפני לאט מאחזר את המחט. כאשר המחט קוורץ מופק לחלוטין, הפעל את המשאבה שוב ולבדוק היווצרות טיפה בקצה המחט.</li>
	<li>לאטום את הפתח פני הגולגולת עם שעווה לאיטום, להסיר את הקליפים hemostatic, תפר את הקרקפת, להרגיע את האזור סביב הפצע עם גלידה אנטיביוטיקה (למשל, נאוספורין) ולחזור החיה לכלוב הביתה. הערה: בעקבות פרוטוקול המתת חסד אושרו על ידי ועדת אתית מוסדית, הניסויים המתוארים במאמר זה, בעלי חיים היו עמוקות מרדימים עם זריקה i.p. של קטמין 43 מ"ג/ק"ג ו- 7 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים, ערף. המוח הוסרו, סיומת בפורמלין במשך 48 שעות, פרפין מוטבע. קטעים הילתית (8 מיקרומטר) של המוח נחתכו באמצעות מיקרוטום.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat.">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li><li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity.">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li><li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+pay+attention:+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation,+diurnality,+and+performance.">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li><li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+to+the+central+nervous+system.">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li><li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders.">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li><li>Bj&#246;rklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin,+Quinolinic+Acid,+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes.">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li><li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model.">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li><li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors.">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li><li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes.">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li><li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic:+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae.">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בטכניקה המתוארת במאמר זה ממלא את הצרכים המתוארים מבוא לאופטימיזציה microinjections המבוצעות למטרות שונות12. המחטים המתוארים כאן להפחית נזק לרמה מינימלית, בעיקרו של דבר נסתרים; -סטיה עם מחטים זכוכית (כי הם נוטים לכופף), קוורץ מחטים נוקשה, להבטיח התאמה אמין של האזור הרצוי במוח ?...

Microinjections שימשו במשך זמן רב למסירה של חומרים פעילים פרמקולוגית כדי לווסת את פעילות. עצבית באזורים מסוימים במוח. בנוסף, הם השתמשו כדי להזריק רעלים בקרבת אוכלוסיות עצביים מסוים, לחקות אירועים ניווניות האופיינית של מחלות מסוימות, לדוגמה 6-הידרוקסי-דופמין במערכת דופמין nigrostriatal לחקות מחלת פרקינסון 1 , 2 או את saporin IgG immunotoxin 192 את הנגע שימוש במערכת3. לאחרונה, הליכים microinjection שימשו להעברת נגיפי שתלי וקטורים או תאים לטיפול גנטי או תא של המוח ניסיוני הפרעות4,5.
הסוג הקלאסי של מחטים המועסקים במחקרים אלה עשוי פלדת אל-חלד. אמנם קל ומעשי לשימוש, מחטים פלדה יש מספר בעיות6: הם גדולים יחסית, עלול לגרום נזק לרקמות, עם דליפה של מחסום הדם - מוח והפעלה של האסטרוציטים; יתר על כן, הם עשויים לייצר גלעון של רקמת המוח מקבל לתוך המחט יצירת מכשול או אפילו לגמרי הימנעות זרימה של הפתרון הרצוי. לאחרונה, מחטים זכוכית מוכן אד הוק של נימים הוכנסו להשתמש7,8. אלה אינם גורמים ההפעלה נזק ולא אסטרוציט לרקמות משמעותי, אבל יחסית גמישה, אולי אעקם הציג מבנים עמוק, להפחית את הדיוק של לוקליזציה (תצפיות אישי).
לכן יש צורך להפחית ככל האפשר נזק (במיוחד בעת ביצוע ניסויים כדי לרפא את הנזק) תוך הגדלת דיוק הפארמצבטית (קרי, להבטיח כי כל פתרון מועבר ולהבטיח לוקליזציה הנכון). יתר על כן, רצוי להשתמש עיצובים שונים מחט כדי להבטיח הפצה אופטימלית של הפתרון מוזרק, באזורי המוח גיאומטריות שונות. במאמר זה, אנו מתארים לפרוטוקול להכין ולהשתמש קוורץ מחטים microinjections במוח מכרסמים. בשל נקודת התכה גבוהה, נימים קוורץ לא יכול להיות עשה של פולר המקובלת, ולכן לא השתמשו בעבר כדי להפיק מחטים. קוורץ, עם זאת, מציע כמה יתרונות חשובים לעומת זכוכית, בפרט גבוהה קשיחות ו- break ההתנגדות9. בגלל קשיחות שלהם, קוורץ מחטים מתאימים באופן אידיאלי עבור זריקות לתוך אזורי המוח הגחון. בגלל שלהם עמידות גבוהה בפני שבירה הם שניתן למדל כדי לכלול חורים מרובים, קבלת עיצובים שיוכיחו היעיל ביותר גם כאשר פילוח אזורי המוח עם לסימולציה10.

<table><tbody><tr><td>Quartz capillaries</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td><td>Q100-50-10</td><td>Without filament</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette storage jar</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissector</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&amp;Yuml;tzerbach, Germany</td><td>19138-U</td><td></td></tr><tr><td>Microinfusion pump</td><td>Univentor, Zejtun, Malta</td><td>Model 864</td><td></td></tr><tr><td>Manual microinjection pump kit</td><td>WPI</td><td>Item#: MMP-KIT</td><td>Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame</td></tr><tr><td>Precision Drill</td><td>Proxxon</td><td>28510 MicroMot 50/E</td><td>Ball bearing drive shaft with variable speed</td></tr><tr><td>Artficial Cerebral Spinal Fluid</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel</td><td>Hamilton</td><td>26 G Blunt: 19138-U&lt;br/&gt; 30 G Bevel: 20757</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Germany</td><td>LEICA RM212RT</td><td></td></tr></tbody></table>

personalized needles for microinjections in the rodent brain

Microinjections שימשו במשך זמן רב למסירה של סמים או רעלים בתוך אזורים ספציפיים במוח, לאחרונה, הם השתמשו כדי לספק מוצרי טיפול גנטי או התא. למרבה הצער, טכניקות microinjection הנוכחית להשתמש במחטים פלדה או זכוכית כי הם שיוצרת מסיבות רבות: בפרט, מחטים פלדה עלול לגרום נזק לרקמות, זכוכית מחטים אולי אעקם כאשר יורדת עמוק לתוך המוח, חסר באזור היעד. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול להכין ולהשתמש מחטים קוורץ המשלבות מספר תכונות שימושיות. מחטים אלה אינם מייצרים נזק לרקמות לזיהוי ולהבטיח, להיות נוקשה מאוד, משלוח אמין באזור המוח הרצוי אפילו בעת שימוש בקואורדינטות עמוק. יתר על כן, זה אפשרי להתאים אישית את העיצוב של המחט על ידי עשיית חורים מרובים לקוטר הרצוי. חורים מרובים להקל ההזרקה של כמויות גדולות של פתרון בתוך שטח גדול יותר, ואילו חורים גדולים להקל על ההזרקה של תאים. בנוסף, מחטים קוורץ אלה יכולים להיות מנקים את מחדש בשימוש, כך ההליך הופך להיות חסכונית.

השווינו את הנזק הנגרם על ידי microinjection ישירה היפוקמפוס הגבי עכברוש, סטריאטום באמצעות מחט קוורץ (עצה קוטר חיצוני מיקרומטר 60; אחד 20 מיקרומטר קוטר חור בצד; סוג C, איור 1) לעומת קלאסי שני, 26 גרם הקהה, קצוות מסגרת משופעת 30 גרם מחטים פלדת אל-חלד. מטרה זו, הזרקנו 2 µL של ח...

Watch this Scientific Journal Video about Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain at JoVE.com

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

נתאר כאן עבור microinjection במוח מכרסמים המשתמשת קוורץ מחטים פרוטוקול. מחטים אלה לא לייצר נזק לרקמות לזיהוי ולהבטיח משלוח אמין אפילו באזורים עמוקים. יתר על כן, הם יכולים להיות מותאם לצרכי מחקר מאת עיצובים מותאמים אישית, ניתן להשתמש מחדש.

מחטים מותאמים אישית עבור Microinjections במוח מכרסמים

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

personalized-needles-for-microinjections-in-the-rodent-brain

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Views.  University of Ferrara. נתאר כאן עבור microinjection במוח מכרסמים המשתמשת קוורץ מחטים פרוטוקול. מחטים אלה לא לייצר נזק לרקמות לזיהוי ולהבטיח משלוח אמין אפילו באזורים עמוקים. יתר על כן, הם יכולים להיות מותאם לצרכי מחקר מאת עיצובים מותאמים אישית, ניתן להשתמש מחדש.

Video: Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

מיקוד של מבנים מוחיים עמוקים עם Microinjections עבור משלוח של תרופות, וקטורים ויראליים, או השתלת תאים

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

מכרסמים מוח Microinjection לחקר מולקולריים מצעים של התנהגות מוטיבציה

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Behavior

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal resolution from shallow and deep brain regions. Their use has been hindered, however, by mechanical and structural mismatches between the probes and brain tissue that commonly lead to micromotion and gliosis with resulting signal instability in chronic recording experiments. In contrast, following the implantation of ultraflexible mesh electronics via syringe injection, the mesh probes form a seamless, gliosis-free interface with the surrounding brain tissue that enables stable tracking of individual neurons on at least a year timescale. This protocol details the key steps in a typical mouse neural recording experiment using syringe-injectable mesh electronics, including the fabrication of mesh electronics in a standard photolithography-based process possible at many universities, loading mesh electronics into standard capillary needles, stereotaxic injection in vivo, connection of the mesh input/output to standard instrumentation interfaces, restrained or freely moving recording sessions, and histological sectioning of brain tissue containing mesh electronics. Representative neural recordings and histology data are presented. Investigators familiar with this protocol will have the knowledge necessary to incorporate mesh electronics into their own experiments and take advantage of the unique opportunities afforded by long-term stable neural interfacing, such as studies of aging processes, brain development, and the pathogenesis of brain disease.

Mesh electronics probes seamlessly integrate and provide stable, long-term, single-neuron level recording within the brain. This protocol uses mesh electronics for in vivo experiments, involving the fabrication of mesh electronics, loading into needles, stereotaxic injection, input/output interfacing, recording experiments, and histology of tissue containing mesh probes.

מזרק-להזרקה רשת אלקטרוניקה עבור יציב אלקטרופיזיולוגיה מכרסמים כרונית

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

Bioengineering

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

מניפולציה של תאי גזע עצביים יחיד ונוירונים בפרוסות מוח באמצעות Microinjection רובוטי

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

ביצוע הזרקה תוך-מוחית בעכברים בגישה של יד חופשית

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. An intracerebroventricular (ICV) injection allows the widespread delivery of the experimental agent throughout the brain (particularly in the structures near the ventricles). Here, methods for making free-hand ICV injections in adult mice are described. By using visual and tactile landmarks on the heads of mice, injections into the lateral ventricles can be made rapidly and reliably. The injections are made with a glass syringe held in the experimenter&#39;s hand and placed at approximate distances from the landmarks. Thus, this technique does not require a stereotaxic frame. Furthermore, this technique requires only brief isoflurane anesthesia, which permits the subsequent assessment of mouse behavior and/or physiology in awake, freely behaving mice. Free-hand ICV injection is a powerful tool for the efficient delivery of experimental agents into the brains of living mice and can be combined with other techniques such as frequent blood sampling, neural circuit manipulation, or in vivo recording to investigate neuroendocrine processes.

מחבר זרקור: תובנות, חידושים ודרכים עתידיות בבקרת עצבים במערכת הרבייה 

Here, a simple and rapid approach for performing intracerebroventricular injections in mice using a free-hand approach (that is, without a stereotaxic device) is described.

זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

אופטימיזציה של דיוק מיקרו-הזרקה סטריאוטקסית בעכברים

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their choice of stereotaxic injection parameters on mouse brain atlases or published materials that employed various populations/ages of mice and different stereotaxic equipment, necessitating further validation of the stereotaxic coordinate parameters. The efficacy of calcium imaging, chemogenetic, and optogenetic manipulations relies on the precise expression of reporter genes within the region of interest, often requiring several weeks of effort. Thus, it is a time-consuming task if the coordinates of the target brain region are not verified in advance. Using an appropriate dye instead of a virus and implementing cryosectioning, researchers can observe the injection site immediately following dye administration. This facilitates timely adjustments to coordinate parameters in cases where discrepancies exist between the actual injection site and the theoretical position. Such adjustments significantly enhance the accuracy of viral expression within the target region in subsequent experiments.

מחבר זרקור: האצת מחקר ליקויים קוגניטיביים בעכברים באמצעות הזרקה סטריאוטקסית וצבעים חסכוניים

The present protocol describes a practical strategy to expedite the verification step of stereotaxic injection coordinates before conducting viral tracing using dyes and frozen sections.

אימות ראשוני של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות באמצעות קריוסקציה

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

מחטים מותאמים אישית עבור Microinjections במוח מכרסמים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מיקוד של מבנים מוחיים עמוקים עם Microinjections עבור משלוח של תרופות, וקטורים ויראליים, או השתלת תאים

מכרסמים מוח Microinjection לחקר מולקולריים מצעים של התנהגות מוטיבציה

אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

מזרק-להזרקה רשת אלקטרוניקה עבור יציב אלקטרופיזיולוגיה מכרסמים כרונית

מניפולציה של תאי גזע עצביים יחיד ונוירונים בפרוסות מוח באמצעות Microinjection רובוטי

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים

זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים

זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים

אימות ראשוני של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות באמצעות קריוסקציה