Name: personalized needles for microinjections in the rodent brain
Uploaded: 2018-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus der Europäischen Gemeinschaft [RP7-Menschen-2011-IAPP Projekt 285827 (EPIXCHANGE)].

Alle experimentelle Protokolle wurden von der Ethikkommission der Universität von Ferrara für Tier-Experimente und das italienische Gesundheitsministerium genehmigt. Die Ankunft (Animal Research: Berichterstattung In Vivo Experimente11) Richtlinien befolgt wurden.
1. Vorbereitung des Quarz-Nadeln
<ol><li>Reinigen Sie und sterilisieren Sie die Quarz-Kapillaren (siehe Tabelle der Materialien), indem man sie für 5 min in destilliertem Wasser, 5 min in Ethanol 99 % und 5 min in Diethylether.</li>
	<li>Lassen Sie die Kapillaren unter der Haube für mindestens 1 h bis sie vollständig trocknen lassen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Nadeln mit einem Laser Abzieher nach Parametern, die die Produktion von einer ausreichend langen, ausreichend dünnen Nadel, je nach den individuellen Bedürfnissen zu ermöglichen. Hinweis: Wir verwenden einen Laser-Puller (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie ein zwei Zeilen Programm zum ziehen. Die erste Zeile verwendet high-Power, der größte Scan Länge (Filamente Wert entspricht) und keine Zugkraft. Diese Kombination von Parametern führt zum Schmelzen des größten Teils der Kapillare mit die niedrigsten Ausschubgeschwindigkeit, so dass für die Gestaltung einer langen Nadel mit großen inneren/äußeren Größe und Schaft reduziert. Auf diese Weise bewahrt die Nadel eine hohe mechanische Festigkeit und breit Innendurchmesser, die im Laufe der Stammzellen oder Viruspartikel ohne zu verstopfen kann. Geschwindigkeit und Verzögerung von dieser Programmzeile sollte die Kapillarleitung stoppen, bevor die Spitze zu klein und lang, fehlen die erforderlichen mechanischen und Formcharakteristik wird. Die zweite Zeile des Programms ziehen wird automatisch ausgeführt, sobald die Quarz abkühlt (5 s). Parameter der macht, Filament und Zugkraft sind funktionell, schneiden Sie einen Tipp mit der kürzesten möglichen Spitzenlänge und steilen Schaft, die Trennung der beiden Nadeln mit einem Tipp-Bruch zu vermeiden. Routinemäßig, mit unserem Equipment verwenden wir Folgendes: (a) Linie 1 = Power 990, Filament 5, Geschwindigkeit 130, Verzögerung 110, ziehen 0; (b) Linie 2 = Power 970, Filament 3, Geschwindigkeit 0 Verzögerung 70, 0 zu ziehen.</li>
	<li>Setzen Sie die Nadeln in einer Petrischale mit Ethanol 70 % zuvor gereinigt.<ol>
<li>Bedecken Sie die Schüssel mit einem Kunststoff Paraffin-Film.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geschnitten Sie die Kapillaren an der Mikro-Sezierer.<ol>
<li>Lassen Sie bei der Inbetriebnahme der Laser führen einen Selbstkalibrierung Prozess um zu überprüfen, Kraft und Energie geliefert. Legen Sie die Bearbeitungsparameter. Hinweis: Wir verwenden eine Mikro-Sezierer (siehe Tabelle der Materialien) und die folgenden Parameter: laser macht Pulsenergie (63 µJ), Laser Strahldurchmesser von 20 % der maximalen Öffnung (maximale Blende: 1,0 µm), und Schnittgeschwindigkeit von 10 % der maximalen Geschwindigkeit (maximal Geschwindigkeit: 30 µm/s).</li>
		<li>Fest fixieren Sie die Nadel auf den Mikroskoptisch und positionieren Sie seine Spitze in der Mitte des Bildschirms.</li>
		<li>Klicken Sie in der Menüleiste auf das Bleistift-Symbol und verwenden Sie, um ein Zeichen für das Laserschneiden der Nadel ziehen. Hinweis: Der Schnitt sollte in einem Winkel von ca. 45° in Bezug auf die Nadel Oberfläche sein.</li>
		<li>Wählen Sie auf der Seite Bar-Funktion die Flagge enthält die "START CUT"-Schaltfläche, um den Laser auf die vorher markierte Stelle schneiden lassen.</li>
		<li>Bei Bedarf schneiden Sie Seite Fehlerzustand durch Wiederholung in 1.5.2-3 beschriebenen Verfahren; Es gibt keine Notwendigkeit, die Nadel (Abbildung 1) neu zu positionieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach dem Schneiden Sie, Reinigung.<ol>
<li>Verbinden Sie die Nadel auf eine leere Pumpe durch ein Kunststoffrohr.</li>
		<li>Schalten Sie die Pumpe ein und legen Sie manuell die Vorlauf-Rate mit mäßiger Geschwindigkeit (3 µL/min).</li>
		<li>Aspirieren das 99 % Ethanol zuerst und dann das destillierte Wasser Verunreinigungen durch Schneiden zu entfernen.</li>
		<li>Aspirieren Sie die 99 % Ethanol wieder um die Trocknung zu erleichtern. Hinweis: Jeder Schritt sollte mindestens 3 min dauern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Speichern Sie die Nadeln in einer richtig bedeckten Petrischale bis zum Tag der Operation.</li>
	<li>Nadeln können wieder verwendet werden; am Ende des Experiments reinigen Sie mit Bleichmittel und Ethanol, die Lösung und mögliche Gewebe entfernen. Füllen Sie für eine vollständigere Reinigung, setzen Sie die Nadeln in einer Mikropipette Vorratsgefäß mit der Spitze nach unten das Glas mit destilliertem Wasser, bis die Spitzen bedeckt sind, Kochen Sie für 1,5 min alle übrig gebliebenen Gewebe zu entfernen, dann waschen mit Ethanol.</li>
</ol>(2) Verfahren
<ol><li>Wählen Sie das Menü "Einstellungen", um die Pumpe nach dem Durchmesser/Volumen der Mikroinjektion Spritze zu kalibrieren und Einstellen der Durchflussmenge bei 0,3 µL/min, nach den Anweisungen der Bedienungsanleitung der Pumpe.</li>
	<li>Füllen Sie eine 10-mL-Spritze (ausgestattet mit einer stumpfen Nadel (z.B.Hamilton Nadel, 30 G) und einem kurzen Polytetrafluorethylen-Rohr) mit sterilem Wasser und es verwenden Sie, um die Mikroinjektion Spritze (nach den Kolben vorsichtig entfernen) und die Injektion zu füllen Montage-Teilesatz für die manuelle Mikroinjektion Pumpe (MMP). Hinweis: Das MMP-Kit wird verwendet, um die Nadel in der stereotaktische Rahmen (Abbildung 2) sicher zu montieren. Das Kit besteht aus: einem Polytetrafluorethylen-Schläuche, Luer-Anschluss-Schläuche-Koppler, Pipette Halter und Dichtungen für Pipetten mit verschiedenen Außendurchmesser.</li>
	<li>Verbinden Sie die Nadel mit dem MMP-Kit.<ol>
<li>Spülen Sie mehr Wasser über das System zu, durch die 10-mL-Spritze, und überprüfen Sie, ob das Wasser aus der Nadel kommt. Hinweis: Stellen Sie sicher Luftblase im Inneren des Systems entfernen indem Sie die Füllung Schritte wiederholen.</li>
	</ol></li>
	<li>Trennen Sie die 10-mL-Spritze aus der Mikroinjektion Spritze drücken Sie langsam den Kolben um einen Tropfen Wasser an der Spitze der Mikroinjektion Spritze zu verlassen. Setzen Sie den Kolben in der Mikroinjektion Spritze.</li>
	<li>Die Mikroinjektion Spritze an die Pumpe anschließen und die Durchflussmenge bei 0,3 µL/min eingestellt. Hinweis: Warten Sie, bis ein Tropfen Austritt aus der Spitze der Nadel und dann für weitere 3 Minuten gehen lassen.</li>
	<li>Legen Sie den Fluss bei 0,1 µL/min und starten Sie die Operation. Die Pumpe sollte während der Durchführung der Operation laufenden. Hinweis: Für die Experimente berichtet in diesem Artikel verwenden wir männliche Sprague-Dawley Ratten 300 g (3 Monate alt). Das Verfahren ist jedoch insbesondere anwendbar auf andere Arten, Mäuse.</li>
	<li>Induzieren Sie Vollnarkose mit einer Methode, die von örtlichen Vorschriften genehmigt. Hinweis: Wir verwenden eine Mischung aus intraperitonealer Injektion (i.p.) von 85 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin für 20-50 min der Anästhesie. Es ist wichtig, dass Rute und/oder Zehen Prisen verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Tier völlig sediert ist. Ebene der Anästhesie und grundlegende Eingeweide sind geprüft, bevor Chirurgie beginnt und alle 10 Minuten während der Durchführung der Operation überwacht. Tierischen Körpertemperatur ist konstant vor, während und nach chirurgischen Eingriffen mit einem Wasser wieder zirkulierenden Heizkissen gehalten. Tiere werden überwacht, bis vollständig erholt (z. B. sie sind aufrecht und ambulante). Darüber hinaus erhalten Tiere Analgetika (Tramadol, 5 – 7 mg/kg i.p) postoperativ alle 24 h für drei Tage.<ol>
<li>Der Kopf des Tieres zu rasieren und angemessene Vorbereitung der Operationsstelle für aseptische Chirurgie. Führen Sie eine zwei-Phasen-Peeling mit Jod-Lösung (Betadine) gefolgt von 70 % igem Ethanol. Darüber hinaus um Asepsis zu halten, wickeln die Operationsstelle mit einem chirurgischen Tuch (in dem Video wurde zu Demonstrationszwecken weggelassen worden).</li>
	</ol></li>
	<li>Positionieren Sie die Ratte in der stereotaktischen Rahmen über ein Wasser wieder zirkulierenden Wärme-Unterbett. Um zusätzliche Schmerzfreiheit am Ort der Operation gelten 0,5 % Lidocain-Lösung (7 mg/kg nicht überschreiten). Sterilisieren Sie vorab alle chirurgischen Instrumente mit einer Wulst Sterilisator oder Flüssigkeit kalt Desinfektion von selbstvergessen die Ausrüstung entweder 2 % Glutaraldehyd plus 7,05 % Phenol (Sporodicin oder Cidex) gefolgt von Spülen mit sterilem Wasser oder Kochsalzlösung. Die Desinfektion muss auch zwischen Verfahren durchgeführt werden. Machen Sie einen längs-Schnitt über den Schädel mit einem sterilen Skalpell. Seien Sie sanft, übermäßige Blutung zu vermeiden. Öffnen Sie die Kopfhaut mit einem flachen Spatel und chirurgische Clips auf die Hautlappen es geöffnet zu halten. Lösen Sie sehr sanft das Periost, aussetzen der Bregma und den Bereich des Schädels durch die Nadel eingeführt wird.</li>
	<li>Montieren Sie den Arm auf der stereotaktischen Rahmen (während die Strömung läuft) und bewegen Sie die Spitze der Nadel genau auf Bregma, die Aufmerksamkeit nicht auf die Spitze zu brechen. Kommentieren Sie die Antero-posterioren und Medio-lateralen Koordinaten der Bregma und übersetzen Sie, um die gewünschten Koordinaten. Geleitet von einem Stereomikroskop, senken Sie die Nadel, bis seine Spitze berührt fast den Schädel, markieren Sie die Bohrungen nach Anhebung des stereotaktischen Arms ein wenig vor Ort.</li>
	<li>Bohren (Spitze Ø Bohren: 0,8 mm; Drehzahl: 1.000 u/min) den Schädel auf der markierten Stelle. Vorsicht ist geboten, nicht zu die Dura bei den Bohrungen zu durchdringen. Während des Bohrens Tropfen Sie sterilen Kochsalzlösung zur Vermeidung von Knochenschädigung und Nekrose.</li>
	<li>Schneiden Sie ein kleines Stück Kunststoff Paraffin Film und legen Sie es auf den Schädel. Mit 10 µL pipettieren, machen Sie einen Tropfen der Lösung auf dem Kunststoff Paraffin-Film zu injizieren. Stoppen Sie die Pumpe leicht Abrufen der Drücker der Pumpe und erstellen eine kleine Luftblase in der Kapillare durch leichtes Ziehen des Kolbens der Spritze Mikroinjektion.</li>
	<li>Senken Sie die stereotaktischen Arm, bis die Spitze der Nadel die Tropfen erreicht. Zeichnen Sie die Probe durch ziehen (sehr langsam) den Kolben der Spritze Mikroinjektion, Blasenbildung zu vermeiden. Ersetzen Sie die Pumpe Drücker in Kontakt mit dem Kolben und schalten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 0,3 µL/min Wartezeit bis zur Bildung eines Tropfens (wenige Minuten) bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Hinweis: Im vorliegenden Beispiel Experiment wurde künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) im Striatum infundiert (AP: 1,5 ML: ±2.7; DV: -5,0) und im dorsalen Hippocampus (AP: -3,5, ML: ±2.1; DV:-3.5; in mm von Dura) 2 µL/Website. Um den Vergleich zwischen den beiden Methoden zu erleichtern, wurde jeder Bereich des Gehirns infundiert mit einer Quarz-Nadel in einer Hemisphäre und eine stumpfe Spitze 26 G oder 30 G Abschrägung-Tip Edelstahl Nadel in die andere.</li>
	<li>Senken Sie der Fluss auf 0,1 µL/min, nick die Dura mit einer Edelstahl-Fase-Tip-Nadel und senken Sie langsam die stereotaktischen Arm auf die dorsal-Ventral-Axt, Eintritt in das Hirngewebe. Wenn die gewünschte Position erreicht ist, gehen Sie unten zusätzliche 0,1 mm, die Pumpe zu stoppen, die stereotaktischen Arm von 0,1 mm zu erhöhen und starten Sie erneut die Pumpe an den Fluss auf 0,3 µL/min. Hinweis: Der Grund, eine langsame Strömung pflegen und senken die Nadel soll einen positiven Druck sichergestellt, der Eindringen von kleinen Fragmente von Gewebe in die Nadel selbst vermeidet. Ein solches würde den Tipp, beeinträchtigen die Lieferung der Lösung behindern. Da die Durchflussmenge sehr langsam ist, während die Nadel und die Geschwindigkeit der Senkung zu senken ca. 10 s/mm ist, bedeutet dies, dass die Mengen der Lösung, die entlang der Strecke Nadel bleiben vernachlässigbar im Vergleich zu denen an den Zielstandort injiziert. Diese Vorsichtsmaßnahme kann vermieden werden, wenn Nadeln mit seitlichen Bohrungen zu verwenden.</li>
	<li>Starten Sie die Stoppuhr und warten Sie, die benötigte Zeit je nach der gewünschten Lautstärke zu injizieren (z. B. 6 min 40 s wenn 2 µL injizieren). Überwachen Sie die Blase Bewegung während der Injektion. Am Ende stoppen Sie die Pumpe zu und warten Sie 5 min, bevor die Nadel langsam abrufen. Wenn die Quarz-Nadel vollständig extrahiert wird, starten Sie die Pumpe wieder und überprüfen Sie für die Bildung eines Tropfens an der Spitze der Nadel.</li>
	<li>Verschließen der Öffnung in der Oberfläche der Schädel mit Knochen Wachs, hämostatischen Clips entfernen und Naht der Kopfhaut, das Gebiet rund um die Wunde mit einer antibiotischen Creme (z.B. Neosporin) zu beschichten und das Tier zu Hause Käfig zurückkehren. Hinweis: Im Anschluss an die Euthanasie-Protokoll genehmigt durch die institutionellen Ethik-Ausschuß für die Experimente, die in diesem Artikel beschriebenen Tiere waren tief mit einer Injektion i.p. 43 mg/kg Ketamin und 7 mg/kg Xylazin betäubt und enthauptet. Gehirne wurden entfernt, postfixed in Formalin für 48 h und Paraffin eingebettet. Koronalen Abschnitte des Gehirns (8 µm) wurden mit einem Mikrotom geschnitten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat.">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li><li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity.">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li><li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+pay+attention:+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation,+diurnality,+and+performance.">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li><li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+to+the+central+nervous+system.">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li><li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders.">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li><li>Bj&#246;rklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin,+Quinolinic+Acid,+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes.">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li><li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model.">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li><li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors.">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li><li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes.">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li><li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic:+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae.">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Artikel beschriebene Verfahren erfüllt die Bedürfnisse dargelegt in der Einleitung zur Optimierung Mikroinjektionen, die für verschiedene Zwecke12ausgeführt werden. Die hier beschriebenen Nadeln reduzieren Schäden auf ein minimum, im Wesentlichen nicht detektierbare Niveau; an der Abweichung mit Glas-Nadeln (, die anfällig für biegen), Quarz-Nadeln sind starr und gewährleisten einen zuverlässige Hit von der gewünschten Hirnregion sogar in tiefen Koordinaten. Zu...

Mikroinjektionen wurden für eine lange Zeit für die Lieferung von pharmakologisch wirksamen Verbindungen zur neuronalen Aktivität in bestimmten Hirnarealen zu modulieren. Darüber hinaus wurden sie zur Giftstoffe in der Nähe von bestimmten neuronalen Populationen, um Neurodegenerative Veranstaltungen charakteristisch für bestimmte Krankheiten, z. B. 6-hydroxy-Dopamin im Nigrostriatal Dopaminsystem der Parkinson-Krankheit zu imitieren zu imitieren injizieren 1 , 2 oder Immunotoxin 192 IgG Saporin, Läsion der cholinergen System3. Vor kurzem wurden Mikroinjektion Verfahren zur viralen Vektoren oder Zellen Transplantate für experimentelle Gehirn Störungen4,5gen oder Zelle Therapie liefern.
Die klassische Art der Nadeln, die in diesen Studien beschäftigt ist aus Edelstahl gefertigt. Obwohl einfach und praktisch in der Handhabung, Stahl Nadeln haben eine Reihe von Problemen6: sie sind relativ groß und kann dazu führen, dass Gewebeschäden, mit Austritt von Blut - Hirn-Schranke und Aktivierung der Astrozyten; Darüber hinaus können sie produzieren, Entkernung des Hirngewebes, die in die Nadel ein Hindernis oder sogar ganz vermeiden Strömung der gewünschten Lösung kommt. In jüngerer Zeit, verwenden Glas Nadeln bereit ad hoc aus Kapillaren wurden eingeführt in7,8. Diese verursachen keine signifikante Gewebe Schaden oder Astrozyten Aktivierung, aber sind relativ flexibel und können verbiegen als Tiefenstrukturen, reduziert die Genauigkeit der Lokalisierung (persönliche Beobachtungen) eingeführt.
Daher besteht die Notwendigkeit, so viel wie möglich Schaden zu reduzieren (vor allem bei Experimente, um Schaden zu heilen) und Erhöhung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit (d.h., sicherzustellen, dass alle Lösung geliefert wird und korrekte Lokalisierung zu gewährleisten). Darüber hinaus wäre es wünschenswert, verschiedenen Nadel Designs zu verwenden, zur Gewährleistung einer optimalen Verteilung der injizierten Lösung in Hirnarealen mit unterschiedlichen Geometrien. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll um vorzubereiten und Quarz Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn. Aufgrund der hohen Schmelzpunkt Quarz Kapillaren können nicht auf einem herkömmlichen Abzieher gezogen werden und daher nicht verwendet wurden in der Vergangenheit, um Nadeln zu generieren. Quarz, bietet jedoch einige wichtige Vorteile gegenüber Glas, insbesondere eine hohe Steifigkeit und Pause Widerstand9. Infolge ihrer Unbeugsamkeit sind Quarz Nadeln geeignet für Injektionen in ventralen Hirnregionen. Durch ihre hohe Beständigkeit gegen Bruch können sie modelliert werden, um mehrere Löcher, Erlangung Designs, die am effektivsten erweisen, selbst wenn Gehirnregionen mit komplexen Geometrien10gezielt erweitert.

<table><tbody><tr><td>Quartz capillaries</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td><td>Q100-50-10</td><td>Without filament</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette storage jar</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissector</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&amp;Yuml;tzerbach, Germany</td><td>19138-U</td><td></td></tr><tr><td>Microinfusion pump</td><td>Univentor, Zejtun, Malta</td><td>Model 864</td><td></td></tr><tr><td>Manual microinjection pump kit</td><td>WPI</td><td>Item#: MMP-KIT</td><td>Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame</td></tr><tr><td>Precision Drill</td><td>Proxxon</td><td>28510 MicroMot 50/E</td><td>Ball bearing drive shaft with variable speed</td></tr><tr><td>Artficial Cerebral Spinal Fluid</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel</td><td>Hamilton</td><td>26 G Blunt: 19138-U&lt;br/&gt; 30 G Bevel: 20757</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Germany</td><td>LEICA RM212RT</td><td></td></tr></tbody></table>

personalized needles for microinjections in the rodent brain

Mikroinjektionen werden für eine lange Zeit für die Lieferung der Medikamente oder Giftstoffe in bestimmten Hirnarealen, und in jüngerer Zeit, sie wurden verwendet, um gen oder Zelle Therapie-Produkte zu liefern. Leider, aktuelle Mikroinjektion Techniken verwenden, Stahl oder Glas Nadeln, die aus mehreren Gründen suboptimal sind: insbesondere Stahl Nadeln können dazu führen, dass Gewebeschäden und Glas Nadeln können verbiegen, wenn tief ins Gehirn, senkte die Zielregion fehlt. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Quarz-Nadeln, die eine Reihe von nützlichen Funktionen kombinieren verwenden. Diese Nadeln produzieren keine nachweisbaren Gewebeschädigung und als sehr steif, zuverlässige Lieferung in die gewünschte Hirnregion zu gewährleisten, auch wenn Sie Tiefe Koordinaten verwenden. Darüber hinaus ist es möglich, das Design der Nadel zu personalisieren, indem man mehrere Löcher von den gewünschten Durchmesser. Mehrere Bohrungen erleichtern die Injektion von großen Mengen der Lösung innerhalb eines größeren Bereichs, während große Löcher die Injektion von Zellen erleichtern. Darüber hinaus können diese Quarz-Nadeln gereinigt und wiederverwendet, so dass das Verfahren kostengünstiger wird.

Wir verglichen Schäden induziert durch direkte Mikroinjektion in der Ratte dorsalen Hippocampus und Striatum mit einer Quarz-Nadel (60 µM Außendurchmesser Tipp; 20 µM Durchmesser Bohrung Typ C, Abbildung 1) verglichen mit zwei Klassiker, stumpfen Ende 26 G und 30 G schräge Kante Edelstahl-Nadeln. Zu diesem Zweck wir injiziert 2 µL der ACFS rechts und links dorsalen Hippocampus und Striatum mit bzw. Quarz und Stahlnadel und 48 h nach der Injektion, wir G...

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Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Mikroinjektion im Nagetier Gehirn, das Quarz-Nadeln verwendet. Diese Nadeln nicht nachweisbar Gewebeschäden zu produzieren und zuverlässige Lieferung auch in tiefen Regionen zu gewährleisten. Darüber hinaus können sie Forschungsbedarf durch personifizierte Entwürfe angepasst und können wiederverwendet werden.

Personalisierte Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

personalized-needles-for-microinjections-in-the-rodent-brain

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Aufrufe.  University of Ferrara. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Mikroinjektion im Nagetier Gehirn, das Quarz-Nadeln verwendet. Diese Nadeln nicht nachweisbar Gewebeschäden zu produzieren und zuverlässige Lieferung auch in tiefen Regionen zu gewährleisten. Darüber hinaus können sie Forschungsbedarf durch personifizierte Entwürfe angepasst und können wiederverwendet werden.

Serie: Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Forschung

Neurowissenschaften

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

Targeting von Deep Brain Strukturen mit Mikroinjektionen für die Lieferung von Drogen, virale Vektoren oder Zelltransplantaten

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Verhalten

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Gleichzeitige Elektrophysiologische Aufzeichnung und Micro-Injektionen von Hemmstoffe im Gehirn von Nagetieren

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal resolution from shallow and deep brain regions. Their use has been hindered, however, by mechanical and structural mismatches between the probes and brain tissue that commonly lead to micromotion and gliosis with resulting signal instability in chronic recording experiments. In contrast, following the implantation of ultraflexible mesh electronics via syringe injection, the mesh probes form a seamless, gliosis-free interface with the surrounding brain tissue that enables stable tracking of individual neurons on at least a year timescale. This protocol details the key steps in a typical mouse neural recording experiment using syringe-injectable mesh electronics, including the fabrication of mesh electronics in a standard photolithography-based process possible at many universities, loading mesh electronics into standard capillary needles, stereotaxic injection in vivo, connection of the mesh input/output to standard instrumentation interfaces, restrained or freely moving recording sessions, and histological sectioning of brain tissue containing mesh electronics. Representative neural recordings and histology data are presented. Investigators familiar with this protocol will have the knowledge necessary to incorporate mesh electronics into their own experiments and take advantage of the unique opportunities afforded by long-term stable neural interfacing, such as studies of aging processes, brain development, and the pathogenesis of brain disease.

Mesh electronics probes seamlessly integrate and provide stable, long-term, single-neuron level recording within the brain. This protocol uses mesh electronics for in vivo experiments, involving the fabrication of mesh electronics, loading into needles, stereotaxic injection, input/output interfacing, recording experiments, and histology of tissue containing mesh probes.

Spritze-injizierbaren Mesh Elektronik für stabile chronische Nagetier Elektrophysiologie

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

Biotechnik

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Manipulation von einzelnen neuronalen Stammzellen und Neuronen in Gehirnscheiben mit Robotik-Mikroinjektion

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Durchführung einer intrazerebroventrikulären Injektion bei Mäusen mit einem Freihandansatz

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. An intracerebroventricular (ICV) injection allows the widespread delivery of the experimental agent throughout the brain (particularly in the structures near the ventricles). Here, methods for making free-hand ICV injections in adult mice are described. By using visual and tactile landmarks on the heads of mice, injections into the lateral ventricles can be made rapidly and reliably. The injections are made with a glass syringe held in the experimenter&#39;s hand and placed at approximate distances from the landmarks. Thus, this technique does not require a stereotaxic frame. Furthermore, this technique requires only brief isoflurane anesthesia, which permits the subsequent assessment of mouse behavior and/or physiology in awake, freely behaving mice. Free-hand ICV injection is a powerful tool for the efficient delivery of experimental agents into the brains of living mice and can be combined with other techniques such as frequent blood sampling, neural circuit manipulation, or in vivo recording to investigate neuroendocrine processes.

Autor im Rampenlicht: Erkenntnisse, Innovationen und zukünftige Wege in der reproduktiven Neurokontrolle 

Here, a simple and rapid approach for performing intracerebroventricular injections in mice using a free-hand approach (that is, without a stereotaxic device) is described.

Intrazerebroventrikuläre Freihandinjektionen bei Mäusen

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

Personalisierte Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

Targeting von Deep Brain Strukturen mit Mikroinjektionen für die Lieferung von Drogen, virale Vektoren oder Zelltransplantaten

Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren

Gleichzeitige Elektrophysiologische Aufzeichnung und Micro-Injektionen von Hemmstoffe im Gehirn von Nagetieren

Spritze-injizierbaren Mesh Elektronik für stabile chronische Nagetier Elektrophysiologie

Manipulation von einzelnen neuronalen Stammzellen und Neuronen in Gehirnscheiben mit Robotik-Mikroinjektion

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Intrazerebroventrikuläre Freihandinjektionen bei Mäusen

Intrazerebroventrikuläre Freihandinjektionen bei Mäusen

Intrazerebroventrikuläre Freihandinjektionen bei Mäusen