ברצוננו להודות חוות סמית&#39;פילד על תרומת רקמת הריאה החזירית ללא פגע. אנו רוצים גם להודות לד&quot;ר הו יאנג, ד&quot;ר כריסטינה טאנג והמחלקה לכירורגיה פלסטית VCU עבור ומאפשר לנו להשתמש בציוד שלהם. דגימות הידרוג&#39;ל ורקמות הוכנו עבור SEM במחלקה לאנטומיה VCU מתקן מיקרוסקופית לנוירוביולוגיה נתמך, בין השאר, על ידי מימון NIH-NINDS מרכז Core גרנט 5 P30 NS047463 ו, בין השאר, על ידי טופס מימון גרנט תמיכה במרכז לחקר הסרטן NIH-NCI CA016059 P30. הדמיה SEM של דגימות במתקן אפיון Core ננוטכנולוגיה VCU (NCC). עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע, CMMI 1,351,162.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פִּתָרוֹן </td><td> סינון סטרילי </td><td> כיווני </td></tr><tr><td> DiH 2 O </td><td> כן </td><td> DiH 2 O; סטרילי מסונן </td></tr><tr><td> פתרון 0.1% Triton X-100 </td><td> כן </td><td> מתחת למכסה המנוע קטר להוסיף 100 μl טריטון-X 100 פתרון ל -100 מ&quot;ל DiH 2 O ו להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי. </td></tr><tr><td> 2% פתרון Deoxycholate </td><td> כן </td><td> מתחת למכסה המנוע קטר להוסיף פתרון נתרן Deoxycholate 2 g לכל 100 מ&quot;ל DiH 2 O ו להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> כן </td><td> הוסף 58.44 גרם NaCl 1 ליטר של DiH 2 O; להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי </td></tr><tr><td> פתרון DNase </td><td> כן </td><td> להוסיף 12,000יחידות DNase עד 1 L DiH 2 O; הוסף 0.156 גרם MgSO 4 (נטול מים), ו 0.222 גרם CaCl 2; להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי </td></tr><tr><td> PBS </td><td> כן </td><td> שלב 27.2 גרם Na 2 4 HPO · 7H 2 O (dibasic heptahydrate), 80 גרם NaCl, ו -2 גרם KCl עם 10 L DiH 2 O; להתסיס עד שהיא נמסה; כדי להתאים את pH 7.4; סינון סטרילי </td></tr></tbody></table> טבלה 1: הפתרונות הנדרשים עבור רקמות Decellularization. הפוך את הפתרונות הנ&quot;ל לתהליך decellularization. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. כ 2.5 L יהיה צורך ריאות חזיריות אחד. 1. גיבוש הידרוג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשר חזירים ריאות Decellularization (עיבוד אזכור 9,10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג, ריאה חזירית נורמלית כמקשה אחת, מביית מטבחיים, עם לב vasculature ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי רקמות או אזמל כדי לנתח משם בלב, חיתוך כלי דם קרוב ככל האפשר אל הלב, כלי דם נותרים ישמשו בצעדים מאוחר יותר עבור זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את הרקמה החיבורית סביב קנה הנשימה, הסמפונות, כלי הדם באמצעות אזמל או מספריים. הערה: בדוק הריאה הטובה ביותר להשתמש למשך שארית של ההליך על ידי בחירת ריאות ללא חתכים גדולים או דקירות דרך הצדר וכמויות גדולות של תמט הריאות או חסימה בכלי הדם שעלולות לעכב את האפקטיביות של תהליך decellularization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הריאות לא הטובות עוזב הסמפונות כפי מאוד קשור אליו קנה הנשימה ככל האפשר (לב, רקמת חיבור ואת האונות של הריאה הוסרה עלול להיות מסולק). לא צריך להיות ריאה אחת נותרים מצורפות קנה נשימת כלי הדם. הערה: שמור חלקים עבור היסטולוגיה אם תרצה בכך. 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור הסמפונות מנותקים עם מהדק או תפר pbackflow העודף יימנע. </li></ol><ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות decellularization ושומרים במקרר ב 4 מעלות צלזיוס עד הצורך (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות משאבת יד cannulated כדי להתאים את עורק הריאה, perfuse רקמת הריאה 3 פעמים עם מים די דרך הן עורק קנה נשימה ריאתי. Perfuse כלי הדם ראשון בכל פעם. בגין עם כ 1 ליטר לתוך כלי הדם ו -1.5 L לתוך קנה הנשימה עבור כל זלוף, אבל כמו פסולת הסלולר מוסר יותר נוזלי ניתן perfused דרך המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול רקמת הריאה ב Triton X-100 הפתרון למשך 24 שעות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון deoxycholate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את קטעי רקמה ב deoxycholate למשך 24 שעות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול רקמות בתמיסה מסוננת NaCl עבור שעה 1 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול רקמות בתמיסה DNase מסונן עבור שעה 1 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה 5 פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משם לנתח רקמות סחוס מורגשות, קנה נשימה וכל tubules 2 מ&quot;מ או גדול בקוטר (נמצא בעיקר סביב hilum מנות המדיאלי של הריאות) מעריכת דרך נשימה, עוזבת אזורי נשימה בלבד (בפריפריה בעיקר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח רקמה לתוך 1 סעיפי אינץ או קטנים יותר. כיווניות של הרקמה לא משנה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את רקמות נוזלי במקום עודף 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי. להקפיא את הרקמה ב -80 ° C. הערה: שמור חלקים עבור היסטולוגיה כדי להבטיח הסרה של תאים debri הסלולרהים, אם תרצה בכך. אנו משתמשים H &amp; E, α-galactosidase, PicoGreen, hydroxyproline, ninhydrin, כחול, SDS-PAGE alcian, ו ספקטרומטריית מסה לאפיין. 9 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מכסים משפופרות קפוא המכיל רקמת הריאה decellularized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים נייר הסינון על פתיחת צינור ומאובטח עם גומייה. הערה: Tube ותכנים עדיין צריך להיות קפוא אחרת למקם -80 ° C עד קפוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize הרקמה עד שכל הנוזלים העודפים נעלם, בעזרת מייבש להקפיא לפי ההוראות של היצרן. חנות ב -80 ° C עד מוכן הטחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התחילה להוסיף חנקן נוזלי כדי טחנה במקפיא כדי לקרר בידוד רכיבים פנימיים תנאי עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר בר טחנת מגנטים מצינור טחנה ולהוסיף רקמות כדי לכסות תחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלף בר טחן ולהוסיף רקמות ארוזות בצורה רופפת. בר הטחנה עדיין צריך לנוע בחופשיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את צינור הטחנה ו- PLAce ב טחנה במקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו חנקן נוזלי כדי לקו מילוי מקסימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקפיא טחנת כל רקמות לאבקה בסדר (כ 5 דק &#39;, שיעור impaction של ~ 600 דקות -1), בתוך גליל פוליקרבונט עם impactor נירוסטה וכן אטמי סוף נירוסטה באמצעות טחנת במקפיא לפי ההוראות של היצרן. חנות ב -80 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרו-נקבובי היווצרות קריש (8 מ&quot;ג / מ&quot;ל) (מותאם מ אזכור 9,11) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (w / v) של אבקת decellularized ו -0.1% (w / v) של פפסין 0.01 M HCl, תחת תסיסה מתמדת (אמור להיות מסוגל לראות זרימה ברמה העליונה של נוזל), בטמפרטורת החדר, עבור 48 שעות. הערה: האבקה טעונה באופן סטטי, כך הוספת HCl לאחר האבקה מעניקה את ההזדמנות לשטוף את העודף מקירות הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העיכול של 48 שעות, במקום פתרון ריאגנטים על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות% 10 בקירור (v / v) 0.1 M NaOH, גידולד 11.11% (v / v) 10x PBS (להביא את הפתרון כולו 1x ריכוז), להביא את הפתרון חלבון מתעכל ל- pH הפיזיולוגי של 7.4. הערה: הפתרון כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. בצע קינטיקה gelation באמצעות rheometry 9 אם תרצה בכך. </li></ol></li></ol> 2. Cross-linking הידרוג כדי לשפר את חוזק מכני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות של 1%, 0.1%, ו 0.01% w / פתרון crosslinking נ genipin הוכנו על ידי המסת את הסכום הדרוש של אבקת genipin ב 10% DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון וורטקס כל 15 דקות במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון genipin לכסות הידרוג ECM (100 μL לכל גם צלחת 96-היטב) כי הורכבו בעבר חלק 1.3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו כל הידרוג&#39;ל ECM כדי crosslink למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את הידרוג ECM 3 פעמים עם PBS עד פתרון הכביסה כבר לא כחול. הידרוג crosslinked לאחר מכן ניתן יהיה מוכן אפיון נוסף ו- CEלימודי התרבות השני של השנה. </li></ol> 3. תרבית תאים עם Microporous ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי דו מימדי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בפתרון מ 1.3.3, להוסיף 20 μl של פתרון pregel היטב בכל צלחת תרבות 96-היטב שאינם מטופלים רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לילה במקרר ב 4 ° C כדי לאפשר חלבון ספיחה לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב pregel הפתרון ולשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10,000 תאים / 2 ס&quot;מ לבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדל תקשורת 100 μl לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש תרבית תאים ממדית 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתרון מ 1.3.3, resuspend התאים pelleted לריכוז של 1,000,000 תאים / מ&quot;ל ​​של תמיסת pregel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לוותר 16 μl של השעיה pregel תאים לבאר כל צלחת 96-היטב, כדי ליצור ~ 500 מיקרומטר הידרוג&#39;ל עבה עבור תרבית תאים 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30דקות עבור הג&#39;ל על מנת ליצור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של התקשורת לראש הידרוג נוצר לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש תרבית תאי ממדים על ג&#39;לים קשיחות משתנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתרון מ 1.3.3, פיפטה 100 μl של פתרון pregel לבאר כל צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עבור הג&#39;ל על מנת ליצור. הערה: Cross-linking צעדים מחלק 2 ניתן להשתמש כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10,000 תאים / 2 ס&quot;מ לבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדל תקשורת 100 μl לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 3D Cell Culture. , (2011).</li><li>Walker, J. M., Ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epithelial cell culture protocols. , (2012).</li><li>Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+a+biological+scaffold+material:+Structure+and+function.">Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function.</a> Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).</li><li>Koo, H. -. J., Lim, K. -. H., Jung, H. -. J., Park, E. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+evaluation+of+gardenia+extract,+geniposide+and+genipin.">Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin.</a> J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).</li><li>Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+Material+Properties+of+Cardiac+Matrix+Hydrogels+to+Induce+Endothelial+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells.">Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).</li><li>Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+bone+regeneration+using+porcine+small+intestinal+submucosa.">Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa.</a> J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).</li><li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung:+the+matrix+reloaded.">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li><li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix.">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).</li><li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype.">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS One. 5 (9), e12905 (2010).</li><li>Ratner, B. D., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials:+where+we+have+been+and+where+we+are+going.">Biomaterials: where we have been and where we are going.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).</li><li>Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+initiation+and+growth+of+tumor+cell+lines,+cancer+stem+cells+and+biopsy+material+in+mice+using+basement+membrane+matrix+protein+(Cultrex+or+Matrigel)+co-injection.">Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).</li><li>Zhang, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstruction+of+lung+alveolus-like+structure+in+collagen-matrigel/microcapsules+scaffolds+in+vitro.">The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+Normal+and+Fibrotic+Human+Lung+Matrices+as+a+Culture+System+for+In+Vitro+Investigation.">Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).</li><li>Matsuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+human+lung+stem+cells.">Evidence for human lung stem cells.</a> N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).</li><li>Zuo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+Krt5++distal+airway+stem+cells+are+essential+for+lung+regeneration.">p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration.</a> Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).</li><li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response.">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li><li>Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

אחד ההיבטים של ביולוגיה הנפרדים הוא הארגון-העצמי של מולקולות לתוך מבנים היררכיים לבצע משימה ספציפית. 13 במעבדה, הרכבה עצמית תלויה בגורמים רבים כגון ריכוז מלח, pH, ומשך העיכול. כפי שניתן לראות, נוצר הידרוג&#39;ל מתארגנת מעצמה כאשר חלבונים solubilized לחזור לטמפרטורה פיזי?...

Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6. 
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research. 
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.

<table><tbody><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100g</td><td>Use in hood with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500g</td><td>None</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-500g</td><td>None</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td>None</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td>Use with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td>Use with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Wako Chemicals</td><td>078-03021</td><td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-151</td><td>None</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-448</td><td>None</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Hand pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-239-1</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Graduate Beaker</td><td>VitLab</td><td>445941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cryomill</td><td>SPEX</td><td>6700</td><td>Use cryogloves and eye protection.</td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>FTS FlexiDry</td><td></td><td>Use gloves.</td></tr><tr><td>Rheometer</td><td>Discovery</td><td>HR-2</td><td>Use gloves and eye protection.</td></tr></tbody></table>

tunable hydrogels from pulmonary extracellular matrix for 3d cell culture

כאן אנו מציגים שיטה לקביעת הידרוג תרבות רכיב תאים מרובה עבור תרבית תאי ריאות במבחנה. החל רקמת ריאה בריאה כמקשה אחת מן חזירי, חולדה או עכבר, הרקמה perfused ו שקוע דטרגנטים כימיים הבאים כדי להסיר את פסולת הסלולר. השוואת היסטולוגית של הרקמה לפני ואחרי עיבוד מאשרת הסרה מעל 95% של מכתים galactosidase דנ&quot;א אלפא גדילים כפול מרמזת רוב פסולת הסלולר מוסר. לאחר decellularization, הרקמה lyophilized ואז cryomilled לאבקה. אבקת מטריקס מתעכלת במשך 48 שעות בתמיסת עיכול פפסין חומצי ולאחר מכן לנטרל כדי ליצור את פתרון pregel. Gelation של פתרון pregel יכול להיגרם על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש מייד הנטרול הבא או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות. ציפוי יכול להיווצר באמצעות הפתרון pregel על צלחת שאינם מטופלים עבור גמצורף ell. תאים יכולים להיות תלוי pregel לפני הרכבה עצמית כדי להשיג תרבות 3D, מצופה על פני השטח של ג&#39;ל נוצר שממנו התאים יכולים להעביר דרך הפיגום, או מצופים על הציפויים. שינויים אל המתווה שהוצג יכול להשפיע טמפרטורה gelation, כוח, או בגדלים מקטעי חלבון. מעבר היווצרות הידרוג&#39;ל, נוקשות הידרוג&#39;ל ניתן להעלות באמצעות genipin.

באמצעות שיטה זו, הפקנו הידרוג מן החזיר רגיל, חולדה, וריאות עכבר (איור 1). ריאות מעובד לספק מוערכת של 5 מ&quot;ג, 40 מ&quot;ג, ו -10 גרם של אבקת ECM בהתאמה. סקירה כללית של התהליך מוצג באיור 2. חזותי מפתח בתהליך כולל: מראה לבן של הריאות אחרי שטיפת deoxyc...

Watch this Scientific Journal Video about Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture at JoVE.com

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

tunable-hydrogels-from-pulmonary-extracellular-matrix-for-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K Views.  Virginia Commonwealth University.  זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים. 

Video: Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Biochemistry

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג&#39;ל Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

תרבית תאים זגוגית אלסטי Porated Hydrogels כמו קרום המרתף ביונים עבור כפול

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes and therapeutic responses. Accounting for matrix effects earlier in the drug development pipeline is expected to increase the likelihood of clinical success of novel therapeutics. Biomaterial-based strategies recapitulating specific tissue microenvironments in 3D cell culture exist but integrating these with the 2D culture methods primarily used for drug screening has been challenging. Thus, the protocol presented here details the development of methods for 3D culture within miniaturized biomaterial matrices in a multi-well plate format to facilitate integration with existing drug screening pipelines and conventional assays for cell viability. Since the matrix features critical for preserving clinically relevant phenotypes in cultured cells are expected to be highly tissue- and disease-specific, combinatorial screening of matrix parameters will be necessary to identify appropriate conditions for specific applications. The methods described here use a miniaturized culture format to assess cancer cell responses to orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation. Specifically, this study demonstrates the use of this platform to investigate the effects of matrix parameters on the responses of patient-derived glioblastoma (GBM) cells to chemotherapy.

The present protocol describes an experimental platform to assess the effects of mechanical and biochemical cues on chemotherapeutic responses of patient-derived glioblastoma cells in 3D matrix-mimetic cultures using a custom-made UV illumination device facilitating high-throughput photocrosslinking of hydrogels with tunable mechanical features.

מערכי הידרוג'ל מאפשרים תפוקה מוגברת לסינון השפעות של רכיבי מטריצה וטיפולים במודלים תלת-ממדיים של גידולים

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

הידרוג'לים מודפסים ביולוגית הניתנים לצילום כדי לחקור תגובות תאיות להתקשות ECM

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture platforms and dynamically triggering changes, such as increasing microenvironmental stiffness, enables researchers to model changes in the extracellular matrix (ECM) that occur during fibrotic disease progression. Herein, a method is presented for 3D bioprinting a phototunable hydrogel biomaterial capable of two sequential polymerization reactions within a gelatin support bath. The technique of Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting was adapted by adjusting the pH of the support bath to facilitate a Michael addition reaction. First, the bioink containing poly(ethylene glycol)-alpha methacrylate (PEG&#945;MA) was reacted off-stoichiometry with a cell-degradable crosslinker to form soft hydrogels. These soft hydrogels were later exposed to photoinitator and light to induce the homopolymerization of unreacted groups and stiffen the hydrogel. This protocol covers hydrogel synthesis, 3D bioprinting, photostiffening, and endpoint characterizations to assess fibroblast activation within 3D structures. The method presented here enables researchers to 3D bioprint a variety of materials that undergo pH-catalyzed polymerization reactions and could be implemented to engineer various models of tissue homeostasis, disease, and repair.

מחבר זרקור: הבנת מחלות ריאה כרוניות באמצעות הידרוג'לים פוטו-ממדיים מודפסים בתלת-ממד 

This article describes how to 3D bioprint phototunable hydrogels to study extracellular matrix stiffening and fibroblast activation.

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית הידרוג'לים פוטו-ממדיים לחקר הפעלת פיברובלסטים

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...