המחברים תודה פאלמר, ה באבו (סטנפורד נוירוכירורגיה) למתן מאתר באמנות NPCs. וקטור באיור 4 בשימוש ומותאמים מאמנות רפואי שרת תחת יצירתי של מלאי ייחוס 3.0 רישיון (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). חלק מעבודה זו בוצעה ב סטנפורד ננו משותפים מתקנים (SNSF), הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת פרס מרכזים לגיל הרך-1542152. N.A.S. מאשר תמיכה מן הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים (32GM 008412). ובין מאשר תמיכה של NRSA NIH מראש דוקטורט (F31 EB020502), חוקרים לגשת לתוכנית של Siebel. S.C.H. מאשר תמיכה של מכוני הבריאות הלאומיים (U19 AI116484 ו- R21 EB018407), הקרן הלאומית למדע (DMR 1508006), מכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית (RT3-07948). מחקר זה קיבל מימון הברית עבור הדרכה (AR3T), ומחקר השיקום רגנרטיבית נתמך על ידי יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי הילד לבריאות והתפתחות האדם (NICHD), המכון הלאומי הפרעות נוירולוגיות שבץ (NINDS) ו המכון הלאומי של הדמיה ביו, בביו-הנדסה (NIBIB) של המכונים הלאומיים לבריאות תחת P2CHD086843 מספר פרס. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים של מכוני הבריאות הלאומיים.

<ol>
	<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension.">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+perturbation+in+vitro-A+growing+case+for+three-dimensional+(3D)+culture+systems.">Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expression+of+differentiated+functions+in+hepatocytes+cultured+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix.</a> Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+opens+new+dimensions+in+cell-based+assays.">3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays.</a> Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Madl, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+neural+progenitor+cell+stemness+in+3D+hydrogels+requires+matrix+remodelling.">Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling.</a> Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate.">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+Regulates+Fate+Decisions+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells.</a> PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).</li><li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+Role+of+Matrix+Stiffness+in+3D+Cell+Migration+and+Remodeling.">Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling.</a> Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).</li><li>Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+osteogenic+and+myogenic+differentiation+of+MSCs:+interplay+of+stiffness+and+adhesive+ligand+presentation.">Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).</li><li>Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+three-dimensional+engineered+protein+hydrogels+for+tailored+control+of+neurite+growth.">Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth.</a> Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).</li><li>Kilian, K. A., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+Stem+Cell+Fate+by+Controlling+the+Affinity+and+Density+of+Ligand-Receptor+Interactions+at+the+Biomaterials+Interface.">Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).</li><li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Hydrogel+Substrates+with+Tunable+Mechanical+Properties.">Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Materials+through+Modular+Protein+Engineering.">Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering.</a> Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+and+characterization+of+elastin-like+polypeptides+(ELPs)+with+variable+guest+residues.">Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues.</a> Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).</li><li>McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Topographic+Imaging+of+Environmentally+Responsive,+Elastin-Mimetic+Hydrogels.">High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels.</a> Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).</li><li>McMillan, R. A., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Characterization+of+Elastin-Mimetic+Protein+Gels+Derived+from+a+Well-Defined+Polypeptide+Precursor.">Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor.</a> Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).</li><li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrakis(hydroxymethyl)+Phosphonium+Chloride+as+a+Covalent+Cross-Linking+Agent+for+Cell+Encapsulation+within+Protein-Based+Hydrogels.">Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).</li><li>Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+RGD+ligand+density+and+L1CAM-mediated+Schwann+cell+interactions+synergistically+enhance+neurite+outgrowth.">Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth.</a> Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).</li><li>Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+elastin-like+polypeptide+nanoparticles.">Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles.</a> Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).</li><li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering.">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li><li>Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Selective+Functionalization+for+Bio-Orthogonal+Cross-Linking+of+Engineered+Protein+Hydrogels.">Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).</li><li>Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+protein-hyaluronic+acid+(ELP-HA)+hydrogels+with+decoupled+mechanical+and+biochemical+cues+for+cartilage+regeneration.">Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration.</a> Biomaterials. , 132-140 (2017).</li><li>Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Orthogonally+Crosslinked,+Engineered+Protein+Hydrogels+with+Tunable+Mechanics+and+Biochemistry+for+Cell+Encapsulation.">Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation.</a> Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).</li><li>Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+elastin-like+polypeptide+hydrogels+with+grafted+VEGF-mimetic+peptides.">One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides.</a> Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).</li><li>Straley, K. S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+tuning+of+multiple+biomaterial+properties+using+protein+engineering.">Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering.</a> Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).</li><li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli.">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li><li>Graumann, K., Premstaller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+recombinant+therapeutic+proteins+in+microbial+systems.">Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems.</a> Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).</li><li>Tashiro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Peptide+Containing+the+IKVAV+Sequence+from+the+A+Chain+of+Laminin+Mediates+Cell+Attachment,+Migration,+and+Neurite+Outgrowth.">A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ביטוי חלבון רקומביננטי טיהור הוא כלי רב עוצמה כדי לסנתז biomaterials עם הפארמצבטית גבוהה. בעיקר בשל כניסתו של שיבוט מולקולרי ממוסחר, פלסמידים רקומביננטי מותאם אישית ניתן לרכוש מהספקים מספר, אשר מפחית באופן משמעותי את הזמן כדי לעבוד עם חומרים כמו ELPs. באופן דומה, ניתן לבקש פלסמידים ישירות מן המעב?...

במהלך המאה האחרונה, מימדי תרביות רקמה (2D) התפתחה כלים אינטגרלי ללמוד תא יסוד ביולוגיה במבחנה. בנוסף, הפרוטוקולים יחסית נמוכים ופשוטים לקבלת תרבית תאים 2D הובילו האימוץ שלה על פני תחומים רבים ביולוגי ורפואי. עם זאת, מחקרים שנעשו בעבר הראו כי פלטפורמות 2D מסורתי עשוי להוביל לתוצאות כי לסטות בצורה ניכרת האלה שנאספו ויוו, גורם זמן יקר ומימון מבוזבז עבור מחקר קליני מונחה1,2, 3. אנחנו ואחרים משערים כי אי-התאמה זו לייחס חוסר רמזים הביוכימי, biophysical יליד מסופקים על התאים תרבותי על משטחים 2D, אשר יכול להיות הכרחי עבור הפצת אופטימלית, ההבשלה של סוגי תאים שונים.
כדי לטפל אלה גשר מגבלות ולעזור הפער בין 2D מחקרים במבחנה , ויוו , חוקרים יש פלטפורמות מפותחת הידרוג תלת מימדי (3D) התא-כימוס1,4,5 ,6. Hydrogels הם חומרים אידיאלי כדי לסכם את microenvironment אנדוגני של ה מטריצה חוץ-תאית (ECM) ויוו עקב שלהם תכונות מכניות רקמה דמוית ומבנה נפוחות-מים המאפשרת מעבר מהיר של חומרים מזינים, איתות גורמים7,8. יתר על כן, 3D hydrogels ניתן לעצב יש שליטה עצמאית על מאפייני מכני וביוכימי לגרדום. מטריקס מכניקה9,10,11,12 והן תא-דבק ליגנדים13,14,15 ידועים להשפיע על התא התנהגות במבחנה , ויוו. לפיכך, hydrogels 3D עם מאפיינים tunable מציעים פלטפורמה כדי לחקור את היחסים סיבתי בין תאים microenvironment שלהם. קריטריונים עבור מטריצה הידרוג 3D אידיאלי כוללים תא פשוט, שאינו-ציטוטוקסיות-כימוס, כמו גם tunability עצמאית של תכונות מכניות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, מחקה של מוטיבים תא-דבק מקורית.
שניהם סינתטיים (למשל., פוליאתילן גליקול, חומצה polylactic, פוליפוני (חומצה גליקולית)), נגזר באופן טבעי (למשל., alginate, קולגן, Matrigel) hydrogels יש יתרונות על פני 2D in vitro לקשרי תרבות פלטפורמות; עם זאת, יש להם גם חסרונות משמעותיים אשר להגביל את התחולה שלהם. הראשון, פלטפורמות רבות סינטתיים, נגזר באופן טבעי לדרוש תנאים קשים crosslinking יכול להיות רעיל לתאים בתרבית של, מה שהוביל ירדה תא הכדאיות7. בנוסף, פלטפורמות סינתטיים רבים חוסר אתריים מקורית ויש צורך להיות functionalized דרך משני תגובות כימיות, אשר יכול להוסיף את העלות והמורכבות מוגברת16. לבסוף, בעוד חומרים באופן טבעי-derived מכילים בדרך כלל מהותי בתחומים ביו-אקטיביות, הם לעיתים קרובות מוטרדים על ידי השתנות אצווה-כדי-אצווה גבוהה, לעיתים קרובות מוגבלות ויוצרים ג'לים חלשה יחסית7,17.
חלבון רקומביננטי הנדסה מציג ערכת כלים ייחודיים לעיצוב חומרים על-ידי מתן שליטה מפורשת על חלבון רצף, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני הידרוג הסופי לגרדום18. בנוסף, באמצעות מינוף המנגנון הביולוגי הידוע של Escherichia coli (e. coli) לבטא חלבונים, חומרים יכול להיות מיוצר באופן חסכוני ועקבי עם השתנות מוגבל אינטר - ו אינטרה-אצווה. החלבון כמו אלסטין (ELP) המוצג כאן יש שלושה תחומים מהונדסים: (1) T7 ו His6 תג מאפשר תיוג ויה fluorescently מתויג נוגדנים, (2) אזור 'אלסטין דמוי' מקנה תכונות מכניות אלסטית ומאפשרת עבור חומר כימי crosslinking, ו- (3) אזור 'ביו-אקטיבי' מקודד עבור התא-דבק מוטיבים.
באזורנו אלסטין דמוי מבוסס על רצף הקנוני של אלסטין5 (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) שבו ארבעה מתוך 'Xaa' חומצת אמינו באתרים איזולאוצין (Ile), אבל יכול להיות מתוכנן להיות כל חומצה אמינית פרט פרולין. רצף זה מעניק ELPs רקומביננטי עם התחתון התנהגות טמפרטורה (LCST) פתרון קריטי שעלולים להיות מנוצלים לרעה לביטוי שלאחר טיהור פשוטה באמצעות תרמית רכיבה על אופניים19,20. בית מלון LCST זה ניתן לכוונן אותו תרמית צבירה בטמפרטורות שונות על-ידי שינוי של חוות 'Xaa' שאריות21,22.
כאן, עמדה 'Xaa' על אחד חוזר כמו אלסטין חמש הוחלף את הצגת amine ליזין (Lys) חומצת אמינו, אשר מנוצל עבור הידרוג crosslinking. העבודות הקודמות שלנו הראו crosslinking הלא-ציטוטוקסיות וחזק באמצעות תגובה עם כלוריד (THPC)23phosphonium tetrakis (hydroxymethyl) crosslinker אמין-ריאקטיבי. מאת בדרגות שונות הכוללת חלבון התוכן crosslinker ריכוז, אנו מסוגלים לייצר hydrogels זה ניתן לכוונן אותו span של נוקשות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית טווח (~0.5-50 kPa)9,23,24. בנוסף כוונון תכונות מכניות, התא אדהזיה בתוצאות הידרוג מן השילוב של תחומים תא-דבק קאנונית בתוך עמוד השדרה של החלבון אמרסון, לייק ופאלמר. לדוגמה, שילוב של מורחבים נגזר fibronectin 'RGDS' חומצת אמינו הרצף מאפשר תא הידבקות וגמישות הסתגלותי, ואילו מקושקשות, מחייב 'RDGS' משתנה מגבילה את תא-מטריקס אדהזיה24. מאת להתכוונן על היחס של התא-דבק חלבונים ללא דבק, כמו גם ריכוז החלבון הכולל, אנו מסוגלים לייצר ביעילות hydrogels שיימתחו מגוון רחב של ליגנד ריכוז. . Resultantly, פיתחנו פלטפורמה הידרוג עם decoupled נכסים הביוכימי, biophysical, אשר ניתן לכוונן באופן עצמאי לתרבות 3D אופטימלית של סוגי תאים שונים.
בנוסף נוקשות מטריקס וליגנד דבק tunability, hydrogels רקומביננטי מציעים את היכולת פרופילים ספציפיים השפלה גשמי עיצוב, אשר הכרחי תא התפשטות, התפשטות של הגירה בתוך ההקשר 3D4 , 9. את ההשפלה הזו המוענקת על ידי הפרשת תא פרוטאזות שמתמקדים 'RGDS' מורחבת9 או רצף אלסטין דמוי25. אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels יש גם הוכח כדי לתמוך את מבחני הביוכימי עוקבות הדרושים ללימוד תא הכדאיות ותפקוד כולל immunocytochemistry, כמו גם מיצוי DNA/RNA/חלבון עבור הפוכה כמותיים תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) והמערבית כתם9. אמרסון, לייק ופאלמר משתנים גם השתמשו במספר דגמים ויוו , ידועים להיות נסבל היטב על ידי המערכת החיסונית26.
יחדיו, אמרסון, לייק ופאלמר כמו פלטפורמה גשמי ללימודי תא-כימוס מציע מגוון רחב של יתרונות בהשוואה פלטפורמות חומרים סינתטיים או נגזר באופן טבעי, אשר לעתים קרובות חוסר באותה מידה של tunability הביוכימי, הביו-פיסיקלי ו הפארמצבטית. בנוסף, פשוטה-ציטוטוקסיות לשימוש של אמרסון, לייק ופאלמר עם מגוון רחב של סוגי תאים (למשל., צ'יק העזוב שורש הגרעינים14,24, מאתר קדמון עצבית תאים9,27, שור תאי גזע אנושי mesenchymal neonatal chondrocytes28, האדם אנדותל תאים29,30) מאפשר מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית של ECM 3D אנדוגני בהשוואה תרבית תאים 2D. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly, ELPs לשימוש כפלטפורמה הידרוג tunable 3D תא אנקפסולציה. בהמשך נציג את המתודולוגיה תיוג פלורסנט למטה-stream, מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים שעברו אנקפסולציה.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Elastin-Like Protein Expression and Purification&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri Dishes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>RICCA Chemical</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3920-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-18-0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt, dihydrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1755-10G</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.5007</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>MP Biomedicals</td><td>195381</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter Unit (0.22 &amp;mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Millipore</td><td>71754-4</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m syringe filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm thick silicone sheet</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>70338-05</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture plates&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Biopsy Punch (2 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Biopsy Punch (4 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Biopsy Punch (5 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline (DPBS)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>No. 1 12 mm glass coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Tryspin/EDTA</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15701</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Lampire Biological Labs</td><td>7332100</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11071</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Nestin Primary Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>556309</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Sox2 Primary Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>23064S</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Hardset Mounting Medium&amp;nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d

טכניקות מימדי תרביות רקמה (2D) היה חיוני להבנת ביולוגיה של התא הבסיסי. עם זאת, היעדר מערכות התרבות המסורתית של רקמות 2D מטריצה תלת מימדי (3D), וכתוצאה מכך משמעותי נתק בין תוצאות נאסף במבחנה ו vivo בתוך. כדי לטפל מגבלה זו, החוקרים היה לתכנן פלטפורמות תרביות רקמה הידרוג תלת-ממד שיכולים לחקות את המאפיינים הביוכימי ו ביופיזיקלי של microenvironment תא ויוו . מחקר זה הניעה את הצורך לפתח פלטפורמות גשמי התומכים תא 3D כימוס של מבחני הביוכימי במורד הזרם. חלבון רקומביננטי הנדסה מציעה ערכת כלים ייחודיים הידרוג תלת-ממד גשמי עיצוב ופיתוח על-ידי מתן שליטה מסוימת של חלבון רצף ולכן, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני תוצאות מטריקס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly אלסטין, כמו חלבון (ELP), אשר יכול לשמש כדי hydrogels טופס עם תכונות מכניות באופן עצמאי tunable וריכוז ליגנד תא-דבק. בהמשך אנו מציגים מתודולוגיה תא אנקפסולציה בתוך אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels ומוטבעים מכתים immunofluorescent עוקבות של תאים עבור ניתוח במורד הזרם כמת.

ELPs בשימוש פרוטוקול זה המורכב מעובדים חמישה אזורים: תג T7 His6 תג, אתר פצילות enterokinase (EK), אזור ביו-אקטיביות, אזור כמו אלסטין (איור 1). T7 ותגי His6 מאפשרים זיהוי קל באמצעות טכניקות תספיג סטנדרטי. מבוא של אתר המחשוף EK מאפשר הסרת אנזימטי של האזור תג, במידת הצורך. האזור ב...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D at JoVE.com

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K Views.  Stanford University. Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.

Video: Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Biochemistry

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is prepared by mixing solutions of glycol chitosan with a synthesized benzaldehyde terminated polymer gelator, and hydrogels are efficiently obtained in several minutes at room temperature. By varying ratios between glycol chitosan, polymer gelator, and water contents, versatile hydrogels with different gelation times and stiffness are obtained. When damaged, the hydrogel can recover its appearances and modulus, due to the reversibility of the dynamic imine bonds as crosslinkages. This self-healable property enables the hydrogel to be injectable since it can be self-healed from squeezed pieces to an integral bulk hydrogel after the injection process. The hydrogel is also multi-responsive to many bio-active stimuli due to different equilibration statuses of the dynamic imine bonds. This hydrogel was confirmed as bio-compatible, and L929 mouse fibroblast cells were embedded following standard procedures and the cell proliferation was easily assessed by a 3D cell cultivation process. The hydrogel can offer an adjustable platform for different research where a physiological mimic of a 3D environment for cells is profited. Along with its multi-responsive, self-healable, and injectable properties, the hydrogels can potentially be applied as multiple carriers for drugs and cells in future bio-medical applications.

Here we describe a facile preparation of chitosan-based injectable hydrogels using dynamic imine chemistry. Methods to adjust the hydrogel&#8217;s mechanical strength and its application in 3D cell culture are presented.

הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

Chemistry

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Biology

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several approaches have been developed for the preparation and use of supporting gel beds in 3D bioprinting. This paper describes a process to manufacture microgel suspensions using agarose (known as fluid gels), wherein particle formation is governed by the application of shear during gelation. Such processing produces carefully defined microstructures, with subsequent material properties that impart distinct advantages as embedding print media, both chemically and mechanically. These include behaving as viscoelastic solid-like materials at zero shear, limiting long-range diffusion, and demonstrating the characteristic shear-thinning behavior of flocculated systems. 
On the removal of shear stress, however, fluid gels have the capacity to rapidly recover their elastic properties. This lack of hysteresis is directly linked to the defined microstructures previously alluded to; because of the processing, reactive, non-gelled polymer chains at the particle interface facilitate interparticle interactions-similar to a Velcro effect. This rapid recovery of elastic properties enables bioprinting high-resolution parts from low-viscosity biomaterials, as rapid reformation of the support bed traps the bioink in situ, maintaining its shape. Furthermore, an advantage of agarose fluid gels is the asymmetric gelling/melting transitions (gelation temperature of ~30 &#176;C and melting temperature of ~90 &#176;C). This thermal hysteresis of agarose makes it possible to print and culture the bioprinted part in situ without the supporting fluid gel melting. This protocol shows how to manufacture agarose fluid gels and demonstrates their use to support the production of a range of complex hydrogel parts within suspended-layer additive manufacture (SLAM).

Shear processing during hydrogel formation results in the production of microgel suspensions that shear-thin but rapidly restructure following the removal of shear forces. Such materials have been used as a supporting matrix for bioprinting complex, cell-laden structures. Here, methods used to manufacture the supporting bed and compatible bioinks are described.

ג'ל נוזלי אגרוז שנוצר על ידי עיבוד גזירה במהלך הג'לציה להדפסה ביולוגית תלת ממדית מושהית

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...

הידרוג'לים מודפסים ביולוגית הניתנים לצילום כדי לחקור תגובות תאיות להתקשות ECM

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture platforms and dynamically triggering changes, such as increasing microenvironmental stiffness, enables researchers to model changes in the extracellular matrix (ECM) that occur during fibrotic disease progression. Herein, a method is presented for 3D bioprinting a phototunable hydrogel biomaterial capable of two sequential polymerization reactions within a gelatin support bath. The technique of Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting was adapted by adjusting the pH of the support bath to facilitate a Michael addition reaction. First, the bioink containing poly(ethylene glycol)-alpha methacrylate (PEG&#945;MA) was reacted off-stoichiometry with a cell-degradable crosslinker to form soft hydrogels. These soft hydrogels were later exposed to photoinitator and light to induce the homopolymerization of unreacted groups and stiffen the hydrogel. This protocol covers hydrogel synthesis, 3D bioprinting, photostiffening, and endpoint characterizations to assess fibroblast activation within 3D structures. The method presented here enables researchers to 3D bioprint a variety of materials that undergo pH-catalyzed polymerization reactions and could be implemented to engineer various models of tissue homeostasis, disease, and repair.

מחבר זרקור: הבנת מחלות ריאה כרוניות באמצעות הידרוג'לים פוטו-ממדיים מודפסים בתלת-ממד 

This article describes how to 3D bioprint phototunable hydrogels to study extracellular matrix stiffening and fibroblast activation.

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית הידרוג'לים פוטו-ממדיים לחקר הפעלת פיברובלסטים

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...