עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מתקן Core Microarray סקריפס, וחוזה מן המרכז לבקרת מחלות (JCP). RPdV היא כלת מענק הרוביקון ו Veni מההסתדרות הולנד למחקר מדעי (NWO). המאגד עבור glycomics פונקציונלית (http://www.functionalglycomics.org/) במימון NIGMS מענק GM62116 (JCP) סיפק כמה גליקנים השתמשו במחקר זה. זהו פרסום 29,113 ממכון המחקר סקריפס.

הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. בניית Array 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת glycan והגדרת פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מלאי של חיץ הדפסה. תחילה הפוך 500 מ&quot;ל של פתרון המניות 150 מ&quot;מ של פוספט נתרן dibasic. גם לעשות 50 מ&quot;ל של פתרון המניות 150 מ&quot;מ של פתרון פוספט נתרן monobasic. בבקבוק, באמצעות בר ומערבבים מגנטי מטר pH, לאט לכיל הפתרון פוספט נתרן dibasic עם הפתרון monobasic עד pH של 8.5 הוא הגיע. הוספת Tween-20 0.005%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את דגימות glycan. לדלל PAA גליקנים מצומדות, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) ו 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (איור 1A הם להיות מדולל)) כדי 100μg / ml דפוס חיץ מן step1.1.1. גליקנים חד ערכי,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) ו 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) כדי 100μM במאגר הדפסה משלב 1.1.1. לבסוף, להכין את הצבעים פונקציונליים האמינים, להשתמש כסמני רשת / אורות נחיתה. כתמים סמן דיי מודפסים ב 1 מיקרומטר. הערה: צבע Atto488-NHS משמש הדפסים שלנו. עם זאת, כל צבען פונקציונלי אמין, קריא על ידי סורק השקופיות מתאים למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 10 μl של כל דגימה glycan צלחות microtiter 384 גם משמש לטיפול רובוט הדפסה. חנות גליקנים בשימוש בתמיסת חיץ הדפסה ב -20 מעלות צלזיוס צינורות אטומים. Tansfer 10 μl של סמן צבע לצלחת הדפסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הַדפָּסָה הערה: כל STEps כי חששו לגעת או להזיז את המגלשות חייבים להיעשות עם כפפות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח סיכות arrayer בראש ההדפסה על פי התצורה הנכונה של הפריסה. עבור פריסה זו להשתמש סיכה אחת כדי להדפיס את כל הדגימות ומערכים. הדפס את גליקנים בבלוקים של שש, מדלגי תכונה אחת (תכונה מוגדרת נקודה אחת של תרכובת מסוימת), בכל צד, כך כתם של המדגם הזהה אינם מודפסים בדיוק זה לצד זה. הערה: משתמש הקצה חייב להחליט את התצורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר שקופית משקיות, קופסות פתוחות, ולהסיר כל חלקיקי אבק או חתיכות קטנות של פלסטיק שעשויה להיות על פני השטח שלהם על ידי פיצוץ גז חנקן טוהר גבוה במיוחד על כל שקופית. מניחים את המספר הרצוי של שקופיות, צד מצופה למעלה, על הבמה arrayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנת את arrayer, השתמש בפרמטרים של 27 נקודות בכל ביקור לצלחת מקור, באמצעות 3 &quot;טרום כתמים&quot; על גבי שקופיות מצופה פולי- L- ליזין, כדי להסיר עודפי נוזלים על קצה סיכות הדפסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל MPU (יחידת כוח ראשית) יחידת בקרת האקלים. התוכנה להרחיב ניתוח ריצוף במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריסה בחר את האותיות. בחרו כלי פין אפשרויות → לשמש להדפסת כלי הדפסת המערך 1 x 1 - 1 סיכה אחת. בחר בכרטיסייה יעד → Definition מערך כלי → תבנית הדפסה ולהוסיף המגרש (spot-אל-המקום מרחק), מספר שורות ועמודות כדי להכיל דגימות שיודפס, ואת תבנית ההדפסה של דגימות (עבור מערך זה 8 8 x דפוס הדפסה משמש ב 340 מיקרומטר מגרש עבור 7 מכלל דגימות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פריסת שקופיות יעד → ולתכנת את מרחק בלוק ל-בלוק כדי לאפשר הדפסה של כל מערך לשכפל לתוך תבנית שקופית 48-היטב (4 x 12). בחר מקור ולהוסיף מספר טנדרי מקור (1 עבור כל דגימה בעת שימוש 1 פינים) (עבור טנדרי מקור הדפסת 7 זה ישמש כדי להכיל 6 בארות מדגם סמן צבע 1 היטב). הערה: מקור הדיאלוג צריך להפוך לירוק כדי להראות כי המספרביקורי מקור תואמות את הדגימות שתודפסנה בדפוס ההדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פלייט מתאם → יעד וחלק פריסה ולהתאים את מספר השקופיות (5 מגלשות מודפסות בכל פעם עבור בהדפסה עם שקף 1 תצפית מראש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את המגש על ידי לחיצה על כפתור T1 כדי להפעיל את המגש ולהוסיף את המספר הרצוי של שקופיות למגש, הקדשת תשומת לב למקומות של השקופית מראש התצפית (הכחולה) &quot;אמיתיות&quot; שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח שקופיות זכוכית רגילות על כל יציאות הוואקום הנותרים לחסום את החלל ולחץ על אישור כדי להפעיל את הוואקום. בדוק שכל השקופיות מוחזקות במקום ולחץ על אישור כדי להחזיר את המגש למיקום הביתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת ההדפסה לתוך מחזיק הצלחת ולהבטיח המדף הוגדר כראוי במקום. לחץ GO ולאפשר את תהליך ההדפסה כדי להמשיך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפס את 24 הנקודות שנותרו משכפל של 6 נקודות לכל מערך (4 מערכים / מקור הביקור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את 384 גם הצלחותלתוך המדפסת להתחיל בהדפסה. לשמור על לחות יחסית, במהלך ההדפסה, ברחבי ההדפסה בין 55 ו -65%. המדפסת מפסיקה לאחר הדפסת 5 שקופיות. הערה: בעוד microarray assay זה מודפס בדפוס 8 x 8 ספציפי, רובוטי הדפסת microarray שונים ידרשו תכנות ציוד ספציפי כדי להשיג את הפריסה הרצויה. זה תלוי למשתמש הקצה כדי לקבוע את הדפוס המתאים ביותר בהתחשב מפרט הציוד שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחות / משתקות הערה: לאחר שקופיות סיום הדפסה, הם עוברים שלב קיבוע זמני, גם humidifying שנקרא. Humidifying-הדפסה פוסט עוזר homogenize את הקובץ המצורף מדגם ידי מחדש להרטיב את הנקודות ולהבטיח חסימה מלאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שקופיות בתא לחות 100% מיד לאחר ההדפסה לתקופה של 30 דק &#39;. לבנות את החדר על ידי צבת מגבות נייר רטובות מאוד שטוחות בחלקו התחתון של צלחת זכוכית גדולה, צבת השקופיותעל איזה מדף, כגון למעלה בצד מתלה מבחנה, הדפסה, ואיטום בניילון נצמד כדי ללכוד את הלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר המחליק עם אלכוהול / עט חנות עמידות ממסים סימון בקופסא התייבשות. לייבש לילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספור, חסימה, ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ חסימה - 50 מ&quot;מ ethanolamine ב 50 מ&quot;מ חיץ borate. ראשית, לפזר חומצה בורה, DDH 2 O, לריכוז סופי של 50 מ&quot;מימ בבקבוק המכיל בר ומערבבים מגנטי. מערבב את הפתרון נמרצות על צלחת ערבוב עד שכל המוצק נמס. תוך ערבוב מתמיד, להוסיף את הכמות המתאימה של ethanolamine מפתרון 16.54 M המניה להגיע 50 ריכוז מ&quot;מ הרצוי. הוספת סודיום הידרוקסיד מרוכז להסתגל pH הסופי של 9.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות מודפסות הפתרון למאגר החסימה עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 1 hr, לשטוף את שקופיות DDH 2 O כדי להסיר כל עקבות עודפות של חיץ חסימה.השלך חיץ חסימה מיכל פסולת מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות לבעלי מכתים זכוכית ספין יבש. מערכים יבשים על ידי הצבה בצנטריפוגה מצוידת מחזיקי צלחת מתנדנד, במהירות של 10 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקופיות הן יבשות, הם יכולים להיות מודגרות מייד או שומרים אותו. תנאי אחסון הם -20 ° C בתוך שקית פלסטיק אטומה. </li></ol></li></ol> 2. ניתוח חלבונים מחייב glycan <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תא humidified שבו מערכים להיות הכלאה יתאים. חדר פשוט מורכב תבנית פיירקס, שכבתי בתחתית עם מגבות נייר לחות ו מתל, שעליו השקופיות תנחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לקטינים biotinylated SNA (agglutinin סמבוקה nigra) ו ECA (Erythrina cristagalli agglutinin) ב 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל + 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל של צבע streptavidin-555, ב חיטוט חיץ (PBS + 0.01% Tween-20). עבור HA (A / וייטנאם / 1203/04 H5N1 ו- A / KY / 07 H1N1, בדוגמה זו), שימושריכוז התחלתי של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל מראש ומורכבת, כפי שתואר לעיל 34. בקצרה, לעשות HA: עכבר-α-סטרפטוקוקוס: תערובת עיזים-α-עכבר-Alexa647 בחסימת המאגר (PBS + 3% BSA + 0.01% Tween-20), בכל 4: יחס טוחנת 1: 2. הערה: המערך ומישש עם לקטינים כדי לוודא גליקנים הם משותקים ו לגילוי (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון לערבב חלבון-נוגדן מחייב glycan של 20 μl לצלחת 384 גם לדגור על קרח למשך 30 דקות. סדרתי לדלל לקטינים ו HA דגימות 1: 1, במאגר שלהם מתאימה, 8 פעמים, על ידי ערבוב 10 μl של המדגם עם 10 μl של חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 8 μl של המדגם על פני השטח מיקרו-היטב דגירה של humidification אטום (100% לחות יחסית) תא במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות אחד בכל פעם על ידי לחיצה על בקצוות טבילתם ארבע פעמים בתערובת של PBS ו 0.05% Tween, אז ארבע פעמים PBS, ולבסוף ארבע פעמים deionized H 2 O. שימושבאותו פרוטוקול הייבוש שמתואר בשלב החסימה, לסובב את המערכים לייבש בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10 x ז. </li></ol> 3. ניתוח סריקת נתונים הערה: microarrays glycan ניתן לסרוק על הגדרות שונות, בהתאם ליצרן של סורק microarray. על ידי שינוי כוח לייזר רזולוציה, המכשיר יכול לייצר תמונה עם אותות רבים ככל האפשר בתוך הטווח הדינמי שלה (תרשים 1C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסורק שקופיות פלורסנט ולסרוק את המערכים מייד לאחר דגירה עם החלבונים המחייבים glycan. תשמור על מנת להבטיח את השקופית מוכנסת כהלכה לתוך מכשיר הסריקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת סריקה להרחיב. לחץ על התחל כדי לפתוח את התוכנית. להתחבר סורק: Connect → סורק או כפתור ירוק &#39;מתפריט החלונית ניווט סורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלת autoloader להרחיב של הסורק. מניח שקופיות חריצי autoloader בסדר מסוימים. דלת autoloader סגורה. Clאיכס &quot;לקרוא מטעין&quot; בחלונית ניווט כלים לזהות אוטומטית שקופיות הסורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר פרמטר סריקה: פרמטרי סריקת → הסורק מתאימים הניסוי (למשל 635 כוח הליזר גבוה, רווח זיהוי 50%). שקופיות סריקה: סורק → סריקה. בחר נתיב-ידי יצירת תיקייה לשמור את תמונות סריקה וסריקות בודדות שם. האם לפני זה כדי הסריקה בפועל. חזור על הפעולה עבור כל שקופית הפרט. לחץ על אישור כדי להתחיל בסריקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת הסורק כדי להגדיר את המכשיר לסרוק את השקופיות. סורק הגדר כדי לסרוק באופן איטרטיבי בהספק לייזר נמוך (5 mW) עם חיזוק הגדרות רווח של 25%, 50% ו -75%. הערה: ההגדרות תוכלנה להיבדק ולקבל טיפול מותאם, אך יש לזכור כי כל סריקה יכולה להפחית את תפוקת הקרינה של הצבעים בשל photobleaching. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תוכנת ניתוח נתוני פתיחה כגון תוכנות Mapix. לחץ על התחל כדי לפתוח את התוכנית. התמונה הסרוקה להרחיב: קובץ → im פתוחגיל. קובץ GAL להרחיב: נתח → רשת פתוחה ובחר בקובץ GAL המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן בלוקים מצב: תמונה → בלוקים מצב להזיז את הרשת. השתמש בסמנים ברשת כדי להגדיר את הרשת אל המיקום המתאים בשקופית. התאם בלוקים בודדים לפי צורך להתאים את המערך המודפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן כתמי מצב: תמונת → מצב כתם להתאים מיקום וגודל של מקומות מסוימים בתוך הבלוק. לאחר כל אבני כתמים מותאמים ובמקום, עוצמות אות מידה ידי לנתח חישובים photometric →. שמור את קובץ הפלט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקופיות סיימו סריקה, תמונות מנותחות לכריכת אותות עם תכנית עיבוד תמונה המותקנת (האיור 1D - G). לניתוח תמונה, לטעון קובץ GAL (רשימת Array) מעל התמונה TIFF סרק. הערה: קובץ GAL מכיל הוא את דפוס פריסת ספוט זהותם של כל מיקום נקודה. קבצי GAL עבור מערכים הם created ידי תוכנת המדפסת באמצעות קובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים המכיל את זהותם של דגימות ומיקומם בצלחת מקור 384 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אורות רשת סמן / נחיתה מודפסים על microarrays למקם את רשת GAL כראוי. מקומות מסוימים ייתכן שיהיה צורך להתרגש בנפרד, אלא מערך מודפס היטב יאפשר בדרך כלל בלוקים בתוך הרשת להציב בקלות. בעקבות מיקום הרשת, לאסוף עוצמות במקום על ידי התוכנה והציל כקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים (.txt). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים, לפתוח את קובץ הפלט מהסורק. פתח את קובץ מאקרו המתאים ממיקום התיקייה. לחץ על הצג → מאקרו → RunMacro. הערה: כתובה מראש יעתיק את נתוני תפוקת גלם, להסיר שורות ועמודות מיותרות, למיין הנתונים לפי מדגם, לחשב את ערכי רקע מינוס אות תוחלת הממוצעים ואת העלילה ערכי הנובע ממנו אל גיליון עבודת התפשטות גיליון המכיל את הגרפים עבור כל מששת samples נבדק על המערך. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Tumpey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-amino+acid+change+in+the+hemagglutinin+of+the+1918+influenza+virus+abolishes+transmission.">A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission.</a> Science. 315 (5812), 655-659 (2007).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+balance+of+the+hemagglutinin+and+neuraminidase+activities+accompanies+the+emergence+of+the+2009+H1N1+influenza+pandemic.">Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic.</a> J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).</li><li>Bouvier, N. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+influenza+viruses.">The biology of influenza viruses.</a> Vaccine. 26, D49-D53 (2008).</li><li>Freidl, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+at+the+animal-human+interface:+a+review+of+the+literature+for+virological+evidence+of+human+infection+with+swine+or+avian+influenza+viruses+other+than+A(H5N1).">Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1).</a> Euro Surveill. 19 (18), (2014).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+recognition+of+avian-like+receptors+in+human+influenza+A+H7N9+viruses.">Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses.</a> Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).</li><li>Paulson, J. C., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H5N1+receptor+specificity+as+a+factor+in+pandemic+risk.">H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk.</a> Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).</li><li>Tzarum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+receptor+binding+of+the+hemagglutinin+from+a+human+H6N1+influenza+virus.">Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human-Infecting+H10N8+Influenza+Virus+Retains+a+Strong+Preference+for+Avian-type+Receptors.">A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).</li><li>Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+cell-surface+receptor+determinants+of+antigenically+similar+influenza+virus+hemagglutinins.">Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins.</a> J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).</li><li>Gambaryan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+receptor-binding+phenotypes+of+influenza+virus+isolates+from+different+hosts+using+synthetic+sialylglycopolymers:+non-egg-adapted+human+H1+and+H3+influenza+A+and+influenza+B+viruses+share+a+common+high+binding+affinity+for+6'-sialyl(N-acetyllactosamine).">Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine).</a> Virology. 232 (2), 345-350 (1997).</li><li>Rogers, G. N., D'Souza, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+properties+of+human+and+animal+H1+influenza+virus+isolates.">Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates.</a> Virology. 173 (1), 317-322 (1989).</li><li>Rogers, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+substitutions+in+influenza+haemagglutinin+change+receptor+binding+specificity.">Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity.</a> Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).</li><li>Paulson, J. C., Rogers, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resialylated+erythrocytes+for+assessment+of+the+specificity+of+sialyloligosaccharide+binding+proteins.">Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins.</a> Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).</li><li>Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+specific+myxovirus+receptors+to+asialoerythrocytes+by+incorporation+of+sialic+acid+with+pure+sialyltransferases.">Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases.</a> J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).</li><li>Chutinimitkul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+attachment+pattern+and+replication+efficiency+of+H5N1+influenza+A+viruses+with+altered+receptor+specificity.">In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity.</a> J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).</li><li>Glaser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+1918+influenza+virus+hemagglutinin+changes+receptor+binding+specificity.">A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity.</a> J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).</li><li>Herfst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+transmission+of+influenza+A/H5N1+virus+between+ferrets.">Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets.</a> Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).</li><li>Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Change+in+receptor-binding+specificity+of+recent+human+influenza+A+viruses+(H3N2):+a+single+amino+acid+change+in+hemagglutinin+altered+its+recognition+of+sialyloligosaccharides.">Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides.</a> Virology. 278 (2), 587-596 (2000).</li><li>Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solid-phase+enzyme-linked+assay+for+influenza+virus+receptor-binding+activity.">A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity.</a> J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).</li><li>Totani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+and+application+of+glycopolymers+containing+multivalent+sialyloligosaccharides+with+a+poly(L-glutamic+acid)+backbone+for+inhibition+of+infection+by+influenza+viruses.">Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses.</a> Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).</li><li>Gambaryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+specificity+of+influenza+viruses+from+birds+and+mammals:+new+data+on+involvement+of+the+inner+fragments+of+the+carbohydrate+chain.">Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain.</a> Virology. 334 (2), 276-283 (2005).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+specificity+of+influenza+A+viruses+correlates+with+the+agglutination+of+erythrocytes+from+different+animal+species.">Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species.</a> Virology. 227 (2), 493-499 (1997).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+human-type+receptor+binding+specificity+by+new+H5N1+influenza+virus+sublineages+during+their+emergence+in+birds+in+Egypt.">Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt.</a> PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+topology+determines+human+adaptation+of+avian+H5N1+virus+hemagglutinin.">Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin.</a> Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).</li><li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins.">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li><li>Childs, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-binding+specificity+of+pandemic+influenza+A+(H1N1)+2009+virus+determined+by+carbohydrate+microarray.">Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).</li><li>Nycholat, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Sialylated+Poly-N-acetyllactosamine+Chains+on+N-+and+O-Linked+Glycans+by+Human+and+Avian+Influenza+A+Virus+Hemagglutinins.">Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).</li><li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome.">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sialylated+glycan+microarray+reveals+novel+interactions+of+modified+sialic+acids+with+proteins+and+viruses.">A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).</li><li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+H3N2+Influenza+Viruses+Isolated+from+1968+To+2012+Show+Varying+Preference+for+Receptor+Substructures+with+No+Apparent+Consequences+for+Disease+or+Spread.">Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarray+technologies:+tools+to+survey+host+specificity+of+influenza+viruses.">Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).</li><li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+hemagglutinin+protein+of+the+new+pandemic+H1N1+influenza+virus:+maintaining+optimal+receptor+binding+by+compensatory+substitutions.">Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions.</a> J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+receptor+binding+preferences+of+recombinant+human+A(H3N2)+virus+hemagglutinins.">Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins.</a> Virology. 477, 18-31 (2015).</li><li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influenza+A+virus+hemagglutinin+glycosylation+state+affects+receptor-binding+specificity.">The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity.</a> Virology. 403 (1), 17-25 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

הערכה סגולית הקולטן IAV היא צעד חשוב בניתוח פוטנציאל מגיפת וירוסי עופות. הכרת חומצת sialic ידי הנגיף קשור לכמה מאפיינים ביולוגיים כגון קשירה ושחרור מהתא. ידיעה אשר מוטציות-חומצת אמינו נחוצות וירוסי עופות להשיג α2-6 מחייבים ולחצות את מחסום המינים מאפשר מוכן לקראת מגפה. מבח...

עופות מים ברים הם המאגר הטבעי של IAV, אבל IAV הוא מסוגל לחצות את מחסום המינים כדי עופות ויונקים, כולל בני אדם. IAVS עופות להכיר חומצות sialic α2-3 צמוד (קולטנים מסוג העופות), ואילו וירוסי אדם להיקשר α2-6 חומצות sialic צמודות (קולטנים מסוג האדם). כדי להיות מסוגל לשכפל ביעילות ולהעביר בין בני האדם IAV עופות צריך להיקשר לקולטנים מסוג האדם 1. IAVS מחולקים לפי סרולוגיה המאפיינת את antigenicity של hemagglutinin שלהם (HA) נורמינידאז גליקופרוטאינים המעטפה (NA). HA נקשר חומצות sialic, ואילו NA הוא האנזים להרוס קולטן בקצה השני של מחזור החיים של נגיפי ודבק sialic חומצה 2. כל הווירוסים מדביקים האדם, כולל H1N1, H2N2 ו H3N2, יש מוצא עופות 3. בשנים של העשורים האחרונים עופות כדי crossovers אדם התרחש, עם H5N1, H7N7, H7N9 ו להיות הכי ידוע; HoweVer, תת אחרים נגועים בני האדם יותר באופן ספוראדי (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. למרבה המזל, נראה כי אף אחד הווירוסים הללו הצליחו להסתגל באופן מלא לקולטנים חומצת sialic אדם מהסוג צמוד α2-6 5-8. הסתגלות של וירוסים zoonotic העופות או אחרים כדי להתאים שכפול והעברת ב המארחים אדם יכול להיות בעל השפעה הרסנית על בריאות האדם. לכן, ידע מוקדם של כמה וירוסים אלה מתפתחים להיקשר לקולטנים אדם מהסוג יעזרו מעקב חובק-עולם של נגיפי שפעת מתעוררים. קביעת העדפת קולטן הובררה ראשונה באמצעות אריתרוציטים של מינים שונים ונשארת assay מועדף בקרב כל חוקרי שפעת 9-12. ההפגנה כי וירוסים העופות להכיר חומצה sialic α2-3 ווירוסים האדם α2-6 מקושר חומצה sialic התבססה במקור על assay באמצעות hemagglutination של אריתרוציטים מהונדסים enzymatically להכיל כל אחד linkages 13,14. למרות ההודעה היא hemagglutination, assay תקן וירולוגים, מבני glycan הבסיסיים אינם מוגדרים, הצמדת המסוף בלבד. בנוסף, הזמינות המוגבלת של sialyltransferases, המשמש מחדש sialylate התאים, מצמצמת את השימוש של assay זה 15-18. בהמשך לכך, שיטות אחרות של בקביעת העדפות מחייב קולטן הוכנסו באמצעות מבנים glycan sialylated צמוד פולי-acrylamide (PAA) או פולי-גלוטמט (PGA) מבנים מבוססי מבחני צלחת 19,20. כמה וריאציות אפשריות ציפוי גם את גליקנים או וירוסי צלחות microtiter, שכל אחת מהן התוצאה היא assay ELISA מהסוג איתנה, אמינות מאוד רגישה 21-23. לחלופין, גליקנים צמודים ביוטין יכולים להחליף PAA / PGA וניתן מצומדות כדי צלחות streptavidin מצופה 2,24. למרות שהחלק סר ספציפי עשויים להידרש, ELISAs הם גליקנים תקן וכמה צמוד PAA הם בקלות commercially ושאינם זמינים מסחרית (קונסורציום glycomics פונקציונלית (http://www.functionalglycomics.org)). טכנולוגיות microarray glycan צמחו כמו כלי רב ערך כדי לקבוע סגוליות הקולטן, כפי הם הבחינו גליקנים שונים מרובים, והיקשרות מגוון רחב של מבנים שונים ניתן להעריך בתוך assay יחיד 25-29. עקידת IAV במבנים אלו מספקת הבנה טובה יותר של מבנים glycan כי IAV מזהה מועדף 30-33. microarrays glycan דורש כמויות קטנות של נפח דגימה לבצע assay מחייב ורק משתמש בכמויות זעירות של glycan לכל נקודה (2 nl). עם זאת, מערכים אלו משמשים בדרך כלל רק להעריך סגוליים של קולטנים גליקנים. ניתוח של וירוסים מרובים, או חלבוני hemagglutinin, בטווחי ריכוז מרובים יכול להיות מונע בשל מספר השקופיות הנדרשות. יתר על כן, עד כה, לא assay להיטות ביחס פותח באמצעות ar glycanטכניקות ray. כדי לשלב את דרישת המדגם הנמוכה המוענקת על ידי טכניקות microarray glycan ואת הרגישות של גליקנים צמודים PAA מבחנים מבוססים ELISA, בקשנו לפתח מערך glycan רב גם שיאפשר ניתוח תפוקה גבוהה עם רזולוציה דומה או טובה יותר לעומת אל assay ELISA המבוסס המסורתי. במקביל, רצינו לצמצם את כמות ביולוגיות וכימיקלי כתב נצרכו. התוצאה הסופית היא assay להיטות מיניאטורי, שפותחה במיוחד עבור ניטור סגולי IAV והוא ישים באותה מידה להעריך חלבונים מחייבים glycan אחרים. באמצעות שקופיות זכוכית מתחלקות 48-בארות מייקרו ידי מסכת טפלון, 6 גליקנים שונים הם הבחינו ב 6 משכפל לכל טוב. פלטפורמת microarray מקנה המגמות אותו קולטן כריכה לראות בפורמט מאקרו ELISA עם מספר יתרונות. אלה כוללים (I) הדפסה של המתחם ב 6 משכפל, באמצעות מדגם מינימלי, לעומת ציפוי של כמה שורות אניצלחת נה, באמצעות 100 μl לכל היטב; (II) תרכובות שונות מרובות נתחו במקביל באר יחיד, לרבות בקרות; (III) ירידה מסיבית נפח דגירה; (IV) טווח דינמי גדול יותר באמצעות הודעת ניאון. שקופית יחידה ניתן לחשב להיות שווה ערך ל 18x 96-גם הצלחות. עם הפרוטוקול הבא, מסוגל במעבדה כל בפברוק וניתוח הבחין microarrays אמור להיות מסוגל לייצר פורמט ELISA מיניאטורי זה.

<table><tbody><tr><td>NEXTERION&amp;reg; Slide H MPX-48&amp;nbsp;</td><td>Schott</td><td>1091525</td><td>Microwell slides</td></tr><tr><td>ProScanArray Plus&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>discontinued</td><td>confocal microarray scanner</td></tr><tr><td>Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software</td><td>Innopsys</td><td>-</td><td>confocal microarray scanner</td></tr><tr><td>MicroGrid II&amp;nbsp;</td><td>Digilab</td><td>-</td><td>microaray printer</td></tr><tr><td>SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305&amp;nbsp;</td><td>Plant Lectin</td></tr><tr><td>ECA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1145&amp;nbsp;</td><td>Plant Lectin</td></tr><tr><td>Anti-Strep Antibody</td><td>IBA</td><td>2-1509-001&amp;nbsp;</td><td>Anitbody for HA binding</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa-647</td><td>Life</td><td>A-21235</td><td>Anitbody for HA binding</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287&amp;nbsp;</td><td>detergent</td></tr><tr><td>di-basic Sodium Phosphate</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td>printing buffer component</td></tr><tr><td>mono-basic Sodium phosphate</td><td>Sigma</td><td>229903&amp;nbsp;</td><td>printing buffer component</td></tr><tr><td>poly-l-lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P8920&amp;nbsp;</td><td>pre-spotting slide component</td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td>pre-spotting slide component</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Sigma</td><td>493546</td><td>pre-spotting slide component</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>incubation/washing buffer</td></tr><tr><td>SMP4B pins</td><td>Telechem</td><td>SMP4B</td><td>printing pin</td></tr><tr><td>Compressed Nitrogen (Grade5)</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>general dusting/drying tool</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>Slide blocking reagent</td></tr><tr><td>ethanolamine</td><td>Sigma</td><td>E9508-500ML</td><td>Slide blocking reagent</td></tr><tr><td>Atto 488</td><td>AttoTec</td><td>AD 488-91</td><td>Gridmarker on array</td></tr><tr><td>PAA-LNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>PA368</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>PAA-3SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>PA362</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>PAA-6SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>PA343</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>LNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>Te98</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>3SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>Te175</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>6SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>Te176</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>384-well microtiter plate</td><td>Matrix TechCorp</td><td>4361</td><td>Printing plate</td></tr><tr><td>VWR lab marker</td><td>VWR</td><td>52877-150</td><td>Slide Numbering</td></tr><tr><td>Wheaton slide staining dish</td><td>Sigma</td><td>Z103969-1EA</td><td>Blocking and Drying</td></tr></tbody></table>

a miniaturized glycan microarray assay for assessing avidity and specificity of influenza a virus hemagglutinins

שפעת וירוס (IAV) hemagglutinins להכיר חומצות sialic על פני התא קולטנים תפקודית כדי לזכות הכניסה לתאי. עופות מים ברים הם המאגר הטבעי של IAV, אבל IAV יכול לחצות את מחסום המינים כדי עופות, חזירים, סוסים ובני אדם. וירוסים העופות להכיר חומצה sialic מחוברת גלקטוז הלפני אחרון על ידי הצמדה α2-3 (קולטנים מסוג העופות) ואילו וירוסים האדם מעדיפים להכיר חומצה sialic עם הצמדה α2-6 (קולטנים מטיפוס אנושי). כדי לפקח אם וירוסים העופות מסתגלים קולטנים מסוג אדם, מספר שיטות שניתן להשתמש בהם. microarrays glycan עם ספריות מגוונות של sialosides הסינתטי משמש יותר ויותר להעריך סגוליות הקולטן. עם זאת, הטכניקה הזו לא נעשה שימוש למדידת avidities. מדידת הלהיטות בדרך כלל מושגת על ידי הערכת עקידת hemagglutinin בדילול סדרתי או וירוס גליקנים שנספחו 96-גם צלחות פוליפרופילן קונבנציונליות. ב assay זה, גליקנים עם α2-3 או α2-6 חומצות sialic הם מצמידים את ביוטין שנספחו צלחות streptavidin, או הם מצמידים את polyacrylamide (PAA) אשר לספוג ישירות פלסטיק. יש לנו מיניאטורי משמעותי assay זה על ידי הדפסה ישירות sialosides PAA צמודי עמיתיהם PAA הלא צמוד שלהם בשקופיות זכוכית מיקרו היטב. הגדרה זו, עם 48 מערכים בשקופית אחת, מאפשרת מבחני סימולטני של 6 glycan מחייב חלבונים ב -8 דילולים, חוקר 6 גליקנים שונים, כולל שני פקדים שאינם sialylated. זה שווה 18x 96-גם צלחות ב assay הצלחת המסורתית. פורמט המערך glycan פוחת צריכת תרכובות וביולוגיה ובכך משפר את יעילות.

הדפסה, סריקה &amp; Data מנתח כדי להבטיח הדפסה נכונה, זה חיוני כדי לקבל את היישור הנכון של הרשת הבחינה בתוך מסכת הטפלון, המתווה כל מערך בשקופית. במהלך ההדפסה, בשל האופי של ציפוי טפלון, כתמים שלא ניתן ל?...

Watch this Scientific Journal Video about A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins at JoVE.com

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

a-miniaturized-glycan-microarray-assay-for-assessing-avidity

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.9K Views.  The Scripps Research Institute. Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Video: A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

Assay עיכוב (איץ ' אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Medicine

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

שימוש של מיקרוarray אנטיגן שפעת כדי למדוד את היקף של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

The Hemagglutination Inhibition Assay to Detect Serum Antibodies Against a Target Antigen

Source: Kaufmann, L. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55833">An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrates a hemagglutination inhibition assay for detecting serum antibodies against specific antigens. Confirmation of hemagglutination inhibition in the test well and hemagglutination in the control well is achieved through distinct visual patterns. This assay plays a crucial role in assessing immune response, vaccine effectiveness, and studying viral infections in virology and immunology.

בדיקת עיכוב Hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגן מטרה

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An Assay to Measure Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers

Source: Gao, J., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54573">Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay measuring influenza neuraminidase (NA) inhibiting antibody titers in a serum sample. A serum sample containing antibodies against NA is added to a fetuin-coated microwell plate. Upon adding the virus, the antibodies prevent viral NA from cleaving fetuin and exposing its galactose moiety. A peroxidase-conjugated lectin is then added, which binds to the exposed galactose. The NA-inhibiting antibody titer is determined using a colorimetric test, where a peroxidase substrate gets cleaved by the immobilized lectin-conjugated peroxidase to produce color.

בדיקה למדידת נוגדנים מעכבי שפעת Neuraminidase Inhibition Titers

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Reagents and ...

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Viral Antigen Microarray Assay to Detect Antibody Isotypes in Serum Against Viral Antigen

Source: Khan, S., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/59973">Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we demonstrate the process for detecting antibody isotypes in multiple human serum samples using a microarray slide printed with antigenic subtypes of influenza virus strains.

בדיקת מיקרו-מערך אנטיגן נגיפי לאיתור איזוטיפים של נוגדנים בסרום נגד אנטיגן נגיפי

Source: Khan, S., et al., Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes. J. Vis. Exp. (2019)
In ...