The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

הערה: רמת הבטיחות הביולוגית (BSL) עבור הפרוטוקול להלן BSL 2 עבור נגיפי שפעת עונתיים BSL 3+ עבור נגיפי שפעת פוטנציאל מגיפים. טיטרציה ויראלי נדרש מראש של ניסוי נטרול להחליט ריכוז ויראלי של לשלוט בקצב התרבות הנגיף (VC). 1. טיטרציה וירוס הערה: בהתאם למספר של וירוסים ומספר כפילויות, צלחת גם ניתן להגדיר עם הגמישות הבאים: (1) דילול ויראלי ניתן לארגן יחד גם את השורות או העמודות (איור 1). כל וירוס צריך לכבוש שורה / עמודה נפרדת. (2) תוספת הדילול ויראלי היא גמישה, אבל זה צריך להתחיל עם ריכוז ויראלי הגבוה בפינה השמאלית העליונה. (3) אין הגבלה על מספר כפילויות. הערה: מדין דארבי כליות כלבים (MDCK) ו MDCK-SIAT1 (SIAT) תאים נמסרו באדיבות על ידי ד&quot;ר מ Matrosovich, מרבורג, Gerרב 10. תאים SIAT הם תאים MDCK transfected ביציבות עם CMP-N-acetylneuraminate האדם: הגן בטא galactoside α-2,6-sialyltransferase עבור ביטוי מוגבר של חומצה sialic (SA) אוליגוסכרידים הסתיים α2-6Gal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Aliquot MDCK מספיק או MDCK-SIAT תאים 8 לתוך צלחות 96-היטב (200 μl / טוב). דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ימים 2 או 3 כדי להגיע למפגש. הפץ את תאי DMEM בתוספת 10% נסיוב עגל העוברי חום המומת (FCS) ואנטיביוטיקה (100 פניצילין U / ml ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). דגירה התאים SIAT על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ו סולפט G418 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הערה: גורם לדילול תלוי ניסיון ואת שורת התאים בשימוש. בשכבת התא חייבת להיות ומחוברות (כלומר, אין קיר תא או מתאר גלוי עבור תאי MDCK וכן פריסה בחוזק ארוזה עבור תאי MDCK-SIAT1) בעת חיסון וירוס. דוגמאות של דילולים מבוססים עלתת-תרבות צלוחיות ומחוברות של תאים MDCK או MDCK-SIAT1 ניתנות בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים 3 פעמים עם 200 μl של מדיום הגידול וירוס (VGM) לכל טוב. לעקר את מכונת כביסה צלחת multiwall עם 70% EtOH למשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותו פוספט בופר סליין סטרילית (PBS) או VGM לפני הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב VGM ומיד להוסיף 50 μl של VGM היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μl של VGM לכל אחד 6 צינורות סטרילי (או פחות, בהתאם למספר של וירוסי בדיקת כפילויות). פיפטה 100 μl של הנגיף לתוך הצינור הראשון, ומערבבים היטב, לדלל סדרתי, שינוי עצות בין כל דילול. חזור על הפעולה עבור כל וירוס להיות טיטרציה. הערה: זה ייתן דילולים וירוס של 10 -1 עד 10 -6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של דילול כל וירוס, החל משעת הדילול הגבוה ביותר (1 x 10 -5 באיור 1), בארות כפולות (עמודות 9 ו -10 באיור 1) של 96-גם צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות כדי לאפשר הנגיף להדביק את התאים. הערה: דגירת 2 עד 3 שעות יש צורך להבטיח כי וירוסי הבידוד יש מספיק זמן להגיע בשכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את שכבת (10 מ&quot;ל / צלחת) הערה: כיסוי מורכב 5 מ&quot;ל של 2x DMEM, טריפסין (2 מיקרוגרם / הריכוז הסופי מ&quot;ל), 20 μl של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המניות, ו -5 מ&quot;ל של linters כותנה תאית (ראה רשימת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הכיסוי (200 μl לכל היטב). דגירת הלילה בשעה 37 ° C, ללא הפרעה. הערה: ניצני הווירוס מתקיימים לאחר כ -4 שעות, ולכן חשוב כי הצלחת אינה מופרעת אחרי הפעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הכיסוי מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת paraformaldehyde 4% קר כקרח ב PBS A (200 μl / טוב). מניחים אותם על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הערה: PBS A הוא שנאגר-פוספט הטבעי-pH מלוח עם 10 Gof NaCl, 0.25 גרם של KCl, 1.437 גרם של Na 2 HPO 4, 0.25 גרם של KH 2 PO 4, ו 1 ליטר של מים מזוקקים (ראה רשימת חומרים). הערה: Paraformaldehyde מזיק כאשר בשאיפה ויכול לגרום לכוויות בבליעה. יש גם עדויות מוגבלות השפעה מסרטנת, וזה עלול לגרום רגישות לאחר מגע עם העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב paraformaldehyde ולשטוף את הצלחות פעמיים עם PBS A (200 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את לוחות PBS ב 4 ° C לשימוש עתידי, או להמשיך בביצוע השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ permeabilization (100 μl / טוב). עזוב את זה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחת פעמים עם PBS A (200 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של הנוגדן הראשון, עכבר MAb מפני סוג שפעת (1: 1,000 ב הצפת ELISA), לכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 (או לילה 4 ° C), עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותו 3 פעמים 100 μl של חיץ לשטוף (0.05% 80 Tween ב PBS A, V / V) עמ &#39;אה כן. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בין שוטף. לחלופין, לשטוף אותו 3 פעמים ללא דגירה באמצעות 300 μl לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של הנוגדן השני, עיזים אנטי עכבר IgG (H + L) המצומד HRP (1: 1,000 ב הצפת ELISA), לכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1, עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותו 3 פעמים כמתוארות בשלב 1.17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את המצע (50 μl / טוב). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות או עד לפיתוח של צבע כחול נראה בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את התגובה, לשטוף את הצלחת פעמיים עם 200 μl של מים מזוקקים לכל טוב, דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 2 -3 דקות בין הכביסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש הצלחת ולאחסן אותו במקום חשוך (למשל, לעטוף אותו בנייר אלומיניום). </li></ol> 2. כימות טיטרציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת היטב באזור סריקה של סורק שטוח, כפי שמוצג באיור 2a. השתמש במגבלת עמדת L-צורהלהבטיח מיקום הדמיה אופטימלי דיר. הערה: אפשר תמונת שתי צלחות גם בסריקה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסרוק תמונה. הערה: ההגדרות מוצגות בלוח 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה &quot;Reader Wellplate&quot; כדי לחשב את ריכוז וירוס הנדרש (איור 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;תמונה טען&quot; כדי לטעון תמונה. חלק את הפס האדום בהיסטוגרמה של הכרטיסייה &quot;גלובל סף&quot; על מנת להתאים את סף הדגימה. לחץ על הכפתור &quot;רענן&quot; כדי לבחון את ההשפעה על התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבה &quot;נטרול חישוב / טיטרציה&quot;. לחצו על כפתור ה &quot;דגימה&quot; לכמת את ICP. לחצו על כפתור &quot;שמור&quot; כדי לשמור את תוצאות הדגימה כאשר תתבקש לעשות זאת. הערה: לאחר תהליך הדגימה, חלון חדש בשם &quot;נטרול &amp; טיטרציה חישוב&quot; מופיעה אוטומטית אם &quot;נטרול החישוב / טיטרציה&quot; התיבה מסומנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">טען או קלט את מפת ההגדרה היטב צלחת. ציין את הסף (למשל, 30%) ב &quot;טיטרציה: אוכלוסין וירוס אופטימליים (%)&quot;. בחר בכרטיסייה &quot;תהליך טיטרציה&quot; כדי לחשב את תוצאות טיטרציה. בדוק את התוצאות טיטרציה. לחצו על כפתור &quot;שמור וסגור &#39;כדי לשמור את התוצאות טיטרציה. הערה: עיין משלים S1 עבור הדרכה מפורטת יותר על התוכנה. עותק של התוכנה העידה זמין על פי בקשה. הערה: בדרך כלל, דילול הווירוס הטוב ביותר עבור תשואות assay פלאק ההפחתה כ -50% (20-85%) ICP של תאים הכוללים בתוך כל טוב 11. </li></ol></li></ol> ניטרול וירוס 3. הערה: חישוב מספר הצלחות נדרשו עבור assay הנטרול. כל צלחת יכולה להכיל וירוס אחד ומספר נסיובי. הערה: בהתאם למספר של נסיובי מספר כפילויות, צלחת גם ניתן להגדיר עם ההדואר בא גמישות: (1) הדילול בסרום ניתן לארגן יחד באחת מהשורות או עמודה (איור 4). כל בסרום צריך לתפוס מקום בשורה או בטור נפרד. (2) התוספת של דילול בסרום היא גמישה, אבל זה צריך להתחיל עם הריכוז בסרום הגבוה בפינה השמאלית העליונה של צלחת. (3) מספר כפילויות מאזן את מספר נסיובי. עוד כפילויות יכול לעזור להחליק את וריאציות ניסיון. (4) המספר של VC ומספר שליטת התא (CC) כפילויות גמישות, אבל הם גם צריכים להיות בשורות נפרדות או עמודות. צפוי כי מספר כפילויות VC הוא גדול משמעותית מזה של נסיובי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את monolayer התא, כמו צעדים 1.1-1.3, 2 או 3 ימים מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של VGM היטב כל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עמודות 11 ו -12 עבור VC ו CC, בהתאמה. הוסף 50 μl aliquots של 1:20 אנזים להרוס קולטן (RDE) בסרום -treated לשורה הראשונה (א) של קולוםns 1-10. הערה: לכל שילוב וירוס וסרום, assay מבוצעת בשני עותקים, כך צלחת ניתן, למשל, מכילה וירוס אחד נבדק נגד חמישה נסיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע דילולים סדרו פי 2 על ידי העברת 50 μl מ בטור א לחתור H (עמודות 1-10 באיור 4) ולהשאיר 50 μl מן השורה H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של diluent היטב בכל בעמודה CC (טור 12 באיור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של הנגיף היטב בכל צלחת, למעט הטור CC (עמודות 1-11, שורות AH באיור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זה על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות. הסר את הבידוד. מוסיף את הכיסוי (200 μl) זה טוב. דגירה זה לילה בשעה 37 ° C, ללא הפרעה. תיקון ו להכתים את הצלחות ובאשר טיטרציה הווירוס (שלבי 1.11-1.22). </li></ol> 4. כימות ניטרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת היטב באזור סריקה של סורק משטח אופקי, כפי שמוצג figuמחדש 2a. השתמש מיקום גבול L-צורה כדי להבטיח מיקום הדמיה אופטימלי דיר. הערה: אפשר תמונת שתי צלחות גם בסריקה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הצלחת, כמתואר בשלב 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה &quot;Reader Wellplate&quot; כדי לחשב את titers ויראלי הנדרש (איור 3, שלב 2.3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;תמונה טען&quot; כדי לטעון תמונה. חלק את העמודה האדומה &quot;גלובל סף&quot; על מנת להתאים את סף הדגימה. לחץ על הכפתור &quot;רענן&quot; כדי לבחון את האפקט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבה &quot;נטרול חישוב / טיטרציה&quot;. לחצו על כפתור ה &quot;דגימה&quot; לכמת את ICP. לחצו על כפתור &quot;שמור&quot; כדי לשמור את תוצאות הדגימה כאשר תתבקש לעשות זאת. הערה: לאחר תהליך הדגימה, חלון חדש בשם &quot;נטרול &amp; טיטרציה חישוב&quot; מופיעה אוטומטית אם &quot;נטרול החישוב / טיטרציה&quot; התיבה מסומנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען או קלט את p-טובהמפה מאוחר. ציין את הסף (למשל, 50%) ב &quot;ניטרול:. זיהום ניכוי (%)&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;תהליך ניטרול&quot; כדי לחשב את titers. בדוק את כותרות ולחץ על כפתור &quot;שמור וסגור &#39;כדי לשמור את התוצאות הניטרול. הערה: ניטרול הוא כפי שדווח הגומלין של הדילול הגבוה ביותר של נסיוב עם הפחתת ICP מוגדרת מראש (כגון 50% או 80%) נגד VC (הממוצעת של טור 11 באיור 4). ירידה של 50% ICP שמשה נציג התוצאות. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses.">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li><li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A(H3N2)+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes.">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site:+a+role+in+virus+attachment.">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li><li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+(egg-derived)+vaccine+or+natural+infection.">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li><li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+(H5N1)+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays.">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li><li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system.">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li><li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus:+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro.">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li><li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents/probes+and+pathway+analysis.">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+alpha-2,+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors.">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li><li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner.">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses.">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

במחקר זה, אנו תארנו assay MN מבוסס הדמיה לכמת את היחסים אנטיגני הנכונים בין וירוסים. לעומת מבחני פלאק-הפחתה אחרים, השיטה מדגישה מדידת ICP של באר כולו, הבטחת כיסוי מלא של האוכלוסייה התולעת. עצמאותה של הצטברות אבנית גם מרחיבה את היישום של assay כדי וירוסים שיכולים ליצור לוחות קטנים בלתי נראים בעיקר או שרק יכול לנהל זיהום תא בודד. לכן, assay היא מסוגלת לבחון יותר וירוסים ואת ההשפעות של מגוון רחב יותר של נוגדנים מ HI, וזה עוזר בצורה מקיפה יותר לשקף את הדמיון אנטיגני או הבדלים בין וירוסי 12. לדוגמא, כאשר carboxylate oseltamivir כלול, assay MN מושפע פחות NA התלוי מחייב, משקף את ההבדלים אנטיגני בצורה מדויקת יותר. במהלך הפיתוח של assay, נעשו מאמצים גדולים כדי לשפר את עקביות ניסוי, מהירות, וזיהוירגישות, כולל על ידי שליטת וירוסים קלט באמצעות טיטרציה ונרשמת, הדמית קצב העברת נתונים גבוהות עם סורק משטח אופקי, ויישום פלטפורמת עיבוד נתונים ידידותי למשתמש. התוצאות היו בדרך כלל בקנה אחד עם ואישר אלה של HI. יש לציין, כי התוצאות גם חשפו הבדלים אנטיגני בין הגירסות להיסחף אנטיגני של וירוסי סוג האחרונים ו- B חיסון, כמו גם שינויי אנטיגני נגרמים על ידי שינויים בתרבות שנבחרה או ספורדי, כגון החלפת G155E ב HA1 של מסוימים (H1N1) וירוסים pdm09 12. הפרוטוקול מתאים לסוג הווירוס או תת-סוג עם מבחר של שורות תאים כי נתנו את הזיהום החזק, אשר משפר את אות ההדמיה. וריאציה ניסיוני הוחלקה עם העיצוב של כפילויות כי מאוזנת עם מספר נסיובי נבדק. חוסר ודאות יכולה גם לבוא איכות התמונה, אשר מושפעת בעיקר על ידי מכשיר ההדמיה. סורק הגון שטוח צבע יכול משמעותיficantly לשפר את הניגודיות בתמונה להפחית את הרעש. כמות וירוס קלט נטרול צריכה להיקבע באופן כמותי מראש מן טיטרציה המקביל ואילו וירוסים ועדיין לשמור על מצב דומה. במהלך נטרול, התגובה antiserum לזיהום הוא מנורמל נגד ההבדל בין וירוס הפניה (VC) ורמת רקע (CC). מדידות מדויקות של VC ו CC חיוניים ניסוי הניטרול. עוד כפילויות מומלצות (שמונה כפילויות ששמשו נציג התוצאות). לבסוף, הבנת התוכנה היא חיונית להצלחה של ניסוי. התוכנה נבדקה לאפיון וירוס שיגרתי של מרכז שפעת WHO, בבריטניה במשך יותר משנים. הוראות מפורטות להתמודדות עם מצבים שונים מסופק S1 משלים. assay MN זו מתאימה עבור יישומים בהם דגימות לכסות שלוחהשדה גדול remely המבט אלא רק דורשים רזולוציית הדמיה מתונה. העלות הנמוכה התקנה פשוטה להפוך את המערכת זמינה למעבדות וירולוגיה ביותר. הווריאציה במדידות של המדגם הזהה הייתה פחות מ -3%, אשר בערך מגדיר הוודאות הציגה במהלך הסריקה 11. שחזור כזה הוא מספיק במחקרי virological רבים ניתן להפחית עוד יותר על ידי ממוצעי תמונות מסריקות מרובות. לסיכום, המחקר הנוכחי מדגים assay MN חזקים שניתן להשתמש בהם באופן שגרתי במחקר אנטיגני ולתמוך נתונים HI בניתוחים מפורט של כרגע-מחזורי נגיפי שפעת, בעיקר עבור הבחירה הדו-שנתי של וירוסים להכללה החיסונים לשפעת האדם.

מבחני מיקרו-נטרול (MN) משמשים וירולוגיה עבור quantitation של נוגדנים מנטרלים וכן את פעילות אנטי. כחלופה של עיכוב hemagglutination (HI) מבחנים, מבחני MN יכולים להתגבר השפעות חד אנטיגני מושפעות משינויי הזיקה של קולטן מחייב נגיפי שפעת, אשר יכול לסבך את הפרשנות של HI תוצאות 1,2,3. עד לאחרונה, רוב מבחני MN התבססו על תופעות cytopathic (CPE) או מבחני immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 4,5. מבחני MN מבוסס על הפחתת מוקד ורובד פותחו 6,7,8 1990. מבחני הפחתת רובד להסתמך על ספירת הפלאק גלוי לכמת infectivity. עם זאת, ספירה חזותית לכסות רק לוחות גדולים כי הם פתירים על ידי עין אנושית, למרות שהרוב הפלאק הם קטנים ובלתי נראים לאיתור וירוסים במחזור נוכחי רבים. כיסוי חלקי זה יכול לגרום וריאציה משמעותית בין בוחנים בין ניסויים, שמוביל iתוצאות ncomparable. זה גם בלתי אפשרי להשתמש בשיטה כאשר וירוסים מסוימים מוצגים זיהום נפל של תאים בודדים או הפלאק קטן מאוד. החלטת ספירת העניים ניתן לשפר על ידי כניסתה של פרוטוקול מבוסס-הדמיה. עם ההתקדמות הטכנולוגית, מיקרוסקופיה אופטית תפוקה גבוהה הקוראים גם צלחת יכול לספק אמצעי מדויק לספור את התאים הנגועים 9. תחת מיקרוסקופ טרנס-מואר, תאים נגועים מתויגים עם סמנים מסוימים עשויים להיות דמיינו לעומת הקליטה או קרינה שלהם בהחלטת משנה הסלולר. מדגם לאחר מכן ניתן לנתח על מסך מחשב. למרבה הצער, בשל הגבלת שדה הראייה, יותר ממאה תמונות רעפים נדרשות לכסות היטב יחיד. ניתוח צלחת עם 96 בארות ידרוש ההדמיה והעיבוד של כעשר אלף תמונות. תהליך כזה מייגע הוא זמן רב ויקר, ואת ברזולוצית צבר היא בכללl מיותר לאפיון שגרת זיהומים נגיפיים. מעבדות עם תקציב מוגבל עשויות לגלות כי הגישה הבנויה סביב וסורק מספקת אלטרנטיבה חסכונית, תפוקה גבוהה. במאמר זה, אנו מתארים assay MN הפחתת פלאק משופר כי הוא מתאים לאפיון אנטיגני של מספר רב של וירוסים ותוכנות עבור מדידת פעילויות אנטי כמותית ונוגדנים הניטרול. יש assay מספר יתרונות: ראשית, היא assay מבוססת הדמיה כי הוא מסוגל למדוד וירום ברמה התאית, ללא קשר לגודל פלאק. ספירת אוכלוסיית התא הנגועה הכוללת (ICP) בתוך באר מגדיל מאוד את רגישות זיהוי, מה שהופך אותו ניתן לאפיין את הווירוסים עם infectivity הנמוך. שנית, טיטרציה כמוני מדויקת יותר הוא הציג לפני נטרול כדי לקבוע את כמות נגיף קלט. וירוס קלט כמותית מפחית באופן משמעותי את Variation בין ניסויים שונים והופך את התוצאות יותר להשוות בין מעבדות. שלישית, טיטר נטרול ניתן לקבוע ישירות על ידי ניתוח תמונות, מה שהופך את quantitation מהיר וידידותי למשתמש. לבסוף, פרוטוקול מספק חסכונית אלטרנטיבה תפוקה גבוהה עם רזולוציה והדיוק הנדרשים. Quantitation מבוסס על וסורק ותוכנות עיבוד נתונים חינם. ההתקנה כולה יש טביעת רגל קטנה והוא פריסה ברוב המעבדות. הפרוטוקול המובא במאמר זה מורכב מארבעה שלבים עיקריים, כולל טיטרציה וירוס, quantitation טיטרציה, נטרול הנגיף, quantitation הניטרול. טיטרציה וירוס הוא ניסוי הכנה שקובע את כמות וירוסים קלט לשמש הניטרול. במהלך טיטרציה, מספר ריכוזים ויראלי מוחלים על monolayers התא בצלחת 96-היטב. התאים הנגועים אז נבדקים ונרשמים בסעיף 2. dilu ויראליtion שמייצר 20% -85% ICP הוא בתורו מיושם כמו וירוסי קלט הנטרול המקביל סעיף 3. טיטר של פרוטוקול נטרול הם לכמת באמצעות סעיף 4. ניסויים שבאו בעקבות הפרוטוקולים הנ&quot;ל מוצגים נציג תוצאות. את assay נבדק ביסודיות במהלך השנים האחרונות עם רוב נגיף שפעת במחזור הנוכחית, כגון A (H1N1) pdm09, A (H3N2), וירוסי B. התוצאות של אפיון נגיף שפעת נכללו בדוחות עבור פגישת יעוץ WHO כי נתן המלצות על החיסונים לשפעת לשימוש בחצי הכדור הדרומי בשנת 2016 בחצי הכדור הצפוני ב 2016-2017.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">VGM</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">D6429, P0781</td>
			<td style="width:383px;">500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">PBS A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl - 0.25 gm, Na2HPO4 - 1.437 gm, KH2PO4 &#8211; 0.25 .gm, and Dist. Water &#8211; 1 L.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">Avicell</td>
			<td style="width:172px;">FMC</td>
			<td style="width:383px;">RC-581F</td>
			<td style="width:383px;">2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">2XDMEM</td>
			<td style="width:172px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:383px;">21935-028</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Trypsin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">T1426</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:177px;">Overlay (10ml/plate):</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">5ml 2X DMEM, Trypsin 2&#956;g/ml final conccentration,Avicell&#160; - 5ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Triton X- 100e</td>
			<td style="width:172px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:383px;">T8787</td>
			<td style="width:383px;">Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Tween 80</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">P5188</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Wash Buffer: 0.05% Tween &#8211; 80 in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Horse serum</td>
			<td style="width:172px;">PAA Labs Ltd</td>
			<td style="width:383px;">B15-021</td>
			<td style="width:383px;">ELISA Buffer: 10%&#160; in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Mouse MAb against influenza type A</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">MCA 400</td>
			<td style="width:383px;">1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">172-1011</td>
			<td style="width:383px;">2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">True Blu peroxidase substrate</td>
			<td style="width:172px;">KPL&#160;</td>
			<td style="width:383px;">50-78-02</td>
			<td style="width:383px;">Substrate:&#160; True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">96-well flat-bottom microtitre plates</td>
			<td style="width:172px;">Costar&#160;</td>
			<td style="width:383px;">3596</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">8 channel multiwall-plate washer and manifold</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">M2656</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:177px;">Perfection Plate Scanner</td>
			<td style="width:172px;">Epson</td>
			<td style="width:383px;">V750 Pro</td>
			<td style="width:383px;"><a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads.">The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&#38;infoType=Downloads.</a></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Software operational environment: LabVIEW</td>
			<td style="width:172px;">National Instruments Corporation</td>
			<td style="width:383px;">Window based with NI Vision builder</td>
			<td style="width:383px;">Version: LabVIEW2012 or above</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

בעקבות התהליך המתואר לעיל, אנו מציגים כמה תוצאות מניסויי אפיון אנטיגני אחרונים. התקנת טיטרציה נועדה לבחון שמונה וירוסי קלט, עם כפילויות כפולות עבור כל דילול. דילולים ויראלי נבדקו בין 1.0 x 10 -1 ו 1.0 x 1.0 -6 לכסות את ההבדלים בין הווירוסים. הוירוסים הבדיקה היו מן תת סוג H3N2, לרבות A / קמרון / 15V-3538/2015, A / ולדיווסטוק / 36/2015, A / מוסקבה / 103/2015, A / טומסק / 5/2015 /, A / מוסקבה / 101 / 2015, A / מוסקבה / 100/2015, A / מוסקבה / 133/2015, ו- A / ברטיסלבה / 437/2015. תוצאות טיטרציה הן באיור 5. 5D איור מדגים את הירידה של ICPs עם עלייה של דילול וירוס. העקומות היו מנורמלות נגד ICPs מאותו הווירוסים שהניבו זיהומים בכל התאים בתוך באר 12 (מוגדר רווית ICP). אם ICP לא הגיע לרוויה עם ההייריכוז נגיף ghest, ממוצע ICP מן הכפילויות מקבילות שמש במקום (A / מוסקבה / 103/2015 איור 5D). דילולי הווירוס שייצרו 30% רווית ICP נבחרו דילול וירוס קלט לנטרול (לוח 3). ניטרול שמטרתה יש וירוס קלט אחד נגד חמישה נסיובי, עם כפילויות כפולות על כל צלחת. הווירוס האסמכתא המופיע הוא A H3N2 / Stockholm / 63/2015. חמשת נסיובי הם A / HK F12 ביצה 4801/14 / 15, A / HK F02 MDCK 7295/14 / 15, A / דרום אפריקה R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / שוויצרי 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, ו- A / הולנדית 525/14 SIAT F23 / 15. תוצאות הנטרול הן באיור 6. 6d האיור מציג את התקדמות זיהום עם העלייה של דילול בסרום. האוכלוסייה החיובית מנורמלת על הציר האנכי מייצגת את היחס של ICPs מתגובת נסיובי המקבילה נגד ממוצע ICP<html> של נגיף התייחסות 12. ICP רקע מפיקוח תא הנגוע היה מופחת במהלך הנורמליזציה. את titers נטרול נקבעו כמו reciprocals של דילולים antiserum המקביל ל -50% הפחתה ICP (לוח 4). אינטרפולציה לינארית שמשה כדי להעריך titers נופל בין שני דילולים בסרום סמוכים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> איור 1: דוגמה של תוכנית ההתקנה היטב הצלחת ניסוי טיטרציה וירוס. וירוסי מבחן מוקצים בשורות נפרדות (א &#39;עד ח&#39;). עמודות מיועדות דילולים ויראלי שונים (1 עד 12). שני טורים שימשו כפילויות עבור כל דילול ויראלי. סרגל קנה מידה = 10 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> p-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig2.jpg" /> איור 2: שרטוטים של מערכת סריקה המדגם. (א) צלחת 96-היטב על מצבת ההדמיה של וסורק (מחדש מן אסמכתא 11 באישור BV Elsevier), ו- (ב) מידות של גבול עמדת L-צורה שמוצגת (א). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> איור 3: תרשים שולחני של התוכנה &quot;Reader Wellplate&quot; quantitation. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </p&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> איור 4: דוגמה של תוכנית ההתקנה של צלחת היטב בניסוי הניטרול. antiserum מוקצה לשתי עמודות עם כפילויות (1 עד 10). שורות מיועדות דילולי סרום שונים (א &#39;עד ח&#39;). שליטת הווירוס לוקחת טור 11, עם שמונה כפילויות (A11 כדי H11). שליטת התא נמצאת טור 12, עם שמונה כפילויות (A12 כדי H12). סרגל קנה מידה = 10 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> איור 5: תוצאות של ניסוי טיטרציה. (א) הגדרת היטב צלחת, (ב) תמונה סרוקה היטב צלחת, (ג) איורשל דילולים צבע בקידוד, ונרשמת, אוכלוסיית תאים הנגועים בנגיף, ו- (ד) אוכלוסיות תאים מנורמל הנגועים בנגיף נגד וירוס. ICP 30% שימש הסף. ברי השגיאה ב (ד) מציינים את סטיית התקן (SD) מן כפילויות המדגם (± 1 SD). ברים בקנה מידה (ב) ו- (ג) = 10 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> איור 6: תוצאות של ניסוי הניטרול. (א) הגדרה היטב הצלחת, (ב) סרק היטב צלחת תמונה, (ג) איור של אוכלוסיית תא והנרשמת, נגוע בוירוס, ו- (ד) אוכלוסיית תאים מנורמלת נגוע בנגיף נגד הדילול בסרום. השישי קלטרוס (VC) הוא A / שטוקהולם / 63/2015. 50% ICP שימש לחישוב titers. ברי השגיאה ב (ד) מציינים את סטיית התקן (SD) מן כפילויות המדגם (± 1 SD). ברים בקנה מידה (ב) ו- (ג) = 10 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> S1 משלים: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3"> דילול אופייני </td></tr><tr><td></td><td> תאי MDCK </td><td> תאי MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 ימים </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 1:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 ימים </td&gt; <td> 1:10 (1 + 9) </td><td> 1:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> מספר טיפוסי של תאים לכל מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> תאי MDCK </td><td> תאי MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 ימים </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 ימים </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: דילולים אופייניים על תת-תרבות של צלוחיות ומחוברות של תאי MDCK או MDCK-SIAT1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מצב </td><td> מצב מקצועי </td></tr><tr><td> סוג מסמך </td><td> סרטים (עם מדריך עירוני סרט) </td></tr><tr><td> סוג חשיפה אוטומטית </td><td> תמונה </td></tr><tr><td> Imסוג גיל </td><td> 24 סיביות צבע </td></tr><tr><td> רזולוציה </td><td> 1,200 dpi </td></tr><tr><td> פורמט תמונה נשמר </td><td> רִיב </td></tr></tbody></table> טבלה 2: התקנה טיפוסית של וסורק. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שׁוּרָה </td><td> וִירוּס </td><td> דילול מומלץ </td></tr><tr><td> א </td><td> A / קמרון / 15V-3538/2016 </td><td> 1.0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / ולדיווסטוק / 36/2015 </td><td> 1.0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / מוסקבה / 103/2015 </td><td> 1.1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / טומסק / 5/2015 </td><td> 5.9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / מוסקבה / 101/2015 </td><td> 8.3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / מוסקבה / 100/2015 </td><td> 1.4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A / מוסקבה / 133/2015 </td><td> 1.3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / ברטיסלבה / 437/2015 </td><td> 1.3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> טבלה 3: דילולים ויראלי מחושב מתוך אוכלוסייה של 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טור </td><td> נסיובי </td><td> כייל מומלץ </td></tr><tr><td> 1 - 2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3 - 4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213.3 </td></tr><tr><td&gt; 5 - 6 </td><td> A / דרום אפריקה / R2665 / 2015 </td><td> 2155.8 </td></tr><tr><td> 7 - 8 </td><td> A / שוויץ / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9 - 10 </td><td> A / הולנד / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> לוח 4: titers ב 50% ICP של A / שטוקהולם / 63/2015 נגד נסיובי.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

מחקר זה מתאר מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.9K Views.  The Francis Crick Institute.  מחקר זה מתאר מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווי?...

Video: Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית ​​השתן האפיתל

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית השתן האפיתל

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית ​​השתן האפיתל

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית השתן האפיתל