מחקר זה מומן על ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית, שירות המחקר החקלאי. שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה מוזכרים אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו משתמע המלצה או תמיכה על ידי משרד החקלאות ארצות הברית. USDA היא ספקית שוויון הזדמנויות מעסיקה.

1. פרינג ההיקפיים של מושבת חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול X. fastidiosa (XF) טמקולה סוג בר 22, מוטצית מחיקת pilG XF ΔpliG (באמצעות אסטרטגית מחיקה שתוארה לעיל 23), ו -C XfΔpliG המשלה (באמצעות שתואר לעיל אסטרטגיה שלמה גנטי מבוסס כרומוזום 24) על צלחות אגרו בינוני PD2 25 על 28 מעלות צלזיוס למשך 5-7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלופן החיטוי (1 x 1 ס&quot;מ 2) במים ב 121 ° C (249 ° F) במשך 15 דקות. תרימי חתיכה אחת של צלופן, לנקז את המים על ידי נגיעה בפינה אחת של צלופן על צלחת פטרי ריקות, בזהירות להניח את הצלופן מעל 15% של השטח אגר ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים X. פרט מושבות fastidiosa עם סטרילי קיסמים מעוגלים ותא נקודה בסביבה נקיה מחיידקים על גבי גיליון מעוקר של צלופן המעולף על 15% של שטח אגר הצלחות אגרו. דגירה את הצלחתs ב- C ° 28 במשך 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מורפולוגיה קץ המושבות באמצעות מיקרוסקופ לנתח עם עדשת 2X אובייקטיבית עדשה 10X עינית. צלם את השוליים היקפי סביב מושבות. </li></ol> 2. צ&#39;יימברס זרימה מיקרוסקופים Microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק מכשירי microfluidic באמצעות נהלי צילום ליתוגרפיות דומים לאלה שתוארו קודם לכן 5,18. תכנון ארבעה ערוצים מקבילים עם תוכנת תכנון בעזרת מחשב על פרוסות סיליקון מאסטר בשיטות ליתוגרפיות תקן 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור לתאי microfluidic מאדון פרוס סיליקון עם polydimethylsiloxane (PDMS). יוצקים PDMS unpolymerized כלפי מאמן פרוסות סיליקון ולרפא אותו ב -60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לקלף את העתק PDMS מן האדון רקיק וקוצצים את העתק PDMS עם להב לתוך 22 מ&quot;מ x 40 מ&quot;מ בגודל זהה של coverslip זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את העתק PDMS, coverslip זכוכית (22 x 40 מ&quot;מ 2), וכן microscשקופית אופ (51 x 76 מ&quot;מ 2) לפלזמה האוויר של 30 וואט למשך 2 דקות 27. סנדוויץ הגוף PDMS בין coverslip זכוכית מיקרוסקופ זכוכית לבנות תא uidic fl מיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חור (5.5 מ&quot;מ קוטר) דרך PDMS בכל קצה של ערוץ בדוגמת. חותכים את צינורות סיליקון גומי לתוך ארוך 12-20 ס&quot;מ. הכנס קצה אחד של צינור גומי סיליקון (5.1 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 2.1 מ&quot;מ קוטר פנימי, 0.8 קיר מ&quot;מ) לתוך בכל קצה הפתיחה של הערוצים של העתק PDMS, וסוגרים אותו עם PDMS unpolymerized ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קצה אחר של הצינור עד הסוף הדוקרני של מחברי luer פלסטיק. עוטפים את תאי microfluidic התאספו עם רדיד אלומיניום ו החיטוי אותם במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאי חיידקים של X. סוג בר fastidiosa, מוטציה XF ΔpliG, ו XfΔpliG -C משלימים באמצעות גירוד, באמצעות inoculating הפנויה לולאות מצלחות בינוני PD2. התאם צפיפות התאיםכדי צפיפות אופטית של 0.05 ב 600 ננומטר במרק PD2 כפי שתואר קודם לכן 23. לאסוף את הפתרון תא החיידק לתוך מזרק 1 מ&quot;ל gastight. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המכשיר microfluidic על הבמה מיקרוסקופ הפוכה. חברו צינור היניקה אל מזרק 5 מ&quot;ל gastight המכיל מרק PD2. התאימו את מזרק 5 מ&quot;ל gastight עם משאבות מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את צינור מוצא למאגר הפסולת. יש לשמור על קצב זרימה בינונית של 0.2 דקות μl -1 למשך 30 דקות כדי לייצב את המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות-כניסת צד מזרק 1 מ&quot;ל gastight המכיל את פתרון תא החיידק. שטוף את פתרון תא החיידק דרך צינורות הגומי עד הערוץ הוא הגיע. יש לשמור על קצב זרימה בינוני של 0.2 דקות μl -1 עבור 30 דקות אחרות כדי לשטוף תאים מאוגדים מהאולם לפני לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תריס מיקרוסקופ תחת במשרה מותאמת השדה של המיקרוסקופ לשלוט האור. חבר את התריס כדי שיתוף התריסמערכת ntrol ולחבר את מערכת בקרת תריס למחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מצלמה דיגיטלית ליציאת וידאו של המיקרוסקופ ולחבר אותו למחשב. הפעל את תוכנת הצריבה זמן לשגות, בחר את הפונקציה &quot;תריס&quot; מהתפריט, ולהכיר את התריס מותקן באופן אוטומטי כברירת מחדל בתוכנה כדי ליצור חיבורים אל התריס עם התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את פונקציית &quot;מצלמה דיגיטלית&quot; מהתפריט של תוכנת הצריבה לשגות הזמן להכיר את המצלמה הדיגיטלית באופן אוטומטי כהתקן לכידת ברירת המחדל בתוכנה ליצור תקשורת עם מצלמה דיגיטלית עם התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר תאים חיידקיים באחד הערוצים באמצעות 20X אופטיקה שלב בניגוד, ואז לעבור העדשה אובייקטיבי 40X לפני לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת הצריבה זמן לשגות, בחר את הפונקציה &quot;רכישת התמונה&quot; באמצעות פרמטרים של ברירת מחדל מהתפריט לרכוש את התמונות מן מיקרוסקופ.לאחר מכן, לפתוח את פונקצית &quot;רוכש זמן לשגות&quot; ולהגדיר את מרווח הזמן עד 30 שניות 5,18,28 של משך 6-24 שעות תלוי ניסוי צריך לראות את התנועה מתעוות של X. fastidiosa 5,18,28. לחץ על &quot;אישור&quot; כדי להתחיל את ההקלטה זמן לשגות. לחץ &quot;סטאק פונקציה&quot; מהתפריט, בחר &quot;שמירה בשם&quot; לערום את התמונות בתיקיית היעד במחשב לאחר שסיים את ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מספר רב של ערוצים, ללכוד תמונות זמן לשגות מהערוץ הראשון כל 30 שניות במשך 6 שעות. הזז את העדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ לערוץ הבא כדי לאתר את תאי היעד. חזור על הפונקציה זמן לשגות כמתואר לעיל כדי ללכוד תמונות בכל אחד ברצף ארבעה ערוצים אם הניסוי מוגדר לנצל ארבעה ערוצים. המשך לכידת תמונה זמן לשגות עבור כל עוד שלושה ימים רצופים. כל הניסויים בוצעו בטמפרטורת החדר (23 ± 2 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקמפל את זמן לשגות תמונות לתוךקובץ וידאו באמצעות תוכנת הדמיה הקלטה זמן לשגות. הפעל תוכנת צריבת הזמן לשגות, לחץ על &quot;פונקצית סטאק&quot; מהתפריט, ובחר &quot;פונקציה גרם פתוחה&quot; כדי לפתוח את הקבצים המוערמים מהמחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את &quot;הסרט הפוך&quot; פונקציה ממודול מחסנית, בחירת כל התמונות ובחירת פורמט &quot;AVI&quot; פלט. לחץ על &quot;שמירה בשם&quot; כדי לשמור את קובץ הווידאו בתיקיית היעד במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סרטים מלוקט מתוך תיקיית היעד במחשב ולשחק בהם. לאחר מכן, לבחון את תנועתיות של תאים בודדים באמצעות ויזואליזציה וכתוצאה מהפעילות מתעוות תנועתיות של תאי חיידקים קבצי וידאו שנוצר. </li></ol>

<ol>
	<li>Purcell, A. H., Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fastidious+xylem-limited+bacterial+plant+pathogens.">Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).</li><li>Purcell, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylella+fastidiosa,+a+regional+problem+or+global+threat.">Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat.</a> J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).</li><li>Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylella+fastidiosa:+Xylem-limited+bacterial+pathogen+of+plants.">Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).</li><li>Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+pili+and+twitching+motility.">Type IV pili and twitching motility.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upstream+migration+of+Xylella+fastidiosa+via+pilus-driven+twitching+motility.">Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility.</a> J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+affect+twitching+motility,+biofilm+formation+and+cell-cell+aggregation.">Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation.</a> Microbiology. 153, 719-726 (2007).</li><li>Simpson, A. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+plant+pathogen+Xylella+fastidiosa.">The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa.</a> Nature. 406, 151-157 (2000).</li><li>Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+pilus+motor+forces+exceed+100+pN.">Single pilus motor forces exceed 100 pN.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).</li><li>Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+characterization+and+determination+of+adhesion+forces+of+Pseudomonas+aeruginosa+pili+by+using+atomic+force+microscopy.">Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy.</a> J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).</li><li>Skerker, J. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+extension+and+retraction+of+type+IV+pili.">Direct observation of extension and retraction of type IV pili.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).</li><li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements.">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunol. 2, 9 (2001).</li><li>Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+'stick-and-roll'+adhesion+of+type+1+fimbriated+Escherichia+coli.">Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli.</a> Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+adhesion,+biofilm+formation+and+motility+of+Acidovorax+citrulli+using+microfluidic+flow+chambers.">Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers.</a> FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).</li><li>Thomas, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+laminar+flow+system+to+explain+shear-enhanced+bacterial+adhesion.">Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion.</a> Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. , 751-759 (2005).</li><li>Fuente, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+adhesion+forces+of+type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+bacteria+by+use+of+a+microfluidic+flow+chamber.">Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).</li><li>DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PilJ+localizes+to+cell+poles+and+is+required+for+type+IV+pilus+extension+in+Pseudomonas+aeruginosa.">PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa.</a> Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).</li><li>Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+type+I+and+type+IV+pilus+biosynthetic+genes+affect+twitching+motility+rates+in+Xylella+fastidiosa.">Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa.</a> J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).</li><li>Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+II+che+genes+from+Pseudomonas+aeruginosa+are+required+for+an+optimal+chemotactic+response.">Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response.</a> J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).</li><li>Cursino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Operon,+Pil-Chp,+That+Controls+Twitching+Motility+and+Virulence+in+Xylella+fastidiosa.">Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).</li><li>Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemoreceptors:+High-performance+signaling+in+networked+arrays.">Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays.</a> Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).</li><li>Costa, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+hosts+of+Xylella+fastidiosa+in+and+near+southern+California+vineyards.">Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards.</a> Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).</li><li>Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+regulatory+pathways+in+Xylella+fastidiosa:+genes+and+phenotypes+controlled+by+algU.">Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).</li><li>Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome-Based+Genetic+Complementation+System+for+Xylella+fastidiosa.">Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).</li><li>Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+Media+for+the+Pierce's+Disease+Bacterium.">Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium.</a> Phytopathology. 70, 425-429 (1980).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).</li><li>Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+interfacial+interactions+between+semispherical+lenses+and+flat+sheets+of+poly-(dimethylsiloxane)+and+their+chemical+derivatives.">Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives.</a> Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).</li><li>Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-enhanced+twitching+motility+in+Xylella+fastidiosa+is+linked+to+a+single+PilY1+homolog.">Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

במחקר זה, אנו שאפיינו את התנהגות התנועה של X. fastidiosa PilG מוטציה XF ΔpilG וללחצים XfΔpilG- C משלים שלה החדש תוכנן מרובים מיקרו במקביל ננו-ערוץ fl תאי uidic. קלי FL מייקרו החדש תוכנן תאי uidic יכולים להכיל עד ארבעה תאים במקביל 100 מיקרומטר ערוצי ננו רוחב לעומת עיצו?...

Fastidiosa Xylella הוא חיידק שאינו והולקה בשוט גראם שלילי, פתוגניים הגורם למספר מחלות יבול חשיבות הכלכלית, כולל המחלות של פירס גפן (ותטיס vinifera ל) 1,2, 3. חיידק זה מוגבל עצת ניצוח המים כלי. זיהום של גפן גורם סתימה של צינורות עצה ותוצאות לחץ מים חסרים תזונתי 3. הקולוניזציה מוצלח תלוי ביכולת של החיידק לעבור מהאתר הראשוני של הידבקות לשאר הצמח 3. מתעוות תנועתיות הוא אמצעי תנועת חיידקים עצמאי-flagellar באמצעות הרחבה, מצורף, ההכחשה של פילי IV הסוג קוטבי 4 כי כבר מאופיין ב X. fastidiosa 5,6,7. תנועתיות מתעוות נצפתה על ידי פינצטה לייזר ו במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 8,9,10. שימוש בשיטות אלה, tmotilities הכישוף שנוצר על ידי pilus IV סוג של נ gonorrhoeae ו פ aeruginosa התאפיין פילי תיוג uorescently fl לכידות תנועותיהם מיקרוסקופיות. למרות שני השיטות שפרטו הכח הדבק של חיידקים בודדים, הנהלים הם מסובכים וגוזל זמן 9,10. תאי uidic מיקרו fl שימשו להתבונן הגירה למרחקים ארוכים של תאים בודדים, כמו גם אגרגטים קטנים של תאים חיידקיים 5,6. תאים אלו עוצבו כמו ערוצי microfabricated-ננו צלחת משולבת עם 11,12,13,14 מערכת הקלטת הזמן לשגות תמונה. מייקרו fl מכשירים הקאמריים uidic מציעים כמה יתרונות ללימוד התנהגות תנועת תאי תאי האינטראקציות של חיידקים: (i) הוא מספקת פלטפורמה משולבת עם יכולות ערוץ מרובות; (Ii) זה יכול לבחון את תנועות ו מצבורים של תאים בודדים של תכונות בקנה מידה ננו של חיידקים; (Iii) הוא מאפשר מטר ישירהקלטה תמונה icroscopic של תאים חיידקיים וניתוח זמן לשגות, (iv) שהיא מספקת תצפיות במרחב ובזמן לטווח ארוך של הפרט / או אוכלוסיות של חיידקים בסביבה-מיקרו; (V) את קצב הזרימה של מדיום תרבות ערוץ ניתן לשלוט באופן מדויק ו (vi) רק נפח קטן מאוד (1 מיליליטר) של מדיום התרבות נדרש עבור כל ניסוי. לאחרונה, מיקרו fl uidic fl ow מערכת הועסק לחקור את ההתנהגויות של תאים חיידקיים תחת microenvironments שונים 14,15,16. הדביק ואת מצורף המשטח של E. 15 coli, X. fastidiosa 16, ו Acidovorax citrulli 14 משטחי זכוכית הוערכו באמצעות תאי מיקרו fl uidic. ההצטברות וביו בקולנוע היווצרות בתיווך פילי סוג IV של citrulli Acidovorax נותחו 14. יתר על כן, ההצעה של א citrulli שרואים בזמן fl ow גonditions הוכיח כי פילי הסוג IV עשויים לשחק תפקידים חשובים קולוניזציה ולהפיץ של א citrulli ב צינורות העצה תחת SAP fl ow תנאים. Motilities והמרטיט של Pseudomonas aeruginosa ו X. תאי fastidiosa נצפו בהצלחה נגד זרם נוזל בתוך תא זרימת microfabricated 5,6,17. IV pilus סוג לוקה מוטציות pilB ו pilQ של X. fastidiosa נמצא עמוקות לשנות את המהירות של מתעוות תנועתיות בתנאי הזרימה בהתקני uidic fl מיקרו 5,6,18. המחקרים שנערכו על הידבקות חיידקים תנועתיות בהתקנים מיקרו fl uidic ציינו כי fl מיקרו תאי uidic מתאימים במיוחד לניתוח תנועתיות לפרכס נדידת חיידקים בתיווך פילי במבחנה. תוצאות אלו מסבירות את מנגנון ההעברה בתיווך מתעוות המאפשר מצורף תאי תאים, צבירת קולוניזציה בתוךהמארח, בסופו של דבר להוביל לזיהום סיסטמי. פיל-CHP אופרון של X. fastidiosa מכיל pilG, פילים, pilJ, גלולה, chpB ו chpC מקודדי אות התמר מסלולי 20. וכימיים הטרנסממברני להיקשר לגירויים כימיים בתחום periplasmic ולהפעיל מפל איתות חלק cytoplasmic שלהם בסופו של דבר לשלוט תנועתיות מתעוות חיידקים. בשנת אופרון Pil-CHP של X. fastidiosa, PilG חלבון phospho-הסעות הוא homologue כדי סטרייצ&#39;י. בתוך א &#39; coli ו פ aeruginosa, סטרייצ&#39;י הוא הרגולטור בתגובה במערכות chemotaxis כי אינטראקציה עם החלבונים המנועים שוטונים 19, 21. למרות התרומות של אופרון Pil-CHP כלפי ארסיות X. fastidiosa נבחנו לאחרונה 20, תפקיד pilG ב אופרון chemotaxis בתגובה לאותות סביבתיים פילי IV סוג מוסדר / מנוע של X. fastidiosa הוא UNCליר. כדי להבהיר את התובנה של chemotaxis הרגולטור pilG בפעילות של תנועתיות ומרטיט של X. fastidiosa, תא מיקרו fl uidic משמש כדי להעריך את תנועתיות ומרטיט של X. fastidiosa. PilG של fastidiosa X. מאופיין על ידי השוואת פנוטיפים של מוטציה המחיקה XF ΔpliG, -C XfΔpliG זן משלימה סוג בר שלו במבחנה. התוצאות ממחישות את תפקידו של pilG ב תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Biology materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;X. fastidiosa (Xf)&lt;/em&gt; Temecula wild type</td><td></td><td></td><td>Costa, H. S., &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2004 &lt;sup&gt;22&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;pilG&lt;/em&gt; deletion mutant &lt;em&gt;Xf&amp;Delta;pliG&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Shi, X. Y., &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2007 &lt;sup&gt;26&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;pilG&lt;/em&gt; complementary strain &lt;em&gt;Xf&amp;Delta;pliG&lt;/em&gt;-C&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Davis, M. J., &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 1998 &lt;sup&gt;23&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Physical materials and equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable inoculating loops</td><td>VWR international, Radnor, PA</td><td>#22-363-607</td><td>quantitative procedures such as bacterial collection</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>#0002709226</td><td>Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits</td></tr><tr><td>AmScope MD2000 digital camera</td><td>AmScope, Irvine, CA</td><td>SE305R-AZ-E</td><td>Image, video recording and measurement&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tubes line</td><td>Edgewood, NY</td><td>#T4300</td><td>Connected to the syringe and microfluidic chamber</td></tr><tr><td>Plastic luer connectors</td><td>Edgewood, NY</td><td></td><td>Connected to the syringe and microfluidic chamber</td></tr><tr><td>Syringe pumps</td><td>Pico Plus, Harvard Apparatus, MA</td><td>#702209</td><td>The flow rate can be adjusted while the pump is running.</td></tr><tr><td>Syringes</td><td>Gastight, Hemilton Company, Reno, NV</td><td>#1005</td><td>Provide the flowing broth</td></tr><tr><td>Inverted Olympus IMT-2 microscope</td><td>Olympus</td><td>IMT-2 FLuoro PHase</td><td>Image observation and recording</td></tr><tr><td>SPOT-RT digital camera</td><td>Diagnostic Instruments, Inc., MI</td><td>RT230</td><td>Image, video recording and measurement</td></tr><tr><td>Microscope Shutter</td><td>The &lt;em&gt;UNIBLITZ, US&lt;/em&gt;</td><td>#LS2T2</td><td>Control camera&amp;rsquo;s exposure time</td></tr><tr><td>Microscope Shutter Control system</td><td>The &lt;em&gt;UNIBLITZ, US&lt;/em&gt;</td><td>VCM-D1</td><td>VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver</td></tr><tr><td>MetaMorph Image software</td><td>Universal Imaging Corp., PA</td><td></td><td>Real-time super-resolution image processing&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

visualization of twitching motility and characterization of the role of the pilg in xylella fastidiosa

Fastidiosa Xylella הוא חיידק שאינו והולקה בשוט גראם שלילי הגורם למספר מחלות חשיבות הכלכלית של צמחים. תנועתיות מתעוות מספקות X. fastidiosa אמצעי לתנועת תוך צמח למרחקים ארוכים והתנחלות, תורם כלפי פתוגניות ב X. fastidiosa. תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa מופעל על ידי פילי מסוג IV. סוג IV פילים של fastidiosa Xylella מוסדרים pilG, רגולטור chemotaxis בחלבוני קידוד אופרון Pil-CHP כי הם מעורבים עם מסלולי העברת אותות. כדי להבהיר את התפקידים של pilG ב תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa, pilG -deficient מוטציה XF ΔpilG ומתח המשלים XfΔpilG- C המכיל יליד pilG פותחו. תאי microfluidic משולבים עם מערכת הקלטת הזמן לשגות תמונה שמשו לראות את התנועה מרטטת XfΔpאילג, XfΔpilG- C ומתח סוג הבר שלה. באמצעות מערכת הקלטה זו, הוא מתיר תצפיות במרחב ובזמן ארוך טווח של צבירה, הגירה של תאים בודדים ואוכלוסיות של חיידקים באמצעות תנועתיות מתעוות. X. סוג בר fastidiosa ו XfΔpilG- C זן משלימים הראה המאפיינים תנועתיות מתעוות טיפוסי לצפות ישירות בתאי זרימה microfluidic, בעוד מוטציה XfΔpliG הציג את הפנוטיפ לקוי מתעוות. מחקר זה מוכיח כי pilG תורמת תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa. תא הזרימה microfluidic משמש כאמצעי להתבוננות תנועתיות מתעוות.

הנוכחות של מיעוט המושבה היקפי מעיד על תנועתיות מתעוות סוג IV בתיווך pilus, נצפתה במושבות של X. סוג בר fastidiosa ומתח XF ΔpliG -C משלים (איור 1). Mutant XfΔpliG, לעומת זאת, לא להפגין שוליים סביב בפריפריה של מושבות (איור 1). זמן לשגו...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa at JoVE.com

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

במחקר זה, תא זרימת ננו-microfluidic הועסק לדמיין והן מבחינה תפקודית לאפיין את תנועתיות והמרטיטה של Xylella fastidiosa, חיידק הגורם למחלה של פירס גפן.

ויזואליזציה של תנועתיות מפרכסים אפיון תפקידו של<em&gt; PilG</em&gt; ב<em&gt; Fastidiosa Xylella</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

visualization-twitching-motility-characterization-role-pilg-xylella

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

10.7K Views.  University of California, Davis.  במחקר זה, תא זרימת ננו-microfluidic הועסק לדמיין והן מבחינה תפקודית לאפיין את תנועתיות והמרטיטה של Xylella fastidiosa, חיידק הגורם למחלה של פירס גפן. 

Video: Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Biochemistry

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Developmental Biology

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of signals to create complex, dynamic patterns as a response to environmental cues. These patterns are self-organizing and emergent; they cannot be predicted by observing the behavior of the individual cells. Using a time-lapse microcinematography tracking assay, we identified a distinct emergent pattern in M. xanthus called chemotaxis, defined as the directed movement of a swarm up a nutrient gradient toward its source 1.
In order to efficiently characterize chemotaxis via time-lapse microcinematography, we developed a highly modifiable plate complex (Figure 1) and constructed a cluster of 8 microscopes (Figure 2), each capable of capturing time-lapse videos. The assay is rigorous enough to allow consistent replication of quantifiable data, and the resulting videos allow us to observe and track subtle changes in swarm behavior. Once captured, the videos are transferred to an analysis/storage computer with enough memory to process and store thousands of videos. The flexibility of this setup has proven useful to several members of the M. xanthus community.

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

To study Myxococcus xanthus swarm behavior, we have designed a time-lapse microcinematography protocol that can be modified for different assays. It employs standard growth conditions adapted for microscopy, and yields reproducible results by the use of inexpensive, reusable silicone gaskets. We have used this method to quantify multicellular chemotaxis.

הקלטה התנהגות תאיים ב Myxococcus xanthus Biofilms באמצעות זמן לשגות Microcinematography

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

Biology

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

גישה חצי כמותי להערכת גיבוש biofilm באמצעות פיתוח המושבה מקומט

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

הכנה, הדמיה, וכימות של מבחני תנועתיות Surface בקטריאלי

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

ויזואליזציה של תנועתיות מפרכסים אפיון תפקידו של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video