עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM118085 ובחלקו על ידי קרן רוברט וולש (מענק F-1811 ל- R.M.H.).

1. בידוד מוטציות מדכאות בזנים חסרי תנועתיות
הערה: השתמש בשיטה זו כ'מלכוד הכל ' רחב כדי לזהות את האופי הכללי של פגם תנועתיות.
<ol><li>הכנת צלחת אגר רכה הערה: רך אגר, המכונה גם תנועתיות - או לשחות אגר, הוא אגר אחוז נמוך (~ 0.2-0.35% w / v), ארוך המשמש כדי assay chemotaxis31,32.<ol>
<li>יש להוסיף 3 גרם של bacto-agar (0.3% w/v) ו-20 גרם של LB לבקבוקון תחתון עגול בנפח 2 ליטר. מוסיפים לבקבוקית 1 ליטר של ddH2O (מים מזוקקים כפולים) ומערבבים באופן שווה את המתלים באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית.</li>
		<li>כלave אוטומטית במשך 20 דקות ב 121 °C (70 °F).</li>
		<li>אפשר להתקרר עם עצבנות עדינה באמצעות המוט / צלחת כמו לעיל. כאשר הטמפרטורה מגיעה כ 50 °C (50 °F), לשפוך 25 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות (100 מ"מ x 15 מ"מ), ולאפשר אגר מותך להגדיר עם מכסה במקום לפחות 1 שעה, לשימוש בתוך 16 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תרבות, חיסון ובידוד של מוטנטים מדכאים הערה: E. coli מחוסן במרכז של מדיה עשירה בחומרים מזינים מוצק עם אגר רך לצרוך חומרים מזינים באופן מקומי, יצירת שיפוע מתזונה שהם עוקבים. כשהם נעים החוצה, מופיעות 'טבעות' מוגדרות (איור 1A), הקשורות לכימותרפיה ספציפית שהחיידקים מגיבים לה. פגמים במערכת chemotaxis או רכיבים מבניים של מנוע flagella יכול לסכן את הביצועים ב- assay זה. לעתים קרובות, מוטנטים עם יתרון תנועתיות מתעוררים במהלך ההקרנה, וניתן לראות אותם מגיחים מנקודות בודדות או ממספר נקודות לאורך הפריפריה של הטבעת, משם הם "מתלקחים" החוצה (איור 1C). ישימו לב שהקצה החיצוני ביותר של חזית השחייה מנוגד בקלות לאגר הבתולה הרכה הלא מכובסת.<ol>
<li>לגדל תרביות לילה של זן תנועתיות-לקוי הרצוי ב 5 מ"ל של מרק לנוקס (LB; 10 גרם / L טריפטון, 5 גרם / L תמצית שמרים, ו 5 g / L NaCl, שולחן חומרים) ב 30 °C עם רעד אופקי (220 r.p.m.). למחרת, תת-תרבות (1:100 דילול) ב- LB טרי, גדל באותם תנאים לשלב מעריכי (OD600 של 0.6).</li>
		<li>לחסן 6 μL של התרבות למרכז צלחת אגר רך (1.1) באמצעות pipette, דוחף את הקצה סטרילי טעון לתוך אגר לגרש בעדינות את התוכן. מעבירים ל-30 מעלות צלזיוס ודגרה (איור 1B),עד ל ניכרים "התלקחויות" תנועתיות, הנובעות מנקודת החיסון או מהפריפריה של טבעות תנועתיות, בדרך כלל ב-24-36 שעות(איור 1C). הערה: בבוחות תנועתיות, לחסן זן מסוג פראי לצד המבודדים המוטנטיים לשם השוואה. זן בר זה יציג את הטבעות הכימיות הקונצנטריות האופייניות (איור 1A) וימלא את הצלחת בתוך 8-10 שעות.</li>
		<li>השתמש בלולאת תיל סטרילית כדי להרים את התאים מאזור 'התלקחות' ולפגוע כדי לטהר מושבות בודדות על צלחת אגר קשה LB (LB מוכן כנ"ל, מגובש עם 15 גרם / L bacto-אגר).</li>
		<li>בחרו מושבות בודדות מצלחת הפס באמצעות לולאת תיל סטרילית וטוהרו מחדש על ידי פסים למושבות בודדות כדי להבטיח בידוד של מבודד מושבה 'טהורה'.</li>
	</ol></li>
	<li>אישור, ואפיון של מוטציות מדכאות
	<ol>
<li>אשר שהמוטנטים המבודדים החזירו את תנועתיותם. הכן לוחות אגר רכים (1.1), ותרבויות לזנים מעניינים (כמו ב-1.2.1), כולל סוג פראי ומתח 'חסר תנועתיות' התחלתי להשוואה.</li>
		<li>לחסן את הצלחות (כמו 1.2.2) ודגור ב 30 °C (8-10 שעות.</li>
		<li>להקליט את הקוטר של הטבעת החיצונית ביותר (קצה המעגל) ולהשוות כדי לקבוע מי של מבודדים יש תנועתיות משוחזרת באופן משמעותי. הערה: מומלץ לצלם צלחות לאורך כל מהלך הניסוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בהתקן "דלי של אור"30, שבו מצלמה דיגיטלית מותקנת מעל מקור אור להארה טובה יותר כדי למדוד את הקוטר של מושבת השחייה ולהבדיל אותו אגר לא קוטבי.</li>
		<li>הנבדק אומת מבודד ל- WGS כנדרש, ומאפשר 'כיסוי רצף' מספיק כדי לזהות באופן חיובי את המוטציות ששיקמו פונקציה מסוג בר.</li>
	</ol></li>
</ol>2. כימות התנהגות מוטורית פלאגלה באמצעות קשירת תאים
הערה: השתמש בשיטה זו כאשר נראה שהתנהגות רגילה של ריצה-נופלת (chemotaxis) נפגעת.
<ol><li>
הכנת תרבות וגזלת דגלה
	<ol>
<li>הכן תרבות שלב מעריכית של זן העניין כמתואר בשלב 1.2.1.</li>
		<li>פלט 10 מ"ל של תאים לפי צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 3 דקות לפני הוצאה חוזרת ב 10 מ"ל של מאגר תנועתיות מעוקר מסנן (MB; 10 mM אשלגן פוספט חוצץ [0.0935 M K2HPO4, 0.0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). הערה: MB תומך תנועתיות, אבל אינו תומך בצמיחה חיידקית</li>
		<li>חזור על שלב 2.1.2 פעמיים נוספות לפני ususpending הכדור הסופי ב 1 מ"ל של MB.</li>
		<li>מעבירים את ההשעיה של התא למזרק של 1 מ"ל ומצמידים מחט 23G לסוף. להרכיב מזרק זהה / מחט מנגנון ולחבר את השניים יחד באמצעות 6 אינץ 'של צינורות פוליאתילן (קוטר פנימי של 0.58 מ"מ) נדן בחוזקה על כל קצה מחט.</li>
		<li>גנו את הדגלה (הם שבירים ונשברים בקלות) על ידי העברת מתלה התא בעדינות הלוך ושוב ממזרק אחד לשני 50x, עם הפסקות של דקה אחת בין כל 10 מעברים.</li>
		<li>צנטריפוגה התאים הגוזלים ב 2,000 x g במשך 3 דקות resuspend בנפח סופי של 500 μL של MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת שקופיות וקשירת תאים
	<ol>
<li>הכן תא קיבוע תאים על-ידי ערימת כיסוי 18 מ"מ x 18 מ"מ מעל שקופית מיקרוסקופ זכוכית בגודל 3 אינץ' x 1 אינץ' x 1 מ"מ, המופרדת באמצעות סרט דו-צדדי(איור S1).</li>
		<li>לשטוף את התא עם 0.01% (w/v) פתרון פולי-ליסין על ידי החלה על החלק העליון של התא. הטה את הקצה התחתון (כיסוי ריק עם שקופית המיקרוסקופ) על מגב משימות (נייר טישו) כדי לעזור לצייר פתרון דרך התא(איור S1). לאחר מכן לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
		<li>לשטוף את התא שלוש פעמים עם 40 μL של MB באמצעות כמתואר בשלב 2.2.2</li>
		<li>הוסף 40 μL של השעיית תא גיהון (מוכן לעיל) לחלק העליון של התא ודגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתחבר כיסוי.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות את התא עם 40 μL של MB כמו ב 2.2.3 כדי להסיר תאים לא מחוברים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הקלטה וכימות סיבוב תאים
	<ol>
<li>העבר את שקופית המיקרוסקופ העמוסה בתאים קשורים לשלב המיקרוסקופ.</li>
		<li>באמצעות מיקרוסקופיה משולבת פאזה ומטרה 100x, לסרוק את האוכלוסייה עבור תאים קבועים במקום, ומסתובב על ציר אחד, כלומר, סיבובים חלקים על נקודה קבועה במקום להציג בזווית שבה התא נע פנימה והחוצה של המוקד (וידאו 1).</li>
		<li>השתמש במיקרוסקופ מסחרי ובמצלמה משויכת. פתח את התוכנה המשויכת, ודא שתאי העניין נמצאים במוקד ולחץ על רכישת וידאו כדי להקליט את סיבוב התא למשך דקה אחת (ב- 10 פריימים לשנייה ומעלה).</li>
		<li>מהפעלת וידאו, לכמת את מספר הסיבובים המלאים לדקה ואת מספר הפעמים שהתא משנה כיוון (תדירות מיתוג). הערה: מהירויות סיבוב ותדירות מיתוג עשויות להיות מהירות מדי לאמוד אחר עין ולכן מומלץ להשתמש בתוכנת וידאו המציעה הפעלה איטית / עדינה, או מאמצת מערכת תוכנה אוטומטית לכימות דפוסי סיבוב33. חלופה תהיה להגדיל את הצמיגות של MB באמצעות תאית מתיל (או סוכן דומה) כדי לעזור להאט ולפתור את הסיבוב של חיידקים מהירים יותר או לפצות כאשר מצלמות עם קצבי מסגרת נמוכים נמצאים בשימוש.</li>
		<li>חזור על שלב 2.3.2 עם שכפולים ביולוגיים כדי להרכיב ייצוג של אוכלוסיית העניין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנת נחילים בבדיחת מעבר גבול
הערה: השתמש בשיטה זו להערכת ההשפעה של מוטציה או תנאי על תנועתיות קבוצתית. נחיל אגר מתייחס אגר שבו האחוז הוא בדרך כלל גבוה יותר מזה של אגר רך. באגר רך (0.3 %), תאים שוחים בנפרד בתוך אגר. באגר נחיל (0.5% ומעלה), התאים נעים כקבוצה על פני השטח. בעוד לוחות נחיל חייב לשמש כמפורט כאן, צלחות שחייה יש חיי מדף ארוכים יותר, והוא עשוי לשמש במשך כמה ימים. ההעדפה האישית שלנו היא להשתמש בעוד 1-2 ימים.
<ol><li>
הכנת אגר נחיל
	<ol>
<li>הוסף 5 גרם של אגר אייקן (0.5% w/v) ו-20 גרם של LB לבקבוקון תחתון עגול של 2 ליטר. מוסיפים 1 ליטר של ddH2O לבקבוק ומערבבים באופן שווה את המתלים באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית.</li>
		<li>כלave אוטומטית במשך 20 דקות ב 121 °C (70 °F).</li>
		<li>אפשר להתקרר עם עצבנות עדינה כדי למנוע בועות אוויר באמצעות המוט / צלחת כמו לעיל. כאשר כ 50 °C (50 °F), להוסיף גלוקוז מעוקר מסנן לריכוז סופי של 0.5 %.</li>
		<li>יוצקים 25 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות (100 מ"מ x 15 מ"מ) ומאפשרים להגדיר בטמפרטורת החדר לפחות 14 שעות ולא יותר מ 20 שעות. אין לאחסן לשימוש עתידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חיסון ודגורה של לוחות נחיל
	<ol>
<li>לחסן 6 μL של תרבות מעריכית בינונית (מוכן כמו 1.2) על ידי תצפית על גבי אגר.</li>
		<li>משאירים את המכסה למשך 5-10 דקות ומחליפים כאשר האינוקולום התייבש לתוך משטח אגר.</li>
		<li>דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך 8 שעות. הימנע הפיתוי לבדוק את התקדמות הנחיל על ידי הסרת המכסה, שכן זה יתרום לייבוש של אגר ולפגום נחילים. הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם פנוטיפ המתח. מוטציות מבודדות מסוימות עלולות לפגוע ביכולת הנחיל ויחייבו אחוז מופחת של אגר או תקופה ממושכת יותר של דגירה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת לוחות אסי של מעבר גבול הערה: בדיקת ישבן זו משתמשת בצלחת פטרי מותאמת, שבה חלוקת פלסטיק (גבול) יוצרת שני תאים, ולא אחד(איור 2A). כל תא יכול להיות מוכן ללא תלות בשני, ומציע תנאים שונים לנחיל, לפני "חיבור" בין השניים. בהתאם לתכנון ניסיוני, ניתן להכין את התא הראשון (המיועד משמאל) עם אגר שחייה (0.3% w/v) או אגר נחיל (0.5% w/v) שממנו החיידקים יכולים לנדוד מעבר לגבול לתא הימני המכיל אגר נחיל +/- כל תוספת או אתגר נדרשים (למשל, אנטיביוטיקה). נדידה על כל אגר נמדדת /בהשוואה בדרך כלל על ידי רישום הקוטר הרחב ביותר של קולוניזציה חיידקית (מקצה לקצה) מנקודת החיסון המקורית.<ol>
<li>הכן אגר שחייה כמתואר ב-1.1 במידת הצורך.</li>
		<li>הכן אגר נחיל כמתואר ב 3.1.</li>
		<li>יוצקים ~ 30 מ"ל של אגר נחיל (עם תוספי הרצוי במידת הצורך) לתא הימני של צלחת פטרי כפולה (100 מ"מ x 15 מ"מ), עד לנקודה שבה הוא מאוזן עם מחיצת הפלסטיק בין התאים, אך לא עולה על גדותיו לשמאל(איור 2B).</li>
		<li>לאחר שהאגאר התקשה, מלאו את התא השמאלי ב-30 מ"ל של שחייה או אגר נחיל, שוב עד כדי מגע עם חלוקת הפלסטיק(איור 2C). לפני שהוא קובע, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לגרור בעדינות את הגר מעבר לגבול כדי לחבר את שני הצדדים עם גשר אגר בגובה ~ 1 מ"מ המשתרע על כל אורך החלוקה (איור 2D).</li>
		<li>אפשר לצלחת להתייבש בטמפרטורת החדר (3.1). הערה: שיטה חלופית ליצירת גשר היא לאפשר אגר התא השמאלי להתייבש ולאחר מכן לאט pipette ~ 100 μL של אגר נחיל מותך לאורך מחיצת הפלסטיק לגשר בין שני התאים (3.4). לחסן את הצלחות על התא השמאלי כמפורט לעיל לשחייה (1.2.2) או נחיל (3.2) אגר, לפני הדגירה ב 30 °C (12-16 שעות), או עד נחילים עשו התקדמות מספקת מעל התא הימני כדי לאפשר השוואות בין זנים של עניין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הבידוד והאפיון של מוטציות מדכאות תרמו בהצלחה לזיהוי מרכיבים מרכזיים של מערכת הכימוטקסי35,36,37, כמו גם את המכונות המוטוריות עצמן38,39,40. בעת השימוש בפרוטוקול 1, חשוב לכלול שכפולים עצמאיים מרו?...

חיידקים מעסיקים נספחים רבים לתנועה ופיזור בנישות האקולוגיות שלהם1. תנועתיות המונעת על ידי פלאגלה היא המהירה שבהן, מקדמת קולוניזציה של אזורים נוחים בתגובה לאותות סביבתיים, ותורמת באופן משמעותי ליכולת הפתוגנית של מינים מסוימים2,3. חיידקים מוכים יכולים לשחות בנפרד בנוזל בתפזורת, או נוהרים כקולקטיב על פני משטח חצי מוצק4. פלאגלה חוץ-תאית מתחברת ומונעת על ידי מנועים סיבוביים המוטמעים בממברנה, אשר רותמים את העוצמה של שיפועי יונים כדי ליצור מומנט שגורם לסיבוב1,2,4,5,6,7,8. ב- E. coli, שהמנועים שלו פועלים על מומנט קבוע9, ניתן לסווג את פלט המנוע במונחים של מהירות סיבובית ומיתוג הרוטור בין כיווני נגד כיוון השעון (CCW) ובכיוון השעון (CW). סיבוב CCW מקדם היווצרות של חבילת flagellar קוהרנטית המניעה את התא קדימה (ריצה), בעוד מתג ארעי בכיוון הסיבוב (CW) גורם לחבילה להתפרק באופן חלקי או מלא10, והתא כדי לכוון מחדש את כיוון השחייה שלו (ליפול). אי קולי בדרך כלל לרוץ לשנייה ליפול במשך עשירית שנייה. תדירות המיתוג של הרוטור או 'הטיית הנפילה' נשלטת על ידי מערכת איתות chemotaxis, שבה chemoreceptors transmembrane לזהות אותות כימיים חיצוניים ולהעביר אותם באמצעות זרחן למנוע flagellar להאריך ריצות בתגובה למשוך, או לדכא אותם בתגובה כימיקלים רעילים11,12. תנועתיות השחייה נמדת ב-0.3% אגר רך.
במהלך ההמולה, חיידקים מנווטים על משטח מוצק למחצה כקולקטיב צפוף, שבו חבילות של חיידקים זורמות בתנועה מסתחררת רציפה2,13,14,15. נחילי E. coli מציגים פיזיולוגיה כימוסנסורית שונה (הטיית טבילה נמוכה יותר), מהירויות גבוהות יותר, וסובלנות גבוהה יותר לאנטי מיקרוביאלים מעל תאים שוחים בנוזל בתפזורת16,17. נחילים משתנים בפריסתם של שפע של אסטרטגיות המסייעות לתנועה, כולל ייצור פעילי שטח, היפרפלציה, והארכות תאים2. נחיל מציע חיידקים יתרון תחרותי הן מבחינה אקולוגית והן בסביבה קלינית18,19,20. ישנן שתי קטגוריות של חיידקים נוהרים: נחילים ממוזגים, אשר יכול לנחיל רק על מדיה מוצק עם 0.5-0.8% אגר, ונחילים חזקים, אשר יכול לנווט על פני ריכוזי אגר גבוהיםיותר 21.
קיימים מגוון של חקירות כדי לחקור תנועתיות שחייה והרגולציה שלה. כאשר הוא נפגע ממוטציות או מתנאים סביבתיים, תנועתיות עצמה מציעה מבחר חזק לזיהוי מוטציות מדכאות רווח-של-פונקציה. מדכאים אלה יכולים להיות חוזרים מקוריים של המוטציה המקורית, או חוזרים מדומים, שבהם מוטציה שנייה משחזרת את הפונקציונליות. מוטציות כאלה ניתן לזהות על ידי ריצוף גנום שלם (WGS). חלופה לבחירת מדכאים משוחדים היא אסטרטגיית מוטה של מוטגנסיס ממוקדת (למשל, מוטאגנסיס PCR). מתודולוגיות אלה שופכות לעתים קרובות אור על התפקוד או הרגולציה הסביבתית של מנגנון תנועתיות. אם המטרה היא ללמוד פונקציה מוטורית, אז שיקום תנועתיות מסוג פראי כפי שנמדד אגר רך לא בהכרח להצביע על שיקום של תפוקת מנוע מסוג בר. הבדיקה הקשורה לתא, שבה תאים מחוברים למשטח זכוכית על ידי flagellum יחיד וסיבוב של גוף התא מנוטר לאחר מכן, יכול להיות הבדיקה הראשונית של בחירה להערכת התנהגות מוטורית. למרות מתודולוגיות מתוחכמות יותר זמינים כעת כדי לפקח על תכונות מנוע, הגדרת המצלמה במהירות גבוהה הנדרשת ויישום של חבילות תוכנה לניתוח תנועה להגביל את השימוש הנרחב שלהם22,23,24,25. ההסרה הקשורה לתא דורשת רק להטות את הדגלה, ומאפשרת חיבור של הסיבים הקצרים למגלשת זכוכית, ואחריה צילום סיבוב גוף התא. למרות שמהירויות המנוע המתועדות נמוכות במיון זה בגלל העומס הגבוה שגוף התא מפעיל על הפלסטלום, ניסיון זה בכל זאת תרם לתובנות יקרות ערך על תגובות כימיות26,27,28,29, ונשאר כלי חקירה תקף כפי שנדון להלן.
תנועתיות נוהרת מציבה בפני החוקרים מערכת אתגרים שונה. מבחר מדכאי ההשגה עובד רק בנחילים המייצרים פעילי שטח בשפע ונוהרים בקלות13. פעילי שטח שאינם מפיקים כגון E. coli הם בררניים ביחס לבחירה של אגר, הרכב מדיה ולחות שלהסביבה 2,13,14,21. לאחר קביעת תנאי ההמולה, חוצה הגבול17 הוא מתודולוגיה שימושית לחקור את היכולת של נחיל לנווט בתנאים חדשים / קשים. למרות הפרוטוקולים המוצגים להלן מתייחסים E. coli, הם יכולים להיות מותאמים בקלות ליישום במינים אחרים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

תנועתיות חיונית להישרדותם ולהצלחתם של מינים חיידקיים רבים. מתודולוגיות רבות קיימות כדי לנצל תנועתיות כדי להבין נתיבי איתות, כדי לבהיר את הפונקציה וההרכבה של חלקים flagellar, ולבחון ולהבין דפוסי תנועה. כאן אנו מדגימים שילוב של שלוש מתודולוגיות אלה. תנועתיות בגר רך היא העתיקה ביותר, המציעה מבחר חזק לבידוד מוטציות מדכאות רווח-של-תפקוד בזנים לקויי תנועתיות, שם תנועתיות משוחזרת באמצעות מוטציה שנייה. טכניקת קשירת התא, המשמשת תחילה כדי להדגים את האופי הסיבובי של המנוע flagellar, ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעה של משפיעי איתות על מהירות המנוע ואת יכולתה לעבור כיוון סיבובי. בדיקת "מעבר הגבול" היא עדכנית יותר, שבה חיידקי שחייה יכולים להיות מוכנים לעבור לנוע באופן קולקטיבי כנחיל. בשילוב, פרוטוקולים אלה מייצגים גישה שיטתית ועוצמתית לזיהוי רכיבים של מכונות תנועתיות, ולאפיון תפקידם בהיבטים שונים של שחייה ונחילה. הם יכולים להיות מותאמים בקלות כדי ללמוד תנועתיות במינים חיידקיים אחרים.

הבידוד של פסאודו-חוזרים בזן E. coli אשר תנועתיות נפגעת על ידי רמות גבוהות של מולקולת האיתות c-di-GMP, פורט בעבודה האחרונה מהמעבדה שלנו34. זן זה (JP1442) טפח שתי מוטציות: ΔyhjH ו ΔycgR. YhjH הוא הזרחן הפעיל ביותר שמשפיל את C-di-GMP ב- E. coli. היעדר YhjH מוביל רמות גבוהות c-di-GMP ועיכוב תנוע...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K Views.  The University of Texas at Austin. חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

Video: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

כימות תנועתיות נחיל משטח חיידקי על לוחות הדרגתיים ממריץ

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Biochemistry

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

ויזואליזציה של תנועתיות מפרכסים אפיון תפקידו של<em&gt; PilG</em&gt; ב<em&gt; Fastidiosa Xylella</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Immunology and Infection

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

אנליזה של מולקולה בודדת של מנועי משפחת קינסין-3 מטוהרים מסוג Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Bioengineering

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

הכנה, הדמיה, וכימות של מבחני תנועתיות Surface בקטריאלי

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

המחשת תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...