We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).

1. רקמות קציר והקפאת רקמות שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם מנת יתר של isoflurane (2-כלורו-2- (difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-אתאן). לבצע שלב זה במנדף ולהשתמש בשיטת בלימה משנית כגון ייבוש או צנצנת פעמון המכילה מקלון צמר גפן הטבול בisoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר מוות על ידי תקיפות לוחצים שודד דרכים. להשתמש בשיטה משנית של המתת חסד כגון נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את הפרווה עם אלכוהול 70% כדי לצמצם את דבק של קווצות שיער רופפות על השרירים. לקלף את העור מהאיבר באמצעות מלקחיים עדינים כגון מס &#39;5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפריד את השריר של עניין (tibialis קדמי (ת&quot;א) במקרה זה) מהעצמות מתחת, החל מהגיד ולהסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו השריר, לכסות אותו באוקטובר (מתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך), ולהניח אותה שטוח על תבנית הקפאה חד פעמית שכותרת. ודא שהשרירים הוא בה נטייה פיזיולוגית נורמלית (ועד ראש טאייב) ללא מתיחה. לחלופין, להקפיא את השריר על ריבועי קלקר קטנים ולהצמיד אותו באמצעות סיכות חרקים כדי להבטיח את האורך הנכון של השרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל 2-methylbutane (איזופנטאן) בכוס פלדה באמצעות חנקן נוזלי. זה לוקח על 3 ממוצעת - 5 דקות. שמור ערבוב לסירוגין עד משקעים לבנים מתחילים טופס בתחתית והקירות של הכוס. הערה: כאשר זה קורה, הגיע איזופנטאן טמפרטורת הקפאה אופטימלית (-150 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את התבניות המכילות שרירים ב2-methylbutane המצונן. להקפיא את השרירים קטנים כגון longus digitorum הסרעפת והפושטים (אדי) במשך 6 - 12 שניות ושרירים גדולים יותר כמו soleus הגסטרוקנמיוס (GS) והיד אחורית במשך 15 - 20 שניות. אין להקפיא את השרירים במשך זמן רב מדי שכן הדבר עלול להוביל לפיצוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרקמות הקפואות בקרח יבש וללתת להתאדות איזופנטאן (שים לב שתהליך זה לוקח בממוצע כ -15 - 20 דקות). לעטוף את הרקמות ברדיד אלומיניום ולאחסן אותם בuטמפרטורת ltra נמוכה (C -70 ° C עד -80 °) עד חתך. </li></ol> 2. Embedding הרקמות ב אוקטובר להכין בלוק רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות תחבורה על קרח יבש לcyrostat כדי למנוע הפשרה. העברת רקמות לcryostat קאמרית (שנקבע ב -20 ל-24 מעלות צלזיוס, כדי למנוע הפשרה מלאה של רקמות) ולתת להם לאזן במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מפרץ פלטייה קירור ב. אם cryostat אין קירור זה, להשתמש בתרסיס קירור תרסיס להקפיא במהירות OCT. אל תתנו להפשרת שרירים בכל נקודה במהלך ההטבעה כמו זה יכול לגרום לנזק הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שכבה דקה אחידה של אוקטובר בדיסק הדגימה ולתת לו מגניב. כאשר רוב OCT קפוא בתחתית ועדיין נוזליים על גבי, הכנס את הרקמה בכיוון הנכון (בניצב לאוקטובר לסעיפים ומקביל רוחביים לאוקטובר לסעיפים אורך). להשתמש בתרסיס קירור תרסיס להקפיא במהירות אוקטובר לגעת בחלק unembeded של הרקמות עם שלוחה חוםractor ולחכות 45 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עוד שכבה דקה של אוקטובר סביב השריר, לרסס עם תרסיס קירור תרסיסים ולחלץ את החום כמו בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על הוספת אוקטובר במרווחים קטנים ובמהירות להקפיא ב- OCT באמצעות שילוב של תרסיס ספריי קירור וחולץ חום עד שכל השריר מכוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חולץ החום בחלק העליון של בלוק הרקמה ולחכות 5 דקות. </li></ol> 3. הכנת סעיפים וזיהוי הסעיפים מאזור אמצע בטן של השרירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הדגימה על ראש הדגימה. הדק את הידית כדי לאבטח את הדיסק. ודא שהדיסק הדגימה הוא במגע טוב עם ראש הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את טמפרטורת החדר לבין -21 ו-24 מעלות צלזיוס ולחכות עד שטמפרטורת הסט מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות העובי (7 מיקרומטר); חתוך את הבלוק על ידי קידום או חוזרים בי לחסום באמצעות הגדרות גסות ועדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החלקיםבטרום חימם שקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובי על ידי לחיצה על גבי השקופית על הסעיפים, באמצעות המשיכה בין מטענים המנוגדים כדי להקל על הדבקות של החלקים לחתוך לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את החלקים באמצע הבטן-ידי מדידת שטח חתך (CSA) של החלקים. האם תוכנת הדמיה באמצעות זה במחשב שמחובר למיקרוסקופ. הערה: תמונות בניגוד השלב נלקחות והיקף של כל השריר נמדד באמצעות פונקצית מעקב על התוכנה. זו תניב שני CSA כמו גם קוטר חמוס מינימום (מדד לגודל חתך סיבים שמתבטא במרחק הקטן ביותר בין שני משיקים מקבילים בצדדים מנוגדים של חלקיק) מדידות. הערה: כאשר מדידות CSA וקוטר חמוס מינימום מתחילות רמה, כבר הגיעה באמצע הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאי וארכיון השקופיות ב -80 ° C לצביעת עתיד. הערה: Oct לא צריך להסיר לפני staininנהלי g. ברגע שקופיות coverslipped, הם מוכנים להיות מוכתמים באופן מיידי. </li></ol> 4. מכתים הערה: בעוד שניתן למצוא נהלי צעד-אחר-צעד מפורטים בגיליון הנתונים של המוצר וצריך להיות בעקבות הליכים מכתים, ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה אישי להשיג צביעה אופטימלית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל ההרכבה תקשורת (ראה טבלה) היא לא בליל עם מים, מייבשים שקופיות באמצעות ציונים גוברים של אלכוהול (2 דקות כל אחד ב -70%, 95%, ו 100% אתנול) ולנקות אותם עם קסילן (5 דקות) 100% על מנת להבטיח מגלשות לא להיות אטומות לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip סעיפים ולתת להם להתייבש. תמונה עם מיקרוסקופ מצויד בתוכנת הדמיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies.">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li><li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica.">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li><li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+dystrophy.+I.+History,+clinical+status,+muscle+strength,+and+biopsy+findings.">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li><li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy.">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li><li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine.">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li><li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles.">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779 (2012).</li><li>Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy.">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li><li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice,+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li><li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy.">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14 (2014).</li><li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis:+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A.">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li><li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy.">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+fixation.">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li><li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections.">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+'gold+standard'+for+immunohistochemistry.">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li><li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia.">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה שימשו ככלים מרכזיים בהבנת הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה בהפרעות עצבית-שרירית שונות. קלסי, ביופסיות שריר היו קבועות ראשונה בפורמלין ולאחר מכן משובצות בשעוות פרפין. בעוד קיבעון פורמלדהיד שומר ארכיטקטורת רקמה ומאפשר אחסון והובלת רקמה ב RT,...

בדיקה של היסטולוגיה השריר משחקת תפקיד קריטי בהבנת סוגים שונים של הפרעות עצבית-שרירית של 1-4. בשילוב עם טכניקות אחרות, זה מאפשר לחוקרים לקבל מושג טוב יותר של הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה וגם יכולים להיות חיוני כדי להעריך את היעילות של התערבות טיפולית 5-10. עם זאת, כדי להיות מדויק, הרקמות צריכה להישמר בצורה הנכונה על מנת לשמר את המצב הפיזיולוגי מייד לפני הכריתה. זה דורש זהירות רבה במהלך ההסרה, שימור, חתך, וצביעה. ניתן להכין רקמות בשתי דרכים שונות למחקר מיקרוסקופי אור. השיטה, פרפין פורמלין הקבוע הראשון משובץ קטעים (FFPE), דורש רקמות להיות קבועים בפורמלין שנאגרו טבעי 10% לפני שמוטבעים בשעוות פרפין 11,12. צעד הקיבעון עוזר לשמר מורפולוגיה טובה יותר, אבל יחסי ציבור אנדוגני קישורים גם צולביםoteins לפיכך מחייב נהלים אחזור אנטיגן המורכב עבור immunostaining ומבטל את האפשרות של מכתים האנזימטית בסעיפים כגון 12. חלקים קפואים, לעומת זאת, לא צריכים להיות מראש קבועים או מעובד; לכן, חלבונים יכולים לשמור תצורות ביולוגיות יליד 13,14. יתר על כן, חלקים קפואים גם לאפשר לזמן אספקה ​​מהיר, שלעתים יש צורך, למשל באבחון תוך הניתוחי של סרקומות וביופסיות כירורגיות אחרות 15. עם זאת, אם לא נעשה כראוי, בשיטה זו היא נוטה להקפיא נזק, אשר מציג שינויים בארכיטקטורת שרירים מה שהופכים את החלקים שאינם ראויים לבדיקה היסטולוגית. מאמר זה מתאר את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר על מנת להשיג צביעה אופטימלית לבדיקה נאותה.

<table><tbody><tr><td>Cryostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123&lt;br /&gt;Alternative: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500&lt;br /&gt;Alternative: Olympus</td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Nikon Imaging Software Basic Research</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500&lt;br /&gt;Alternatives: Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.</td></tr><tr><td>OCT</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Disposable tissue mold</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus slides</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis

הערכה היסטולוגית של ביופסיות שריר שימשה ככלי הכרחי בהבנה של ההתפתחות וההתקדמות של הפתולוגיה של הפרעות עצבית-שרירית. עם זאת, על מנת לעשות זאת, טיפול נכון צריך לקחת כאשר מוציא ושימור רקמות להשיג צביעה אופטימלית. אחת שיטות לשימור רקמות כרוכה תיקון רקמות בפורמלין ולאחר מכן הטבעתם בשעוות פרפין. שיטה זו שומרת מורפולוגיה היטב ומאפשרת לאחסון לטווח ארוך ב RT, אבל הוא מסורבל ודורשת טיפול בכימיקלים רעילים. יתר על כן, תוצאות קיבעון פורמלדהיד בקישור צולב אנטיגן, אשר מחייב פרוטוקולים אחזור אנטיגן לimmunostaining היעיל. להיפך, חתך קפוא אינו דורש קיבוע ובכך שומר על קונפורמציה אנטיגן ביולוגית. שיטה זו גם מספקת יתרון בולט בסיבוב מהיר סביב זמן, מה שהופך אותו לשימושי במיוחד במצבי צורך הערכה היסטולוגית מהירה כמו intraoperative ביופסיות כירורגיות. כאן אנו מתארים את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר להדמיה עם כתמים היסטולוגית וחיסוניים שונים.

ההגדרה לקציר והקפאת רקמות שניתן לראות באיור 1. רקמות נכרת צריכה להיות מאוחסנות בגזה טבולה בPBS להימנע (איור 1 א) ייבוש. כאשר רקמות נבחרו לשמש לניתוח היסטולוגית הם צריכים להיות טבולים בOCT ומונחים על תבנית cryo בכיוון הנכון וקרוב לאורך פיסיולוגי ככל האפשר ...

Watch this Scientific Journal Video about Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis at JoVE.com

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

עשה ואל תעשה בהכנת השריר cryosections לניתוח היסטולוגית

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

31.8K Views.  Boston University. Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Video: Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Developmental Biology

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures for rat laryngeal dissection, flash-freezing, and cryosectioning of the vocal folds. This study describes how to cryosection vocal folds in both longitudinal and cross-sectional planes. A novelty of this protocol is the laryngeal tracking during cryosectioning that ensures accurate identification of the intrinsic laryngeal muscles and reduces the chance of tissue loss. Figures demonstrate the progressive cryosectioning in both planes. Twenty-nine rat hemi-larynges were cryosectioned and tracked from the emergence of the thyroid cartilage to the appearance of the first section that included the full vocal fold. The full vocal fold was visualized for all animals in both planes. There was high variability in the distance from the appearance of the thyroid cartilage to the appearance of the full vocal fold in both planes. Weight was not correlated to depth of laryngeal landmarks, suggesting individual variability and other factors related to tissue preparation may be responsible for the high variability in the appearance of landmarks during sectioning. This study details a methodology and presents morphological data for preparing the rat vocal fold for histochemical neuromuscular investigation. Due to high individual variability, laryngeal landmarks should be closely tracked during cryosectioning to prevent oversectioning tissue and tissue loss. The use of a consistent methodology, including adequate tissue preparation and awareness of landmarks within the rat larynx, will assist with consistent results across studies and aid new researchers interested in using the rat vocal fold as a model to investigate laryngeal neuromuscular mechanisms.

This protocol describes methods used to prepare rat vocal folds for histochemical neuromuscular study.

הכנת קפל קול חולדה עבור ניתוחים עצביים שריריים

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Neuroscience

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Biology

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative prognostic factor for several other disorders such as cardiovascular disease and cancer. Excessive lipid infiltration decreases muscle mass and strength. It also results in lipotoxicity and insulin resistance depending on total intramyocellular lipid content, lipid droplet (LD) morphology, and subcellular distribution. Fiber type (oxidative vs glycolytic) is also important, since oxidative fibers have a greater capacity to utilize lipids. Because of their crucial implications in pathophysiology, in-depth studies on LD dynamics and function in a fiber type-specific manner are warranted.
Herein, a complete protocol is presented for the quantification of intramyocellular lipid content and analysis of LD morphology and subcellular distribution in a fiber type-specific manner. To this end, serial muscle cryosections were stained with the fluorescent dye Bodipy and antibodies against myosin heavy chain isoforms. This protocol enables the simultaneous processing of different muscles, saving time and avoiding possible artifacts and, thanks to a personalized macro created in Fiji, the automatization of LD analysis is also possible.

Increasing evidence indicates that excessive infiltration of lipids inside skeletal muscle results in lipotoxicity and diabetes. Here, we present a complete protocol, including tissue processing, staining with Bodipy, image acquisition, and analysis, to quantify the size, density, and subcellular distribution of lipid droplets in a fiber-type specific manner.

סוג הסיבים וניתוח ספציפי תת-תאי של תכולת טיפות השומנים בשרירי השלד

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible cytoplasmic compartments. Another hurdle is the tight apposition of myofibers to the surrounding tissues. Because the process of tissue fixation and paraffin embedding leads to the shrinkage of muscle fibers, freezing is an optimal means of hardening muscle tissue for sectioning. However, a commonly encountered issue, the formation of ice crystals, occurs during the preparation of frozen sections because of the high water content of muscle. The protocol presented here first describes a simple and efficient method for properly freezing muscle tissues by immersing them in liquid nitrogen. The problem with using liquid nitrogen alone is that it causes the formation of a nitrogen gas barrier next to the tissue, which acts as an insulator and inhibits the cooling of the tissues. To avoid this "vapor blanket" effect, a new cryovial was designed to increase the speed of liquid flow around the tissue surface. This was achieved by punching a total of 14 inlet holes in the wall of the vial. According to bubble dynamics, a higher rate of liquid flow results in smaller bubbles and fewer chances to form a gas barrier. When liquid nitrogen flows into the cryovial through the inlet holes, the flow velocity around the tissue is fast enough to eliminate the gas barrier. Compared to the method of freezing muscle tissues using pre-chilled isopentane, this protocol is simpler and more efficient and can be used to freeze muscle in a throughput manner. Furthermore, this method is optimal for institutions that do not have access to isopentane, which is extremely flammable at room temperature.

This protocol describes a procedure to freeze muscle tissues by plunging them directly into liquid nitrogen. This protocol also highlights a new cryovial that can avoid the &#34;blanket effect&#34; of nitrogen gas when liquid nitrogen contacts the tissue surface of a specimen.

מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.