Name: capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy
Uploaded: 2015-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy at JoVE.com

We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense &#8211; USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.

<ol>
	<li>San Miguel-Ruiz, J. E., Garc&#237;a-Arrar&#225;s, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+cellular+events+occur+during+wound+healing+and+organ+regeneration+in+the+sea+cucumber+Holothuria+glaberrima.">Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima.</a> BMC Dev Biol. 7, 115 (2007).</li><li>Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+of+regeneration+in+zebrafish.">Tales of regeneration in zebrafish.</a> Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).</li><li>Akimenko, M. A., Mar&#237;-Beffa, M., Becerra, J., Old G&#233;raudie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools,+and+some+answers+to+the+mystery+of+fin+regeneration.">Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration.</a> Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).</li><li>Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+research+today.">Regeneration research today.</a> Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).</li><li>Seifert, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+shedding+and+tissue+regeneration+in+African+spiny+mice+(Acomys).">Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys).</a> Nature. 489, 561-565 (2012).</li><li>Goss, R. J., Grimes, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+downgrowths+in+regenerating+rabbit+ear+holes.">Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes.</a> J Morphol. 146, 533-542 (1975).</li><li>Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ear+tissue+regeneration+in+mammals.">Comparison of ear tissue regeneration in mammals.</a> J Anat. 149, 55-63 (1986).</li><li>Allan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+response+and+Msx1+expression+after+human+fetal+digit+tip+amputation+in+vitro.">Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro.</a> Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Dev Biol. 315, 125-135 (2008).</li><li>Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+regeneration+and+regenerative+medicine.">Mammalian regeneration and regenerative medicine.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+induction+of+four+msx+homeobox+genes+during+fin+development+and+regeneration+in+zebrafish.">Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish.</a> Development. 121, 347-357 (1995).</li><li>Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+tip+regeneration+correlates+with+regions+of+Msx1+(Hox+7)+expression+in+fetal+and+newborn+mice.">Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice.</a> Development. 121, 1065-1076 (1995).</li><li>Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+development+of+skin+cells+and+cutaneous+sensory+axons+in+zebrafish.">Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).</li><li>Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+fin+primordia+of+zebrafish+larvae+regenerate+by+a+similar+growth+control+mechanism+with+adult+regeneration.">Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration.</a> Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).</li><li>Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+functional+analysis+of+zebrafish+larval+fin+fold+regeneration.">Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration.</a> Dev Biol. 325, 71-81 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish:+Cellular+and+Developmental+Biology,+part+A.+Preface.">The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface.</a> Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).</li><li>Dahm, N. -. V. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , 303 (2002).</li><li>Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. , (2005).</li><li>Concha, M. L., Adams, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+divisions+and+cellular+morphogenesis+in+the+zebrafish+gastrula+and+neurula:+a+time-lapse+analysis.">Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis.</a> Development. 125, 983-994 (1998).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+Heated+Incubation+Chamber+around+a+Microscope+Stage+for+Time-Lapse+Imaging.">Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bitplane.">Bitplane.</a> Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Processing with ImageJ. , 36-42 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Mateus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+and+tissue+dynamics+underlying+zebrafish+fin+fold+regeneration.">In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration.</a> PLoS One. 7, e51766 (2012).</li><li>Jones, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture.">et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li><li>Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-2+controls+directional+chain+migration+of+cerebellar+granule+neurons.">Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons.</a> PLoS Biol. 7, e1000240 (2009).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li><li>Tadrous, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+PSF+generation+for+3D+brightfield+deconvolution.">A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution.</a> J Microsc. 237, 192-199 (2010).</li><li>Distel, M., Babaryka, A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+in+vivo+time-lapse+imaging+at+cellular+resolution+by+stereomicroscopy.">Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy.</a> Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

השיטה המוצגת מאפשרת התבוננות ריפוי פצעים והתחדשות רקמות בחיים זחלי דג הזברה עם in vivo הדמיה הזמן לשגות בסטראו brightfield, באמצעות הגדרה פשוטה יחסית. הליך זה מחייב היבטים מסוימים חשובים שצריכים לבדוק, אשר יהיה לייעל את התוצאה: 1) ריכוזי agarose נמוכים (~ 0.5%) יהיה הפחתת חסמי צמיחה של דג הזברה הזחל גדל ללא הרף, 2) הסרת agarose סביב הסנפיר חשובה לא כדי לטשטש את תהליך הריפוי, 3) לכידת agarose ברשת פלסטיק שומרת לעצמה את agarose ובעלי חיים במצב יציב לאורך כל ההליך, ו- 4) שליטה בסביבת טמפרטורה נכונה, שהוא חיוני לקיום זחל. יש לנו להתאים מחומם חדר דגירה 23,24, אשר מנצל אריזת בועות שהודבקה על גבי קרטון, ודוד כיפת קווי לשלוט על הטמפרטורה וזרימת אוויר נאותה עם תנודות מינימליות במהלךהליך הדמיה. ניתן להכין חדר פשוט וחסכוני זה כדי להתאים לכל מיקרוסקופ. תא דגירה מחוממת דומה כבר מנוצל גם לעכברי הדמיה ופיתוח חומוס 24,29. אנו מציעים כי זחלים-קטוע מראש הם רכובים על תמונה שלפני קטיעה, demounted לקטיעה, ושב ורכב לזמן לשגות הדמיה. למרות שזה אפשרי על מנת לבצע את הפעולות הבאות בשלב אחד בחדר ההדמיה הסופי, בניסיון שלנו מצאנו כי קטיעת סנפיר הזנב על coverslip זכוכית אינה אופטימלית, כפי שהוא קורע את הרקמה ולא לגרום לחתך נקי. שיטת הקטיעה מבוססת agarose באמצעות מחט מזרק תוארה במקור על ידי Kawakami ועמיתיו (2004) 16, והוא גם, בניסיון שלנו, אידיאלי לבצע קטיעות. כך, הסדרה די המסובכת של צעדים שהצגנו היא גם מוצדקת ומבטיחה תוצאת התחדשות אופטימלית. הראינו larv שדג הזברה אל ב -2 DPF ניתן הדמיה עד 1.5 ימים בagarose ופתרון Tricaine. אנו משמשים פתרון מותאם pH Tricaine (pH7) מוכן עם מלח אוקיינוס ​​מיידי, שאינו מפריע לבריאותו של הדגימה לתקופה ההדמיה הוצגה. אנחנו בעבר אך גם הוכיחו כי באמצעות Tricaine במדיום Danieau מאפשר זמן לשגות הדמיה של 2.5 DPF דג הזברה זחל על מיקרוסקופ confocal לפחות 2 ימים 30. לפיכך, תנאי חיץ אופטימליים יכולים להאריך בריאות זחל והאורך של הדמיה. לחלופין, ריכוזים נמוכים Tricaine עשויים לשמש להרדמה, או 2-פנוקסיתנול, שבו מצאו נסבל היטב בשלבי זחל ומבוגרים בגיל 28 מעלות צלזיוס במשך לפחות 60 שעות. כדי להימנע מפגמים בהתחדשות סנפיר, ואנחנו פינינו את agarose מסנפיר הזנב לפני ההדמיה. הנתונים שלנו מראה כי בתוך 1.5 ימים הסנפיר כבר התאחה לכ -60%. קצב התחדשות זו עולה בקנה אחד עם מחקר קודם הגדרת 3 ימיםזה זמן ממוצע להתחדשות סנפיר זנב בדג זברה זחלים עד 6 DPF 16. שיטות אלטרנטיביות לagarose אולם יכולות להיות מנוצלת כדי לעלות את הדג להדמיה. לדוגמא, דקה פלזמה קרישי 31 או פרופילן אתילן פלואור (FEP) צינורות מצופים בmethylcellulose ומלא בריכוזים נמוכים מאוד agarose (0.1%) היה מומלץ למיקרוסקופיה גיליון אור 32 ועשויה להיות מתאים לשיטה שלנו שהוצגה. עם זאת, אנו לא ממליצים agarose methylcellulose ושל 0.1%, כפי שהם דורשים כי הדגימה הם רכובים בחלק התחתון של התא בשל חוסר המיצוק של תקשורת אלה. ריכוזים גבוהים מאוד של methylcellulose יתר על כן יפיקו כיסי אוויר המבוססים על הניסיון שלנו, ואלה עלולים להפריע להליך ההדמיה. אם תקשורת אלה העדיפו בשימוש בתא התחתון, חשוב שמרחק עבודה מתאים בין העדשה האובייקטיבית והדגימה הוא הווה. יש לציין כי מ &#39;ethylcellulose כמדיום הרכבה מומלצת רק לתקופה של עד היום 1, כפי שהוא עלול להפריע לבריאות זחל 32. ההרכבה הדגימה במכסה עלולה לגרום לסחף כלפי מטה הכבידה איטי. לכן מומלץ לחלקים מרובים תמונה בכל נקודת זמן, אשר גם יכול להיות מוקרנת למטוס בודד או רק תמונות שנמצאות במישור המוקד ניתן חילוץ להרכבת הסרט הסופי. הדמיה הדגימה בתא התחתון יכולה להיות מתודולוגיה חלופית, כדי למנוע סחף כלפי מטה פוטנציאלי. קרישי פלזמה יכולים להיות שימושיים כדי למנוע סחף, כמו הפלזמה תדבק השכבה העוטפת החיצונית (EVL, periderm) 31, ולכן עשוי לייצב את הדגימה. אולם זה צריך להיבדק, כמו גם איך דג הזברה זחל ארוך יכול להישמר בקרישי פלזמה מבלי להפריע לבריאות זחל או התחדשות סנפיר. הסרט שלנו הורכב ניצול חלקים בודדים (26 מיקרומטר)של Z- מחסנית נרשמה, שכיסה את העובי המלא של הסנפיר (~ 10 מיקרומטר) ואשר היווה z-סחף פוטנציאלי של הסנפיר במהלך הליך ההדמיה. על מנת לשמור על מידע 3-D, אפשר גם להקרין Z- ערימות לתמונות בודדות. כי זה עלול לגרום לטשטוש של התמונה, deconvolution brightfield עשויה להיות רצויה. תוכנה, כגון Deconvolve או X3 Autoquant יכולה להיות מנוצלת למטרה זו. לחלופין, אלגוריתמים מתמטיים (שתוארו בTadrous 33) יכולים להיות מיושמים להשגת פונקצית נקודת התפשטות יחס גבוה אות לרעש (SNR). קבלת יחס אות לרעש גבוהה מייצגת את אחד המכשולים העיקריים בdeconvolution brightfield. למרות ששיטה זו דורשת ניגודיות גבוהה ועובי מדגם דק, זה יהיה מתאים להדמיה של סנפיר הזנב בשל הרוחב המוקטן שלה. יתרון ברור של שיטת ההדמיה שהוצגה הוא שזה במהירות להתאמה לכל סטראו מצויד במצלמת CCDתוכנת הזמן לשגות ד ומציעה אלטרנטיבה בעלות נמוכה למערכות הדמיה confocal יקרות יותר. בעוד ששיטה זו לא לנצל הקרינה לגילוי תאים, ניתן להאריכה ליישומים כאלה על ידי ניצול מערכת אוטומטית לשליטת תריס ותוכנת deconvolution הודעה הדמיה-34. זה יאפשר למשתמשים לצפות בתהליכי תיקון נוסף פצע והתחדשות עם תא בודד או רזולוציה subcellular על פני תקופות זמן ארוכות יותר. הבהירות האופטית והקלות בה עוברי ודג זברה זחל יכולה להיות מטופלים, ואת יכולת ההתאמה של שיטה זו לכל סטראו הופכת אותו מתאימה להוראת ביולוגיה חוליות בסיסית במסגרת כיתתית. בשיטה זו ניתן להקנות לתלמידי הבנה טובה יותר של התהליכים הביולוגיים הבסיסיים שבבסיס תיקון והתחדשות רקמות. תהליכים ביולוגיים אחרים שכבר נתפסו עם שיטה דומה הם פיתוח דג הזברה עוברי 23,34 ולבפונקציה (לא פורסם). שיטה זו מציעה גם את האפשרות לתיקון פצע ניטור והתחדשות בזחלים שכבר מניפולציות גנטית ופרמקולוגית.

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bullseye Agarose</td><td>MidSci</td><td>BE-GCA500</td><td></td></tr><tr><td>Low-melt agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1360-100</td><td></td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Aquarium Salt</td><td>Pet store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue (0.1% solution)</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10505</td><td></td></tr><tr><td>2-Phenoxyethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 35 x 15 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 x 15 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 100 x 25 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351013</td><td></td></tr><tr><td>5.75 inch boroschillate glass pipets</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (Glass: 0.085-0.115mm)</td><td>MatTek Corporation</td><td>D35-20-0-TOP</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus microscope slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>72191-75</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-18R15</td><td></td></tr><tr><td>Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48&quot;</td><td>Home Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips 20 &amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharply Angled Up</td><td>Fine Science Tools</td><td>14037-10</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Luer-Lok&amp;trade; disposable syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Luer-Lok&amp;trade; disposable syringe</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>23 G syringe needles</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LabDoctor Mini Dry Bath</td><td>MidSci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Discovery.V12 compound microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo S 3.5X objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

הטכניקה המוצגת הינה מתאימה על מנת להבהיר את דינמיקת תיקון רקמות בתגובה לקטיעה. הסרט מוכיח כי קטיעת הסנפיר תחילה מפעילה השפעת ארנק מיתרים, מאופיינת בהתכווצויות באמצעות כבלים יקטינו שרירן שנמצאים בסנפיר פי 28 (איור 5, B). במקביל, תאים נמתחים מהפצע (ראה סרט). ההתכווצות ייתכן אפוא שאמצעי לגרש תאים שסביר להניח שנועדו לעבור מוות של תאים. התוצאות שלנו מראות עוד כי הצמיחה ההתפתחותי של הזחל מתרחשת באופן עצמאי של התחדשות (סרט), ואילו התחדשות סנפיר אינה יוזמת עד שלאחר קטיעה כ -14 שעות, כפי שנמדדה על ידי אורך סנפיר ואזור במהלך 36 שעות הזמן הבא קטיעה (איור 5 ג , D). צמיחת סנפיר משובי הכוללת לאחר 1.5 ימים הייתה כ -60% מאורך הסנפיר המקורי (איור 5E). יחדיו, תוצאות אלה ממחישות כי tr הקטיעה<html> iggers התכווצות סנפיר, שחול של תאים מהפצע, ותגובת משובי מתעכבים באופן זמני. בעוד תאי extruded הם צפויים עתידים לעבור מוות של תאים, הטבע של תאים אלה צריך להיות מובהרים נוספים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig1.jpg" /> קאמרי הרכבה טבעת 1. הדמיה איור () מוצג הינה טבעת פלסטיק שמחוברת לcoverslip עם גריז סיליקון. רשת פלסטיק מצורף לחלק הפנימי של החדר עם ארבע נקודות קטנות של שומן סיליקון. (ב) התא המכיל את הזחל רכוב מלא בפתרון Tricaine ושקופיות זכוכית מחוברת לחלק העליון. (C) רכוב זחל בן יומו 2 (חץ) מוצג בהגדלה גבוהה יותר כדי לתאר את גודלו ביחס לרשת.&quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig2.jpg" /> איור 2. קאמרי הדמיה עשה הרכבה מצלחות פטרי. () מוצג הינה צלחת זכוכית מסחרית זכוכית העליונה תחתונה פטרי עם רשת פלסטיק המצורפת לcoverslip הזכוכית. (ב) המוצג הנו קאמרי צלחת פטרי בהקמה עצמית עם חור שנקדח לתוך המכסה וcoverslip המצורף מבחוץ עם גריז סיליקון. הרשת והזחל הם רכובים בתוך החדר המכיל פתרון Tricaine. לאטום את החדר, גריז סיליקון מוחל על השפה העליונה, החיצונית של התא התחתון והמכסה העליון המצורף. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52654/52654fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <i<html> alt מ&quot;ג = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,654 / 52654fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3. תכנית של קטיעה והרכבה של זחל להדמיה. (א) לקטיעה, למקם את הזחל הרדים על צלחת פטרי מצופה agarose ולקטוע סנפיר הזנב עם מחט מזרק. (ב) להרכבה, להעביר את הזחל עם טפטפת העברה לתוך צינור 1.5 מיליליטר מלא 42 ° C agarose הנוזלי ופיפטה ירידה המכילה את הזחל לחדר ההדמיה, כוון את הדגים ולכסות את הקרושה agarose עם מדיום עובר. (C) תגרד את agarose מסנפיר הזנב באמצעות קצה תרי microloader פיפטה או כלי דומה ולהחליף בינוני עובר עם מדיום חדש. תמונה (D) סנפיר הזנב תחת סטראו. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52654/52654fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ithin-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig4.jpg" /> איור 4. תא דגירה מחומם נבנה עצמית. (AC) המוצג הנו תא דגירה מחומם מקרטון, פלסטיק הבועות וסקוטש. דוד קווי כיפה (שנועד במקור לדגירת עוף) מחובר לתא באמצעות קלטת אלומיניום. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52654/52654fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig5.jpg" /> איור 5. דינמיקת התחדשות Fin. () תכנית של שיטת assay הקטיעה וכימות סנפיר זנב מנוצל כדי לקבוע את אורך הסנפיר (חץ אדום) ואזור (קווי המתאר אדומים של הסנפיר). קטיעת סנפיר זנב (ב) בתחילה מעוררת התכווצות של הסנפיר, ואחריו Regeתולדת רקמת nerative. הסנפיר גם עובר צמיחה התפתחותית, כפי שמעיד עליית גודל הרוחב. (C) המוצג הנו אורך הסנפיר כפונקציה של זמן, חושף התחלת צמיחת משובי ליניארי ב ~ 14 hPa. (ד) כימות של אזור הסנפיר חושפת לראשונה ירידה בגודל, שניתן לייחס להתכווצות של הסנפיר. אחרי ~ 14 שעות, מגדילה גודל הסנפיר בקצב ליניארי. (E) השוואה של אורך הסנפיר לפני הקטיעה ואחרי 36 שעות תערוכות ~ 60% לצמיחה מחודשת. בר סולם: 100 מיקרומטר קיצורים: קדם-מגבר, לפני קטיעה; שעות שלאחר קטיעה, hPa; regen, התחדשות; מגבר, קטיעה <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52654/52654fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52654/movie1.mp4">סרט.</a> התחדשות סנפיר במהלך 36 הזמןhr. מוצג הוא סנפיר זנב של זחל ישן 2.5 יום במהלך ההתחדשות. צמיחת משובי שלאחר קטיעת 30 דקות החל היא הדמיה ב -30 דקות במרווחים על סטראו באמצעות עדשה אובייקטיבית 3.5x.

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy at JoVE.com

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

capturing-tissue-repair-zebrafish-larvae-with-time-lapse-brightfield

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Views.  MDI Biological Laboratory. We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Video: Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

לדמיין את רקמות Interrenal Steroidogenic ו microenvironment הדם שלה דג הזברה

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biology

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage where they execute crucial antimicrobial functions. Their trafficking to these loci is orchestrated by several inflammatory chemoattractants, including chemokines. At the molecular level, chemoattractant signaling is regulated by the intracellular trafficking of the corresponding receptors. However, it remains unclear how subcellular changes in chemokine receptors affect leukocyte migration dynamics at the cell and tissue level. Here we describe a methodology for live imaging and quantitative analysis of chemokine receptor dynamics in neutrophils during inflammatory responses to tissue damage. These tools have revealed that differential chemokine receptor trafficking in zebrafish neutrophils coordinates neutrophil clustering and dispersal at sites of tissue damage. This has implications for our understanding of how inflammatory responses are self-resolved. The described tools could be used to understand neutrophil migration patterns in a variety of physiological and pathological settings and the methodology could be expanded to other signaling receptors.

Here we describe protocols to perform live imaging and quantitative analysis of chemoattractant receptor dynamics in zebrafish neutrophils

הדמיה חיה של קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה במהלך תגובות לפצעים

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Immunology and Infection

ניתוח התכווצות הלב של דגי זברה עם אינטראקציית מציאות מדומה

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

מחבר זרקור: דימות גיליון אור ברזולוציה גבוהה 4D ומציאות מדומה בדגי זברה לניתוח תא יחיד של תפקוד הלב

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

לדמיין את רקמות Interrenal Steroidogenic ו microenvironment הדם שלה דג הזברה

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

הדמיה חיה של קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה במהלך תגובות לפצעים

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה