המחברים מודים אנה Labernadie, גיום Charrière, פטריק Delobelle על תרומתה הראשונית לעבודה זו, מתיו סנצ'ז, פרנסואז Viala על עזרתם עם צילום וידאו ועריכה. עבודה זו היא נתמכה על ידי l'Agence נאסיונאל דה לה Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Médicale רשרש (עקרות DEQ2016 0334894), INSERM תוכנית סרטן, סרטן Fondation טולוז, הגבול האנושי המדע תוכנית (RGP0035/2016).

1. הכנת רשתות מצופים Formvar
<ol><li>מיקרוסקופ אלקטרונים רשתות עם אצטון טהור ונקי ומניחים אותם על נייר סינון. לאחר מכן נקיים שקופית מיקרוסקופ עם אתנול טהור, לנגב עם נייר עדשה, להסיר את האבק עם מפוח.</li>
	<li>מקום של שקופיות זכוכית ניקיתי אתנול אנכית המשפך של מכשיר הליהוק סרט המכיל פתרון של Formvar בחלק התחתון. לכסות את החלק העליון של המשפך.</li>
	<li>משאבת 100 מ של Formvar פתרון (0.5% באתילן dichloride) עם הנורה atomizer ב עד רמת מגיע שני שלישים של השקופית.</li>
	<li>לשמור את השקופית הפתרון עבור 1 דקות.</li>
	<li>. פתח את הברז של המכשיר כדי לנקז את הפתרון Formvar ב זרם קבוע קצב זרימה של 10 עד 15 מ ל/s תניב סרט Formvar של 30-80 ננומטר. העובי של הסרט נקבעת על ידי הריכוז של הפתרון Formvar על ידי קצב ניקוז. הערה: קצב ניקוז יכול להיות נשלט על-ידי איוור את הלחץ באמצעות שסתום האוויר החוצה על-ידי לאט פתיחת המסתם. מהר יותר הניקוז, עבה הסרט. בפועל, כי זה קשה לחזות את עובי הסרט לפי קצב זרימה Formvar, אנו להכין מספר אצוות של סרטים Formvar ולשלוט עובי שלהם על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (ראה שלב 2).</li>
	<li>הסר את השקופית מן החדר, לייבש אותו בעדינות על נייר סינון כדי להסיר את כל Formvar נוזלי.</li>
	<li>גוזרים מלבן 20 מ"מ x 50 מ"מ מהסרט Formvar עם סכין גילוח.</li>
	<li>מילוי גביע עם מים מזוקקים נקיים, לאט מזנקת השקופית אנכית אל המים לעוף. הסרט: הסרט אמור לצוף על פני המים.</li>
	<li>מקום יבש ניקיתי אצטון רשתות על הסרט, מבריק פונות למעלה.</li>
	<li>המקום של coverslip זכוכית עגול (Ø 12 מ מ) על כמה מן הרשתות. Coverslip זה ישמש כדי למדוד את עובי הסרט (ראה שלב 2).</li>
	<li>מכסים שקופית מיקרוסקופ עם מדבקה לבנה, גודלה משתנה כך שיתאים. טובלים את השקופית אנכית על הגבול של הסרט Formvar צף עד כל הסרט לאנאפוליס השקופית. להסיר את המים העודפים השקופית עם נייר סינון ולתת לזה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.</li>
</ol>2. מדידת עובי הסרט
<ol><li>חותכים את Formvar סביב coverslip עם פינצטה כדי לנתק את זה מתוך השקופית.</li>
	<li>סמן את המיקום של הרשת תחת coverslip עם עט.</li>
	<li>חותכים את Formvar מרחבי הרשת מסומן כדי לנתק אותו מן coverslip. לכן יהיה חור בגליון Formvar הנותרים, שיאפשר למדוד את עובי הסרט. לכסות את coverslip עם PBS והנח אותו על משטח זכוכית על המיקרוסקופ.</li>
	<li>הר של זיז ניטריד סיליקון על הבלוק זכוכית מיקרוסקופ כוח אטומי, מוודא שהפס הזהב אינו מכוסה על-ידי הקצה של האביב. הערה: הרגישות ואת קבוע הקפיץ הזיז צריך לקבל קודם לכן היה מכויל ב- PBS.</li>
	<li>לטעון את גוש זכוכית על גבי המודול AFM ולאחר מכן הצב את המודול לתוך המיקרוסקופ.</li>
	<li>מניחים את coverslip מצופים Formvar על תא תצפית, לכסות את זה עם µL 500 ל- PBS.</li>
	<li>סרוק את הגבול של החור בגליון Formvar באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי ב מצב הקשר ונקודת ערכת כוח 0.5 nN.</li>
	<li>פני השטח coverslip זכוכית כהפניה למדידות גובה ושימוש להעריך את עובי Formvar כמו הגובה של חתך הרוחב (לבצע מדידות לפחות 10 לכל Formvar אצווה).</li>
</ol>3. זריעת תאי על רשתות
<ol><li>ברדס סטרילי, לשים רצועה (12 מ"מ x 3 מ"מ) של דבק דו צדדי coverslip.</li>
	<li>לגזור רשת מצופה Formvar עם פינצטה ושים אותו הפוך על רצועת דבק (רק השפה של הרשת צריך לצרף את הקלטת). הסרט Formvar צריך להתמודד עם coverslip.</li>
	<li>לשים התקן זה תרבות היטב.</li>
	<li>המקום droplet 10 µL של RPMI ללא FCS המכיל 104 מקרופאגים תריז ומונוציטים האנושי16. הערה: הקפד לא לגעת הרשת עם הטיפ פיפטה כדי למנוע פגיעה הציפוי Formvar.</li>
	<li>תקופת דגירה של 30 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) לתת תאים ולהתבטא.</li>
	<li>למלא את הבאר עם 2 מ של RPMI המכיל 10% FCS.</li>
	<li>דגירה את המכשיר עבור 2 h-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לתת תאים לדבוק לפני התצפית AFM.</li>
</ol>4. טופוגרפיה מדידות של העיוותים הנוצרות על-ידי Podosome
<ol><li>תוקע שתי רצועות של דבק צדדית הוכפל על רצפת הזכוכית צלחת פטרי. הערה: המרחק בין שתי רצועות צריך להיות קטן יותר הקוטר רשת.</li>
	<li>ניתוק בקפידה את רשת מצופה מקרופאגים מהקלטת דבק.</li>
	<li>הפוך את הרשת על מנת לקבל את התאים מול הזכוכית ולהישאר ברשת בין שתי רצועות דבק.</li>
	<li>תיקון הרשת עם שתי רצועות חדש דבק צדדית הוכפל: הרשת ובכך להיות דחוקה בין שתי רצועות דביקות, עזיבת האזור המרכזי של הרשת להנגיש הטיפ AFM. הערה: ודא כי הרשת טוב קבוע, לא המעוות; אחרת הזיז AFM לא יוכל להתקרב השטח Formvar.</li>
	<li>למלא את צלחת פטרי עם 2 מיליליטר מחומם מראש-37 ° C תרבות בינוני (RPMI עם 10% FCS) בתוספת 10 מ מ HEPES (pH 7.4).</li>
	<li>במקום המנה תרבות על תנור מנה 37 º C.</li>
	<li>להתקין את התנור מאכל על הבמה AFM.</li>
	<li>. תן למערכת ייצוב ב 37 º C.</li>
	<li>במצב קשר עם כוח 0.5 nN, להפוך תמונה הגלובלית הראשונה לאתר podosomes, ולאחר מכן סרוק את הטופוגרפיה Formvar-3 הרץ עם פיקסל nm-גדול כ-20. הערה: להימנע סריקה בקרבת קצות הרשת.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate.">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype.">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification.">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease.">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li><li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration.">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li><li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Forces+in+Cell+Biology.">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li><li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes.">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343 (2014).</li><li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+Together:+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors.">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li><li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking.">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li><li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis.">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li><li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments.">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li><li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A.">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li><li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Macrophage+3d+Migration:+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration.">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Phosphorylation+of+Wiskott-Aldrich+Syndrome+Protein+(Wasp)+by+Hck+Regulates+Macrophage+Function.">Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).</li><li>Van Goethem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Podosomes+Go+3d.">Macrophage Podosomes Go 3d.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).</li><li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages:+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures.">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li><li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages.">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li><li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podosome+Force+Generation+Machinery:+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring.">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li><li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells.">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li><li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes.">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li><li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory/Effector+T+Cells.">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li><li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion.">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li><li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts.">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li><li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion.">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis.">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li></ol>

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

תכונות החומר
הבחירה של החומר עבור ממברנה deformable, במקרה שלנו Formvar, צריך למלא כמה דרישות. החומר חייב להיות שקוף האור הנראה ולהציג קרינה פלואורסצנטית אוטומטי מוגבלת כדי לאפשר תצפיות בשדה בהירים ואת פלורסצנטיות מיקרוסקופ. המראה המחוספס של הסרט דק חייב להיות מתחת 10 ננומ?...

תאים בעלי חיים אינטראקציה פיזית עם המטריקס, התאים האחרים המהווים את הסביבה שלהם1. פעולה זו נדרשת כדי להעביר, להפנים גופות, לרכוש מידע חיצוני או להבדיל. בתהליכי כזה, התא צריך להקרין כוחות מכני ומשפיע, כמו מחקרים רבים הראו בשנים האחרונות, היכולת של תא כדי ליצור כוחות, לחקור את הסביבה שלה התנהגות ביולוגית, בימוי למשל התפשטות או בידול2,3. בתורו, המדידה של כוחות הסלולר היא מכשיר מרכזי לימוד ויסות כוח הדור ולהבין את המשמעות שלה תא התנהגות ורקמות גורל4,5.
בשנים האחרונות עדים על התפתחות טכניקות רבות כדי למדוד את הכוחות תא יכול להפעיל על הסביבה שלה6. רוב אלה סייעו חושפים שהמתיחה כוחות כי תאים להפעיל כפי שהם מושכים על הגששים ניידים או מצע deformable. עם זאת, הכוחות מכניים מעורבים בליטה לסביבת חוץ-תאית סובלים מחסור של טכניקות מדידה והם עד היום לא טוב מאופיין.
כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מציגים שיטה למדידת כוחות המופעל orthogonally אל המצע. זה מורכב ב ציפוי חיים תאים בגיליון אלסטי דק אשר ניתן לעוות בכיוון אורתוגונלית, דבר המאפשר למדוד דפורמציה המצע על ידי התאים ולהסיק את הכוחות המעורבים. המצע הטופוגרפיה נמדד עם רזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, הערכת כוחות של דפורמציה מסתמך על הידע של הגיאומטריה של מבנים הסלולר protrusive7,8, 9.
כאן, אנו מתארים את הכיוונון ויישומה למדידת הכוחות שנוצר על ידי podosomes, מבנים אדהזיה protrusive הנוצרת על-ידי מקרופאגים להעברת mesenchymal שלהם סביבות תלת-ממדי10,11, 12,13,14,15,16,17. אנו מאמינים כי טכניקה זו תקדם את ההבנה של יצירת כח ורגולציה שלה בתהליכי הסלולר רבים המערבים בליטה.

<table><tbody><tr><td>200 mesh nickel grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>White stickers 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Film casting device with valve in its outlet</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Razorblades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm coverslips</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Temperature-controlled sample holder&amp;nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Double-sided adhesive tape</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

protrusion force microscopy: a method to quantify forces developed by cell protrusions

בהקשרים ביולוגיים רבים, תאים בעלי חיים צריך אינטראקציה פיזית עם הסביבה שלהם על ידי פיתוח כוחות מכני. בין אלה, כוחות המתיחה היה מאופיין היטב, אך יש חוסר של טכניקות המאפשר מדידת כוחות בליטה שהופעל על ידי תאים orthogonally המצע שלהם. תיכננו התקנה ניסיוני. למדידת כוחות בליטה שהופעל על ידי תאים חסיד על המצע שלהם. תאי ציפוי על גליון Formvar תואם לעוות את המצע, הטופוגרפיה וכתוצאה מכך ממופה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) את המשקל ננומטר. כוח ערכים המחולצים ואז ניתוח של הפרופיל דפורמציה בהתבסס על הגיאומטריה של המבנים התאיים protrusive. לפיכך, ניתן למדוד את הכוחות שהופעל על ידי היחידות בולט בודדים של תא חי לאורך זמן. טכניקה זו תאפשר המחקר של יצירת כח ורגולציה שלה בתהליכי הסלולר רבים המערבים בליטה. כאן, אנו מתארים את היישום שלה כדי למדוד את הכוחות protrusive שנוצר על ידי podosomes הנוצרת על-ידי מקרופאגים אנושי.

הפרוטוקול הנ ל מתאר כיצד להכין את הגדרת הניסוי לכמת חדירת כוחות שהוחלו על-ידי macrophage podosomes על מצע Formvar. זו מושגת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מודגם באיור1.
בעת ניתוח תמונת הטופוגרפי של גבשושיות וזיזים מתחת podosomes שימוש בתוכנת ...

Watch this Scientific Journal Video about Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions at JoVE.com

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

כאן, אנחנו מפרטים את הטכניקות ניסיוני המשמשים להערכת כוחות בליטה podosomes להחיל על סרט תואם, משלב הכנת הסרט לניתוח אוטומטי של תמונות הטופוגרפי.

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

protrusion-force-microscopy-method-to-quantify-forces-developed-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

5.5K Views.  IPBS, Université de Toulouse, CNRS, UPS. כאן, אנחנו מפרטים את הטכניקות ניסיוני המשמשים להערכת כוחות בליטה podosomes להחיל על סרט תואם, משלב הכנת הסרט לניתוח אוטומטי של תמונות הטופוגרפי.

Video: Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous with the cytoskeleton, methods are needed to probe its mechanical behavior in adherent cells. Here, we discuss the direct force probe (DFP) as a tool to apply force directly to the nucleus in a living adherent cell. We attach a narrow micropipette to the nuclear surface with suction. The micropipette is translated away from the nucleus, which causes the nucleus to deform and translate. When the restoring force is equal to the suction force, the nucleus detaches and elastically relaxes. Because the suction pressure is precisely known, the force on the nuclear surface is known. This method has revealed that nano-scale forces are sufficient to deform and translate the nucleus in adherent cells, and identified cytoskeletal elements that enable the nucleus to resist forces. The DFP can be used to dissect the contributions of cellular and nuclear components to nuclear mechanical properties in living cells.

In this protocol, we describe a micropipette method to directly apply a controlled force to the nucleus in a living cell. This assay allows interrogation of nuclear mechanical properties in the living, adherent cell.

בדיקה ישירה כוח למדידת מכני אינטגרציה בין הגרעין של שלד התא

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Biochemistry

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular stress and traction generation is currently unknown. Therefore, we present here a mechanics-based protocol to probe the influence of gap junction connexin 43 (Cx43) has on endothelial biomechanics by exposing confluent endothelial monolayers to a known Cx43 inhibitor 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) and measuring the impact this inhibitor has on tractions and intercellular stresses. We present representative results, which show a decrease in both tractions and intercellular stresses under a high chalcone dosage (2 &#181;g/mL) when compared to control. This protocol can be applied to not just Cx43, but also other gap junctions as well, assuming the appropriate inhibitor is used. We believe this protocol will be useful in the fields of cardiovascular and mechanobiology research.

Here, we present a mechanics-based protocol to disrupt the gap junction connexin 43 and measure the subsequent impact this has on endothelial biomechanics via observation of tractions and intercellular stresses.

Perturbing אנדותל ביומכניקה דרך קונשין 43 מבנית שיבוש

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Bioengineering

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Developmental Biology

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

ייצור ויישום של פלטפורמת מיקרוסקופית כוח המתיחה ללא התייחסות

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

מיקרוסקופ כוח מתיחה ללמוד B לימפוציטים הפעלת

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...