We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.

הערה: כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל. .1 בלו מסתם אאורטלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטכניקת המתת חסד אושרה לשלב העוברי של עניין, להרדים עכבר בהריון עם גורים ביום הרצוי העוברי (E) של פיתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 70% אתנול לעקר הבטן של הנשים בהריון. הרם את העור ושרירים של הבטן התחתונה ומן האיברים הפנימיים, ולנתח חלל הבטן התחתונה של פתוחה הנקבה כדי לאפשר גישה לקרן הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאחזר את קרן הרחם, להחזיק את צוואר הרחם עם מלקחיים וזנב לחתוך בזהירות למלקחיים. הרם את קרן הרחם, חיתוך כל רקמת חיבור שמחזיקה את הקרן במקום, ולהשלים את ההסרה על ידי חיתוך הצומת של קרן הרחם עם oviduct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קרן הרחם גזור בcol צלחת פטרי המכילד 0.1 חיץ M טריס (pH 7.6) ולשטוף לפי צורך. לאחר מכן, חותך את קרן הרחם פתוח אורך חכם לחשוף את שקים העובריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשוף את העובר, לחתוך לפתוח שק עוברי בצומת של השליה והעוברת ולחתוך את כלי הטבור לשחרר את העובר. מניחים את העובר גזור בצלחת פטרי שנייה עם חיץ M טריס קר 0.1. להחזיר את צלחת פטרי הראשונה עם עוברי undissected נותרים לקרח עד מוכן לעובר הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר את קיר גישת חזה בתוך העובר, לערוף את העובר. אם גנוטיפ יש צורך, להסיר ולשמור חתיכת רקמה נוספת בצינור Eppendorf הניח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העובר על הגב שלה, וחתך את קיר החזה בצורה אנכית בצד של כלוב הצלעות, ליד forelimb, ואופקית מעל הסרעפת לדמיין את הלב. לאחר מכן, לפתוח את בית החזה כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים להחזיק גבוה לאורך כלי הגדול, להרים את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי להלן.n, לחתוך מעל המלקחיים כדי לשחרר את הלב. אם כלי ריאתי להישאר נימול, הריאות ניתן להסיר עם הלב, ויש להסיר לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך ולהסיר את עורק הריאה מעל לרמה של השסתום; בשלבים העובריים שתוארו במסמך זה, עורק הריאה הוא מעט אטום, אשר מסייע באפליה שלה מאזור שסתום. לחתוך ממש מתחת לשסתום ריאתי, הימנעות שריר הלב של חדר trabeculated ולאסוף כפי שמתואר בשלב 1.10 אם אזור זה גם הוא עניין. כאן ובשלב הבא, להשתמש בפעולת נימים לצייר חיץ טריס עודף מהאזור של עניין לפני האיסוף במאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את דיסטלי אב העורקים לשסתום אב העורקים, ממש מעל הרמה של השסתום; כמו עורק הריאה, אב העורקים נשארים אטומים מעט בשלבים העובריים אלה, בסיוע בהסרתה. לחתוך ממש מתחת לשסתום אב העורקים, שוב הימנעות שריר הלב של חדר trabeculated, ולהעביר אתשסתום באמצעות מלקחיים לצינור Eppendorf עם חיץ תמוגה 2 μl (שמתואר בטבלת חומרים) המכיל מעכבי פרוטאז וphosphatase על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.6-1.10 עד שסתומים כבר נכרת מכל העוברים, איסוף כל שסתום בצינור Eppendorf נפרד. אם יש לי כל העוברים גנוטיפ זהה, כל השסתומים עשויים להיות שנאספו בצינור Eppendorf יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם גנוטיפ הוא שיש לבצע כדי לקבוע אילו שסתומי לחבור יחדיו, להציב מייד דגימות במאגר תמוגה ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. אז יכולות להיות ונקוו דגימות לאחר genotyping (צעד 2.1.1). </li></ol> הפקת .2 חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר רקמות שנאספו על קרח ו צנטריפוגות ב XG 13,100 עבור 1 דקות כדי לאסוף את הרקמות במאגר תמוגה בחלק התחתון של הצינור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עוברים עברו מיפוי, להשתמש פיפטה לאסוף בעדינות ובמאגר תמוגה בריכה המכיל את אזורי שסתום מעוברים עם גנוטיפים דומים. כדי להבטיח ב חזקו, איגום 3-4 אזורים שסתום מעוברי E13.5 לדגימה מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל העוברים היו של אותו גנוטיפ וכל אזורי שסתום נאספו יחד בשלב 1.10, lyse המדגם כולו, כפי שמתואר בשלב 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את עוצמת הקול של המדגם נקווה כתוצאה ולהוסיף למאגר תמוגה להיקף כולל של 40 μl; לאחר מכן, לשבש וhomogenize דגימות באמצעות חרוזים נירוסטה 5 מ&quot;מ בצינורות אפנדורף. פועל lyser ל2-4 דק &#39;ב 50 הרץ, לפי הוראות היצרן. צינורות ספין בקצרה, (~ 13,100 XG 1 דקות), והעברת דגימות לצינורות חדשים, והותירו אחריו את הפסולת בלתי מסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות נפרדות לSDS-PAGE והעברה לניתוח כתם מערבי שלאחר מכן, בעקבות פרוטוקול כגון אסלאמי et al 9. סופג לחלבון בקרת טעינה הוא חיוני לכימות חלבון. </li></ol>

<ol>
	<li>Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+cartilage+and+bone-related+proteins+in+pediatric+and+adult+diseased+aortic+valves.">Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves.</a> J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).</li><li>Chakraborty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1+promotes+heart+valve+cell+proliferation+and+extracellular+matrix+gene+expression+during+development+in+vivo+and+is+expressed+in+human+diseased+aortic+valves.">Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves.</a> Dev Biol. 347, 167-179 (2010).</li><li>Lee, M. P., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1+directly+regulates+genes+that+promote+cell+proliferation+and+migration+in+developing+heart+valves.">Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves.</a> PLoS One. 6 (e29758), (2011).</li><li>Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9+transcriptionally+represses+Spp1+to+prevent+matrix+mineralization+in+maturing+heart+valves+and+chondrocytes.">Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes.</a> PLoS One. 6 (e26769), (2011).</li><li>Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+gene+expression+profiles+in+developing+heart+valves+and+osteoblast+progenitor+cells.">Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells.</a> Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+functional+Toll-like+receptors+2+and+4+in+human+aortic+valve+interstitial+cells:+potential+roles+in+aortic+valve+inflammation+and+stenosis.">Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).</li><li>Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPER-induced+BMP+signaling+promotes+coronary+artery+remodeling.">BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling.</a> Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-ordinating+Notch,+BMP,+and+TGF-beta+signaling+during+heart+valve+development.">Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).</li><li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural.">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Development. 127, 1607-1616 (2000).</li><li>Scherptong, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+outflow+tract+rotation+during+cardiac+development:+the+pulmonary+push+concept.">Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept.</a> Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).</li><li>Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+osteopontin+in+calcified+human+aortic+valves.">Detection of osteopontin in calcified human aortic valves.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

היכולת לכמת רמות חלבון בעכבר עוברי מוקדם וחומוס אזורי שסתום לב מספקת כלי נוסף להבנת אירועי איתות התאיות הקריטיים להתפתחות שסתום. הפרוטוקול שלנו שתואר במסמך זה אינו שונה בהרבה מהנהלים בידוד חלבון סטנדרטיים. עם זאת, על ידי שינוי כמה שלבים עיקריים, שהשגנו בהצלחה חלבוני...

יכולת לזהות ולכמת רמות ביטוי חלבון היא טכניקה סטנדרטית לבהמה וניסויים מבוססי תאים. עם זאת, למרות ארוך שנתי עניין בפיתוח שסתום לב עוברי מוקדם, הערכת ביטוי חלבון ברקמה הספציפית הזה במהלך ההתפתחות כיום מוגבלת לאימונוהיסטוכימיה בשני האפרוח ו1,2 עכבר. חלק מהקושי של כימות ביטוי חלבון בשסתומי הפיתוח של רוב האורגניזמים מודל (למשל, אפרוח ועכבר) הוא בגודל הקטן של השסתומים, אשר מגביל את כמות החלבון שניתן להשיג. לפיכך, לניתוחים כמותיים, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על מיצוי RNA והגברה לPCR כמו שלאחר מכן או ניתוח microarray 2-5. עם זאת, רמות ביטוי RNA והחלבון אינן מלא גומלות 6, כל כך מתמקדות בביטוי RNA אינו יכולות לספק חשבון קפדני של שינויים הרבים המתרחשים בכל איתות שניתנהמסלול בזמנים שונים במהלך התפתחות. בהתבסס על מגבלה זו במתודולוגיה זמינה כרגע, המטרה של הליך זה הייתה לפתח פרוטוקול למהימן קבלת כמות מספקת של חלבון מאזורי שסתום לב העכבר עוברי מתפתחים לניתוח כמותי של שינויים המתרחשים במסלולי איתות שונים שחשובים ב ההבשלה של רקמה זו. שסתומים עובריים כבר הם גזורים בדרך כלל מעכברים לבידוד RNA וניתוח ביטוי גנים לאחר 2-5. עם זאת, מחקרים אלו היו מוגבלים לשימוש בביטוי גנים כקריאה מתוך איתות הפעלת מסלול, שאינו מאפשר זיהוי של לאתר שינויי חלבון לאחר translational שעשוי להשפיע על איתות במורד הזרם. תוך שימוש בטכניקות בידוד RNA כנקודת התחלה, התחלנו עם לנתח האזורים של עניין. בגלל האינטרס שלנו היה גילוי חלבוני phosphorylated שהיו מעיד על טפיחת איתותפעילות hway במהלך תקופה מסוימת של התפתחות שסתום אב העורקים (E13.5-14.5), ביצענו את כל הניתוחים במאגר טריס נטול פוספט ואספתי את השסתומים במאגר תמוגה מבוססת טריס עם מעכבי phosphatase ופרוטאז. במקרה הספציפי שלנו, רק אזורי שסתום אב העורקים נאספו, אבל יכול בקלות להיות מושגת אזור שסתום ריאתי באותו הזמן. אזורי שסתום היו אז הומוגני ושילוב עם מאגר מדגם המשמש כיום ללמוד ביטוי חלבון בשסתומי לב מבוגר 7. על ידי שימוש בכמויות קטנות מדגם (למשל, 2 μl) ואיגום אזורי שסתום מעוברים עם גנוטיפ זהה, שהיינו מסוגל לזהות חלבונים עוברים פוספורילציה וnonphosphorylated ביום עוברי 13.5 8. מאחר שניתן להקפיא את אזורי שסתום ומאוחסנים במאגר תמוגה, ניתן genotyped עוברים במידת צורך לפני איגום. טכניקה זו מרחיבה את הסט של כלים הזמינים להערכת סיגנליזטורי תאמסלולים גרם במהלך פיתוח ומספק מחמאה כמותי לאימונוהיסטוכימיה, במיוחד עבור שסתומי לב מתפתחים. טכניקה זו צריכה להיות בעל ערך לא רק לקרדיולוגים התפתחותיים, אלא גם לכל הביולוגים התפתחותיים שעובדים עם עוברים בראשית התפתחות מעוניינים באזורים המכילים רקמה מוגבלת.

<table><tbody><tr><td>Timed-pregnant mouse</td><td></td><td></td><td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M Tris, pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting needle holders</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13560</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting needles</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13561-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette, 20 &amp;mu;l, with tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton</td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td>Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel beads</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

שימוש בטכניקת הכנה זו, שהיינו מסוגל לזהות סמאד 1,5,8 פוספורילציה (pSmad) באזורי שסתום אב העורקים אחת מE13.5 עוברים. כפי שניתן לראות באיור 1 א, החלבון מבודד מאף אזור שסתום חד מספיק כדי לזהות להקת pSmad קלושה. עוצמת אות מגדילה באופן יחסי למספר אזורי שסתום שייאגרו. חש...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region at JoVE.com

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

protein-isolation-from-developing-embryonic-mouse-heart-valve

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Video: Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are extremely scarce, but expanded CPCs could be useful for cell therapy. A prerequisite for their use is their ability to differentiate in a controlled manner into the various cardiac lineages using defined and efficient protocols. In addition, upon in vitro expansion, CPCs isolated from patients or preclinical disease models may offer fruitful research tools for the investigation of disease mechanisms.
Current studies use different markers to identify CPCs. However, not all of them are expressed in humans, which limits the translational impact of some preclinical studies. Differentiation protocols that are applicable irrespective of the isolation technique and marker expression will allow for the standardized expansion and priming of CPCs for cell therapy purpose. Here we describe that the priming of CPCs under a low fetal bovine serum (FBS) concentration and low cell density conditions facilitates the endothelial differentiation of CPCs. Using two different subpopulations of mouse and rat CPCs, we show that laminin is a more suitable substrate than fibronectin for this purpose under the following protocol: after culturing for 2 - 3 days in medium including supplements that maintain multipotency and with 3.5% FBS, CPCs are seeded on laminin at &#60;60% confluence and cultured in supplement-free medium with low concentrations of FBS (0.1%) for 20 - 24 hours before differentiation in endothelial differentiation medium. Because CPCs are a heterogeneous population, serum concentrations and incubation times may need to be adjusted depending on the properties of the respective CPC subpopulation. Considering this, the technique can be applied to other types of CPCs as well and provides a useful method to investigate the potential and mechanisms of differentiation and how they are affected by disease when using CPCs isolated from respective disease models.

This protocol describes an endothelial differentiation technique for cardiac progenitor cells. It particularly focuses on how serum concentration and cell-seeding density affect the endothelial differentiation potential.

אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Developmental Biology

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכבר ברזולוציה של תא בודד

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

מחבר זרקור: בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects in these vessels represent severe health risks such as in atherosclerosis, which can lead to myocardial infarctions and heart failures in patients. Consequently, coronary artery disease is one of the leading causes of death worldwide. Despite its clinical importance, relatively little progress has been made on how to regenerate damaged coronary arteries. Nevertheless, recent progress has been made in understanding the cellular origin and differentiation pathways of coronary vessel development. The advent of tools and technologies that allow researchers to fluorescently label progenitor cells, follow their fate, and visualize progenies in vivo have been instrumental in understanding coronary vessel development. In vivo studies are valuable, but have limitations in terms of speed, accessibility, and flexibility in experimental design. Alternatively, accurate in vitro models of coronary angiogenesis can circumvent these limitations and allow researchers to interrogate important biological questions with speed and flexibility. The lack of appropriate in vitro model systems may have hindered the progress in understanding the cellular and molecular mechanisms of coronary vessel growth. Here, we describe an in vitro culture system to grow coronary vessels from the sinus venosus (SV) and endocardium (Endo), the two progenitor tissues from which many of the coronary vessels arise. We also confirmed that the cultures accurately recapitulate some of the known in vivo mechanisms. For instance, we show that the angiogenic sprouts in culture from SV downregulate COUP-TFII expression similar to what is observed in vivo. In addition, we show that VEGF-A, a well-known angiogenic factor in vivo, robustly stimulates angiogenesis from both the SV and Endo cultures. Collectively, we have devised an accurate in vitro culture model to study coronary angiogenesis.

In vitro models of coronary angiogenesis can be utilized for the discovery of the cellular and molecular mechanisms of coronary angiogenesis. In vitro explant cultures of sinus venosus and endocardium tissues show robust growth in response to VEGF-A and display a similar pattern of COUP-TFII expression as in vivo.

מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Medicine

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל