אנו מודים איימי חן על עזרתה בהכנה לצילומי הווידאו ולהפגין את הטכניקה. עבודה זו שנערכה על ידי ENIGMA: מערכות אקולוגיות ורשתות משולבות עם גנים והרכבות מולקולריות (http://enigma.lbl.gov), תכנית אזור המוקד מדעי במעבדה הלאומית לורנס ברקלי, נתמכת על ידי משרד מדע, המשרד הביולוגי ו מחקר סביבתי, של משרד אנרגיה של ארה&quot;ב תחת חוזה מס &#39;DE-AC02-05CH11231.

<ol>
	<li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains.">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li><li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems.">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li><li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo.">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li><li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators.">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li><li>Novichkov, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RegPrecise+web+services+interface:+programmatic+access+to+the+transcriptional+regulatory+interactions+in+bacteria+reconstructed+by+comparative+genomics.">RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics.</a> Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).</li><li>Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+sigma(N)-dependent+promoters+in+bacterial+genomes.">Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes.</a> Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).</li><li>Rajeev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+mapping+of+two+component+response+regulators+to+gene+targets+in+a+model+sulfate+reducing+bacterium.">Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium.</a> Genome Biol. 12, 99 (2011).</li><li>Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WebLogo:+a+sequence+logo+generator.">WebLogo: a sequence logo generator.</a> Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).</li><li>Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+response+regulator+autophosphorylation+through+interdomain+contacts.">Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts.</a> J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).</li><li>Bourret, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins.">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li><li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity.">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li><li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation.">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li><li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli.">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li><li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori.">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li><li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIP-chip:+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity.">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li><li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Immunoprecipitation+(DIP)+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity.">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon:+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis.">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

יש הסופרים שאין ניגוד עניינים לחשוף.

שיטת DAP-השבב שתוארה כאן הייתה הצלחה בשימוש כדי לקבוע את מטרות הגן במשך כמה RRs בDesulfovibrio vulgaris 7 Hildenborough של איזה מהם מוצג כאן כתוצאה נציג. לDVU3023 RR, בחירת יעד גן מועמד הייתה פשוטה. DVU3025 ממוקם מייד במורד הזרם של גן RR, וגני RR והיעד הם נשמרים בכמה מיני Desulfovibrio, ובנוס...

היכולת של חיידקים לשרוד ולשגשג תלויה באופן קריטי על כמה טוב הם מסוגלים לקלוט ולהגיב להפרעות בסביבתם, וזה בתורו הוא תלוי במערכות העברת אותותיהם. מספר מערכות אזעקת encodes חיידק כבר נקרא &quot;IQ של חיידקים&quot; שלה ויכול להיות אינדיקציה של שתי השתנות של סביבתו ואת יכולתו לחוש אותות מרובים ולכוונן את תגובתה 1. שתי מערכות רכיב אות התמרה (TCS) הן מערכות האיתות הנפוצות ביותר בשימוש על ידי חיידקים, והם מורכבים מקינאז היסטידין (HK) שחש את האות החיצונית ומעביר באמצעות זירחון לרגולטור תגובת מפעיל (RR) 2. RRs יכול להיות מגוון של תחומים פלט ומצבים שונים ובכך מפעיל, אבל התגובה הנפוצה ביותר היא תקנת תעתיק באמצעות DNA מחייב תחום 1. האותות חשו ופונקציות המקבילה vasלא רוב TCSs אינו ידוע. למרות in vivo שיטות כגון שבב שבב משמשות באופן שיגרתי לקביעת אתרי קישור הגנומי של שעתוק גורמי 3, הם יכולים לשמש רק לRRs שתי מערכת מרכיב חיידקים אם התנאים להפעלה או אותות ידועים. לעתים קרובות הרמזים הסביבתיים המפעילים TCS הם יותר קשים לקבוע ממטרות הגן שלהם. במבחנה microarray assay המבוסס המתואר כאן ניתן להשתמש ביעילות ובמהירות כדי לקבוע את מטרות הגן ולחזות פונקציות של TCSs. assay זה מנצל את העובדה שניתן phosphorylated RRs וכך הופעל במבחנה באמצעות תורמי מולקולה קטנים כמו פוספט אצטיל 4. בשיטה זו, בשם DAP-שבבים עבור ה-DNA זיקה מטוהר שבב (איור 1), גן RR של עניין הוא משובט עם התג שלו בE. coli, וטהר לאחר מכן חלבון מתויג מותר דוnd לטעון הדנ&quot;א הגנומי. ה-DNA חייב החלבון מועשר לאחר מכן על ידי זיקה לטיהור, ה-DNA המועשר וקלט הם מוגברות, שכותרתו fluorescently, אספו יחד והכלאה למגוון ריצוף כי הוא עשה מותאם אישית לאורגניזם של עניין (איור 1). ניסויי microarray כפופים לחפצים, ולכן צעדים נוספים מועסקים כדי לייעל את assay. צעד אחד כזה הוא לנסות ולקבוע יעד אחד לRR תחת מחקר באמצעות מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA) (ראה זרימת עבודה באיור 2). לאחר מכן, בעקבות מחייב הדנ&quot;א הגנומי וצעדי DAP, ה-DNA חייב החלבון והקלט נבדקים על ידי qPCR כדי לראות אם היעד החיובי הוא מועשר בשבריר מאוגד החלבון ביחס לשבריר הקלט, ובכך אישרה תנאים אופטימליים מחייב עבור RR (איור 2). לאחר הכלאת מערך, הנתונים מנותחים למצוא פסגות של אות בעוצמה גבוהה המעידות על לוקוסים הגנומי שבו שעות החלבוןמודעה קשורה. פונקציות יכולות להיות חזויה עבור RR מבוסס על מטרות הגן שהושגו. הלוקוסים הגנומי היעד משמשים כדי לחזות מוטיבים אתר מחייב, אשר לאחר מכן בניסוי תוקף באמצעות EMSAs (איור 2). התחזיות פונקציונליות ומטרות גן לRR יכולים אז להיות מורחבות למינים קשורות באופן הדוק המקודדים RRs orthologous ידי סריקת הגנום אלה למוטיבים המחייבים דומים (איור 2). שיטת DAP-השבב יכולה לספק שפע של מידע לTCS בהם בעבר לא היה כלום. גם השיטה יכולה לשמש לכל רגולטור תעתיק אם החלבון יכול להיות מטוהרת וניתן לקבוע תנאים המחייבים DNA, ולכל אורגניזם של עניין עם רצף הגנום זמין. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. מטוהר-DNA-זיקת השבב (DAP-אסטרטגית שבב) 7. גן RR מהאורגניזם של עניין הוא משובט עם התג שלו carboxy-מסוף לE. זן ביטוי coli. חלבון שלו מתויג מטוהר מופעל על ידי זירחון עם פוספט אצטיל, ומעורבב עם הדנ&quot;א הגנומי טעון. Aliquot של התגובה מחייבת נשמר כDNA קלט, ואילו השאר הוא נתון לטיהור זיקה באמצעות שרף Ni-נ.ת. ע. הקלט ואת ה-DNA הנכנס RR הוא הגנום כולו מוגבר, ושכותרתו עם Cy3 וCy5, בהתאמה. ה-DNA שכותרתו היא אספו יחד והכלאה למגוון ריצוף, אשר לאחר מכן נותח על מנת לקבוע מטרות הגן. איור שונה והודפס מחדש באמצעות הרישיון של Creative Commons מ7. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. סיכום של זרימת עבודה. לכל מטוהר protei מתויגn, להתחיל על ידי קביעת יעד באמצעות EMSA. אפשר לחלבון לקשור הדנ&quot;א הגנומי ולאחר מכן ה-DNA זיקה לטהר (DAP) והגנום כולו להגביר את ה-DNA והקלט המועשר (WGA). אם יעד גן ידוע, השתמש qPCR כדי להבטיח כי היעד הידוע הוא מועשר בשבריר מאוגד החלבון. אם לא ניתן לקבוע יעד, להמשיך ישירות לתיוג ה-DNA וכלת מערך. אם העשרה על ידי qPCR לא יכולה להיות שנצפתה, ולאחר מכן לחזור על החלבון מחייב-gDNA וצעדי DAP-WGA המשתמשים בכמויות חלבון שונות. השתמש בניתוח מערך למצוא פסגות ולמפות אותם כדי למקד את הגנים. השתמש באזורים במעלה הזרם של גנים המטרה לחזות מוטיבים אתר קישור. לאמת את המוטיבים בניסוי באמצעות EMSAs. השתמש במוטיב לסרוק את הגנום של מינים קרובים קידוד orthologs של RR תחת מחקר, ולחזות גנים ממוקדים במינים אלה גם כן. בהתבסס על מטרות הגן השיגו, התפקוד הפיזיולוגי של RR וorthologs ניתן לחזות. איור שונה והודפס מחדש באמצעות ג יצירתייםommons רישיון מ7.

<table><tbody><tr><td>HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (FPLC instrument)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Desalting column</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel extraction kit</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-labeled oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6% polyacrylamide-0.5x TBE precast mini DNA retardation gel</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>EC63652BOX</td><td>Alternately, you can pour your own gel.</td></tr><tr><td>Nylon membrane</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker Model XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose resin</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td><td>For quantitation of DNA</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td></tr><tr><td>PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>96-well clear low profile PCR microplate</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>4376600</td><td>Any real time PCR system may be used</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR purification kit</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28104</td><td>Any PCR clean up kit may be used</td></tr><tr><td>Cy3/Cy5-labeled nonamers</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3&#039;-5&#039; exo&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization system</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used.</td></tr><tr><td>Custom printed microarrays and mixers</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization kit (2x Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4200A microarray scanner</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td>This model has been replaced by superior ones</td><td></td></tr><tr><td>GenePix Pro microarray software</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

בשיטות vivo כגון שבב שבב טכניקות מבוססות היטב המשמשות לקביעת מטרות גן הגלובליות לגורמי שעתוק. עם זאת, הם של שימוש מוגבל בחקר שתי מערכות רגולציה מרכיב חיידקים עם תנאי הפעלת uncharacterized. מערכות כאלה להסדיר שעתוק רק כאשר מופעלים בנוכחות אותות ייחודיים. מאז האותות הללו הם לעתים קרובות לא ידועים, חוץ גופית בשיטה microarray מבוססת שבתוארה במאמר זה וידאו יכול לשמש כדי לקבוע מטרות גן ואתרי קישור לרגולטורי תגובה. שיטה מטוהרת-DNA-זיקת שבב זה עשויה לשמש לכל רגולטור מטוהר בכל אורגניזם עם הגנום רצף. הפרוטוקול כרוך מאפשר מטוהר החלבון מתויג להיקשר הדנ&quot;א הגנומי טעון ולאחר מכן טיהור זיקת DNA הנכנס החלבון, ואחריו ניאון תיוג של ה-DNA וכלאה למערך ריצוף מותאם אישית. שקדמו לצעדים שעשויים לשמש כדי לייעל את assay לספציפיהרגולטורים ג גם מתוארים. הפסגות שנוצרו על ידי ניתוח נתוני מערך משמשות כדי לחזות מוטיבים אתר קישור, אשר לאחר מכן הם תוקף באופן ניסיוני. תחזיות המוטיב יכולות לשמש נוספת כדי לקבוע מטרות גן של רגולטורים תגובת orthologous במינים קרובים. אנו מדגימים את תחולתה של שיטה זו על ידי קביעת מטרות הגן ומחייב מוטיבים אתר ובכך לחזות את הפונקציה עבור DVU3023 רגולטור תגובת sigma54 תלוי בחיידק הסביבתי Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

השיטה הנ&quot;ל יושמה כדי לקבוע את מטרות הגן הגלובליות של RRs בסולפט מודל הפחתת חיידק Desulfovibrio vulgaris 7 Hildenborough. יש אורגניזם זה מספר גדול של TCSs מיוצג על ידי מעל 70 RRs, המעיד על המגוון הרחב של אותות אפשריים שהוא חש ומגיב ל. בvivo מנתח על הפונקציות של מערכות אזעקה אלה ?...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

מאמר וידאו זה מתאר שיטת microarray מבוסס במבחנה כדי לקבוע את מטרות הגן ואתרי קישור לשני רגולטורים תגובת מערכת רכיב.

שיטת צ&#39;יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

16.7K Views.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  מאמר וידאו זה מתאר שיטת microarray מבוסס במבחנה כדי לקבוע את מטרות הגן ואתרי קישור לשני רגולטורים תגובת מערכת רכיב. 

Video: DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western countries. The majority of CLL patients show an indolent course of the disease as well as an anergic phenotype of their leukemia cells, referring to a B cell receptor unresponsive to external stimulation. We have recently shown that the transcription factor NFAT2 is a crucial regulator of anergy in CLL. A major challenge in the analysis of the role of a transcription factor in different diseases is the identification of its specific target genes. This is of&#160;great significance for the elucidation of pathogenetic mechanisms and potential therapeutic interventions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions and can, therefore, be used to identify direct target genes of transcription factors in mammalian cells. Here, ChIP was used to identify LCK as a direct target gene of NFAT2 in human CLL cells. DNA and associated proteins are crosslinked using formaldehyde and subsequently sheared by sonication into DNA fragments of approximately 200-500 base pairs (bp). Cross-linked DNA fragments associated with NFAT2 are then selectively immunoprecipitated from cell debris using an &#945;NFAT2 antibody. After purification, associated DNA fragments are detected via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA sequences with evident enrichment represent regions of the genome which are targeted by NFAT2 in vivo. Appropriate shearing of the DNA and the selection of the required antibody are particularly crucial for the successful application of this method. This protocol is ideal for the demonstration of direct interactions of NFAT2 with target genes. Its major limitation is the difficulty to employ ChIP in large-scale assays analyzing the target genes of multiple transcription factors in intact organisms.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the western world. NFAT transcription factors are important regulators of development and activation in numerous cell types. Here, we present a protocol for the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) in human CLL cells to identify novel target genes of NFAT2.

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Cancer Research

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Genetics

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Bioengineering

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription factors, histone modifications, and other DNA-associated proteins. ChIP-seq data can also be used to find differential binding of transcription factors in different environmental conditions or cell types. Initially, ChIP was performed through hybridization on a microarray (ChIP-chip); however, ChIP-seq has become the preferred method through technological advancements, decreasing financial barriers to sequencing, and massive amounts of high-quality data output. Techniques of performing ChIP-seq with bacterial biofilms, a major source of persistent and chronic infections, are described in this protocol. ChIP-seq is performed on Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm and planktonic cells, targeting the master biofilm regulator, CsgD, to determine differential binding in the two cell types. Here, we demonstrate the appropriate amount of biofilm to harvest, normalizing to a planktonic control sample, homogenizing biofilm for cross-linker access, and performing routine ChIP-seq steps to obtain high quality sequencing results.

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Chromatin immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing (ChIP-seq) is a method used to establish interactions between transcription factors and the genomic sequences they control. This protocol outlines techniques for performing ChIP-seq with bacterial biofilms, using Salmonella enterica serovar Typhimurium bacterial biofilm as an example.

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene transcripts from infected tissues. Pathogen RNA constitutes a tiny portion of the total RNA isolated from infected tissue samples. Both microarray and RNAseq technologies have difficulties in generating reliable reads for weakly expressed pathogen genes. Mutant pathogen strains with reduced in vivo proliferation pose an even bigger challenge. Here we describe an in vivo gene expression profiling protocol that is very fast, extremely sensitive and highly reproducible. We developed this protocol during our investigation of the fungal pathogen Candida albicans in a murine model of hematogenously disseminated candidiasis. Using this protocol, we have documented time courses of dynamically regulated C. albicans gene expression during kidney infection, and discovered unexpected features of gene expression responses to antifungal drug treatment in vivo.

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

Immunology and Infection

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble effectively in vitro. Such complexes may require co-translational assembly and the presence of molecular chaperones; either they form stable oligomers which cannot dissociate and re-associate in vitro or are unstable without a binding partner. To overcome these problems, it is possible to use a method based on the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors followed by the conventional pulldown techniques. The workflow is more time-efficient compared to traditional pulldown because it lacks the time-consuming steps of separate purification of interacting proteins and their following incubation. Another advantage is a higher reproducibility due to a significantly smaller number of steps and a shorter period of time in which proteins that exist within the in vitro environment are exposed to proteolysis and oxidation. The method was successfully applied for studying a number of protein-protein interactions when other in vitro techniques were found to be unsuitable. The method can be used for batch testing protein-protein interactions. Representative results are shown for studies of interactions between BTB domain and intrinsically disordered proteins, and of heterodimers of zinc-finger-associated domains.

Here, we describe a method for the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors, followed by the conventional pulldown techniques to study protein complexes that cannot assemble in vitro.

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Biochemistry

<meta charset="utf8"></head><body>ננו-מכונות DNAzyme מדויקות לניתוח RNA ו-DNA מפלים

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: התקדמות בננו-חיישנים של DNA – התמודדות עם אתגרי רגישות וסלקטיביות בזיהוי מולקולרי

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

שיטת צ'יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין