מחקר זה מומן על ידי עמיתי הקרן Wellcome בכיר הוענק לד&quot;ר איאן גודפלו.

1. דור של שורות תאים: pMEP4 transfection / ביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect תאים עם וקטור pMEP4 ביטוי ובחר עם 100 מיקרוגרם של hygromycin B / מ&quot;ל ​​(Roche) עד שכל התאים transfected מדומים נהרגו מעל. PMEP4 פלסמיד נשמר episomally כך שאין צורך לבודד שיבוטים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים המכילים את הווקטור pMEP4 יכול להיגרם על ידי טיפול עם 10 מיקרומטר CdCl 2 במשך 16 שעות. הביטוי inducibility חייבת להיות מאושרת על בקנה מידה קטן לפני הגברה של שורות תאים. חלבון סטפס מתויג ניתן לאתר בקלות כמו חלבון תחומים ז לאגד נוגדנים מ כמעט כל המינים. עבור בקנה מידה גדול purifications בדרך כלל 10 confluent 175 ס&quot;מ 2 צלוחיות של תאים נדרשים. זה משווה ל כ 2 X10 8 תאים המבטאים. </li></ol> 2. Lysate תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרדים תאים לתוך PBS ולשלב לתוך צינור אחד 50 מ&quot;ל. ספין 1200X GFאו 5 דקות (זה אמור להוביל 2-3 מ&quot;ל של תאים דחוסים בתור התחלה, אשר מפחית עד כ - 1.5 מ&quot;ל לאחר שטיפה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים שלוש פעמים קרה כקרח PBS (50 MLS בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים במאגר 5 מ&quot;ל תמוגה (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 125 מ&quot;מ NaCl, גליצרול 5%, 0.2% NP-40, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 25 מ&quot;מ NAF, 1 mM Na 3 VO 4 ו מעכב פרוטאז ). הערה: NAF, Na 3 VO 4 ו מעכבי פרוטאז יש להוסיף טרי. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים לפני היציאה במשך 5 דקות על קרח. מזרק מעלה מטה 5-10 פעמים באמצעות מחט קהה לפני שעזב שוב על קרח למשך 5 דקות על קרח. חזור על syringing ולהשאיר במשך 5 דקות נוספות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא להפשיר lysate פעמיים (קרח נוזלי N 2 / או יבש אתנול). אל תאפשר מדגם להגיע יותר מ 4 ° C. הערה: ניתן לאחסן את המדגם ב -80 ° C עד שיש לך זמן לעבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot מדגם לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל ולהסיר תאים unlysed ו-Debris על ידי צנטריפוגה (10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, 16,000 X ז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור supernatant, לשלב צינור 15 פלקון מ&quot;ל ו (אופציונלי) לעבור כמה 0.45 מיקרומטר סינון לפני נטילת דגימה של 20 μl כימות תשואה חלבון. הסר aliquot עוד 50 μl לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 1). </li></ol> 3. קשירה הארנב IgG-agarose (הערה: כל הספינים צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° C למשך דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend IgG-agarose ארנב פתרון (Sigma-Aldrich) על ידי מתערבל בבקבוק. קח 380 μl של IgG agarose (באמצעות קצה לחתוך 1ml פיפטה) ולהסיר משלוח / פתרון משמר ידי צנטריפוגה דקה 1. לשטוף שלוש פעמים agarose במאגר תמוגה צונן (4 ° C) באמצעות צנטריפוגה להבהיר. התשואה הסופית של agarose צריך להיות בערך 250 μl של חרוזים ארוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף lysate תא פינה מ -2.6 (ב אמבט 15 מ&quot;ל הבזה) כדי שטוף הארנב-IgG agarose ו דגירה במשך 3 שעות (או לילה) בשעה 4 ° C בעזרת מערבל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את החרוזים agarose במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 2). הערה: TAP מתויג חלבון אמור להיות מזוהה עם החרוזים. </li></ol> 4. TeV מחשוף פרוטאז (הערה: ספינים כל צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4oC דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הארנב IgG חרוזים agarose שלוש פעמים חיץ תמוגה צונן (4 ° C) באמצעות צנטריפוגה להבהיר (הערה: מאגר תמוגה לא יכילו מעכבי פרוטאז). יש להיזהר שלא להסיר או לאבד את כל החרוזים במהלך השלבים כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים כמה עוד פעמיים עם חיץ TeV-פרוטאז המחשוף (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 מ&quot;מ NaCl, ו -0.2% NP-40) באמצעות צנטריפוגה להבהיר. לאחר שטיפת האחרון בזהירות להסיר את כל liפאונד מן החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת TeV מחשוף פרוטאז, עבור מדגם זה כולל 467.5 μl H 2 O, 25 μl 20x TeV חוצץ (Invitrogen), 5 μl 0.1M DTT ו -2.5 μl (25 U) TeV פרוטאז (Invitrogen). הוסף 500 μl של תערובת זו מחשוף TeV מדגם זה של חרוזים ארז ולהעביר את התערובת כולה צינור 1.7 מראש משומנים מ&quot;ל (שחקן המשנה). לפני הדגירה להסיר aliquot μl 30 לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה פרוטאז TeV לילה ב 4 ° C בעזרת מערבל מסתובב. שים לב קצרים יותר פעמים incubations ניתן להשתמש בהתאם לאופי של חלבון הפיתיון את הנגישות של האתר מחשוף TeV פרוטאז אבל הפעם הדגירה מינימלית יש לקבוע באופן אמפירי. </li></ol> 5. קשירה Ultralink streptavidin ללא יכולת לזוז פלוס חרוזים (הערה: כל הספינים צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° C למשך דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת) </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה התגובה מחשוף TeV המכיל את IgG ארנב חרוזים agarose במשך 5 דקות בכל 1200X גרם (4 ° C). הסר aliquot 20 μl של supernatant הבהיר לניתוח (לדוגמא 4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant הנותרים (בערך 480 μl) כדי מ&quot;ל 1.5 טרי מראש משומנים צינור (שחקן המשנה) ולהשאיר את זה על הקרח. אל תזרקו את supernatant - זה מכיל חלבון הפיתיון ביקע TeV שלך כל החלבונים הקשורים מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ תמוגה צונן (סעיף 2.3) את הארנב חרוזים הנותרים IgG agarose ו resuspend. סרכזת את התערובת כדי להבהיר את החרוזים לפני הסרת supernatant ושילוב זה עם זה משלב 5.2. לעזוב את הצינור על קרח (יש עכשיו מכילים ~ 980 μl של המדגם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על IgG ארנב חרוזים agarose לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 5). הערה: אם אתה מפעיל את המדגם על ג&#39;ל SDS-PAGE (או כתם המערבי) זה ייתן הרבה רקע בשל נוכחותם של הכבד IgG ואוררשתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים בעדינות resuspend Ultralink ללא יכולת לזוז streptavidin פלוס חרוזים agarose (פירס) על ידי מתערבל את הבקבוק. באמצעות טיפ 200 פיפטה μl עם חתך בסוף, aliquot 70 μl של חרוזים streptavidin לפי המדגם לתוך מראש משומנים 1.5 צינורות מ&quot;ל ולהסיר משלוח / פתרון משמר על ידי צנטריפוגה. הערה: חרוזים אלו הם קטנים מאוד ולכן &quot;ברווז החיוב&quot; או שטוח / צרי חוד טיפים ניתן להשתמש כדי להקטין את איבוד חרוז במהלך הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים streptavidin שלוש פעמים חיץ תמוגה צונן (4 ° C) באמצעות צנטריפוגה להבהיר. זה אמור לצאת כ 45-50 μl של חרוזים ארוזים בכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant פרוטאז TeV-המחשוף (כלומר μl 980 המדגם משלב 5.3) כדי צינור המכיל את החרוזים streptavidin שטף ו דגירה במשך 3 שעות (או לילה) בשעה 4 ° C בעזרת מערבל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את החרוזים streptavidin במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant לניתוח שלאחר מכן (סםple 6). לשטוף את החרוזים streptavidin שלוש פעמים חיץ תמוגה צונן (4 ° C) באמצעות צנטריפוגה להבהיר. לאחר שטיפה של דבר, להסיר בזהירות את כל המאגר הכביסה הנותר. </li></ol> 6. ביוטין elution של פפטיד מחייב streptavidin וחלבון הפיתיון (הערה: כל הספינים צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° C למשך דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute החלבונים המתויגים מן חרוזים streptavidin על ידי הוספת 500 μl של PBS: ביוטין (1 mM D-ביוטין) ו דוגרים על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות (או לילה) בעזרת מערבל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את החרוזים streptavidin במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant לצינור מ&quot;ל 1.5 מראש משומנים (הערה: מדובר במדגם הסופי / elution (דוגמה 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עוד 500 ביוטין μl: PBS על חרוזים streptavidin הנותרות דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות (או לילה) בעזרת מערבל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדשכבול לשלב 6.2 ולשלב שני elutions (דוגמה 7). Elution זו הסופי ניתן לאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את היעילות של elution ביוטין, להקפיא את החרוזים streptavidin הנותרים ומרתיחים לאחר מכן במאגר מדגם SDS (לדוגמא 8) (המלצות: LaneMarker מדגם 5x חיץ בין הפחתת פישר). </li></ol> 7. ריכוז החלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Eluate הסופי (לדוגמא 7) צריך להיות מרוכזים לקראת ניתוח בשל ריכוז החלבון נמוכה בנפח גבוה יחסית. זה יכול להשיג באמצעות משקל מולקולרי נמוך (פחות מ 5 KDA) עמודות Vivaspin ספין (Vivascience). במטרה לרכז את עוצמת הקול כדי μl פחות מ 100. מדגם זה האחרון ניתן להרתיח ומאוחסנים במאגר מדגם חלבון (המלצות: 5x LaneMarker צמצום מדגם חיץ בין פישר). </li></ol> 8. אנליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות 1-8 יכול להיות מנותח על ידי כתם המערבי כדי לקבוע את היעילות של לנתץ. הערה: נוגדנים משני ביותר יהיהצולבות להגיב עם חלבון ה-G תחומים של חלבון איחוי אבל זה הוסר לאחר המחשוף פרוטאז TeV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא 7 ניתן לנתח על ידי 1D או 2D SDS-PAGE. צביעה ניתן לבצע באמצעות כסף או Coomassie (המלצות: מכתים SilverQuest כסף קולואידיות ערכות כחול Coomassie צביעה של Invitrogen). זיהוי החלבון ניתן לבצע באמצעות ספקטרומטר מסה. </li></ol> 9. נציג תוצאות דוגמה של ניתוח SDS-PAGE 1D של elution הסופי (לדוגמא 7) מ פרוטוקול זה לזהות שותפים מחייב של eIF4E TAP מתויג מסופק באיור 2. זה ג&#39;ל נציג משקף את האופי המורכב ורב של אינטראקציות eIF4E עם חלבונים אחרים בתא. השוואה עם שליטה שלילי הראו גם באיור 2, שנוצר מקו תא להביע רק את תג ברז, ממחישה את הייחודיות של eIF4E זה התגרה הנפתח. ב 15% זה המופע של elution הסופי מרוכז (לדוגמא7) נותח על ידי SDS-1D באמצעות זמינים מסחרית מראש יצוק ג&#39;ל הדרגתיים לפני מוכתמים באמצעות מכתים כסף Silverquest ערכת מן Invitrogen. בדרך כלל 50-85% הנותרים של elution הסופי מרוכז (לדוגמא 7) הוא ניתח עם Coomassie Colloidal כתם (Invitrogen). דוגמאות (פרוסות ג&#39;ל / להקות) מהנתיב כל חולצו ואז ונותחו על ידי ספקטרומטר מסה. החלבונים שזוהו eIF4E הנפתח סוננו נגד השותפים מחייב משליטת שלילית לזהות שאינם ספציפיים שותפים מחייב. החלבונים הסופיים זוהו באמצעות תהליך של תיוג eIF4E TAP ניתן לראות באיור 2, שהוא נציג של חלבונים רגילים שזוהו באמצעות טכניקה זו. כמו כן, מספר יחידות משנה את eIF3 זוהו גם (מידע לא מוצג). <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי שלבמקביל הליך זיקה טיהור. צעד 6 טנדם זיקה טיהור (TAP) פרוטוקול כרוך קו תא הדור, תמוגה התא, שפן IgG agarose חיסונית רטיבות, מחשוף TeV פרוטאז, streptavidin טיהור חרוז זיקה ו elution ביוטין לבסוף. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. טנדם טיהור הזיקה של חלבון eIF4E Murine. אינטראקציה שותפים של N סופני הקשה על מתויג eIF4E טוהרו מ HEK293 התאים האיקריוטים באמצעות פרוטוקול המצורף. חלק 20% elution הסופי (לדוגמא 7) נותח על ידי-SDS על הג&#39;ל יצוקה שיפוע 4-12% (TAP-eIF4E נתיב). ניתוח דומה בוצע עבור תג בלבד (מסלול TAP). חלבונים זוהו באמצעות צביעת כסף. החלבונים שזוהו לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה של מדגם זהה מודגשים על ג&#39;ל זה. קיצורים: eIF4G; אוקריוטים התחלת התרגום פריץ4 גמא שחקן, PABP, חלבון פולה מחייב, eIF4A: תרגום אוקריוטים ייזום גורם 4 אלפא, SBP-eIF4e: TAP הנותרים הפיתיון חלבון המכיל את פפטיד מחייב streptavidin התמזגו כדי 4E תרגום אוקריוטים ייזום גורם, 4EBPs, תרגום אוקריוטים ייזום 4E גורם מחייב חלבונים, ייזום eIF4eNiF1l אוקריוטים התרגום גורם 4E גרעינית יבוא גורם 1, SBP, פפטיד streptavidin שנותר מחייב מ פפטיד TAP TeV unfused.

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans.">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li><li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein,+NAP1,+affects+Rev+function.">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li><li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins.">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep&#47;FLAG+(SF)-TAP+tag.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep&#47;FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li><li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP/USP7.">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li><li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li><li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factor+4E.">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תיוג TAP אייר הטכניקה כאן מדגים שיטה ספציפית מאוד מחמירים של בידוד השותפים מחייב של חלבונים בתאים האיקריוטים הפיתיון. גישה זו ניתן ליישם גם חלבונים תאיים ווירוסים. למיטב ידיעתנו, זוהי הפעם הראשונה כגון טכניקת הוחל eIF4E התחלת התרגום גורם. זיהוי eIF4G ידוע eIF4E חלבונים מחייב את 4EBPs באמצעות טכניקה זו מאשרת את תקפותה של גישה כזאת. בנוסף, זיהוי של הרכיב הנותר של המתחם eIF4F, כלומר eIF4A, ו PABP מאשר כי האינטראקציה עקיפה מתחמי שלישוני נותרו על כנן במהלך תהליך טיהור. זיהוי isoforms מרובות של החלבונים קנוניים מחייב eIF4e ניכרה גם. אלה מתוארים בפירוט רב יותר באיור 2. לגבי המגבלות של הגישה, טיפול מסוים יש לנקוט לגבי הבחירהשל חלבון הפיתיון ואם לא למקם את תג TAG ב-N-C או הסופית. זה יכול להיות מומלץ לבצע assay תפקודית או לבחון את הלוקליזציה של החלבון היתוך על ידי מיקרוסקופ לפני טיהור בהיקף מלא כדי להבטיח את הנגזרת מתויג הוא פונקציונלי. קרום נפרד או חלבונים גרעיני לא בהכרח שפורסמו על ידי התנאים חומר ניקוי עדין יחסית המתוארים בשלב תמוגה. כמו בכל immunoprecipitations ו דומים הנפתח מבחני, שינוי יכול להתבצע לטבע ריכוזים של חומר ניקוי במאגר תמוגה כדי להגביר את היעילות של תמוגה. ריכוז יוני של מאגרים תמוגה ולהתרחץ גם להיות שונה כדי להגדיל או להקטין את ההחמרה של טיהור. כמו כן ניתן לבצע טיהור ראשוני בתנאים קלים רגילים (כמתואר לעיל), אך לאחר מכן מחלקים את החרוזים streptavidin (סעיף 5.8) לתוך aliquots 4-5, שיכולים לאחר מכן להיות שטופים תחת קון יונית הגדלתditions. זה עשוי לאפשר למשתמש לזהות את התנאים האופטימליים, כי להסיר שאינם ספציפיים חלבונים אינטראקציה. התהליך כולו עשוי גם להתבצע באמצעות transfection חולף שבו השותפים באינטראקציה ידועים ונוכחותם או היעדרם נקבע על ידי כתם המערבי לאחר מכן בלבד. במקרה זה הייתי מציע שתי מנות של 100 ס&quot;מ 2 תאים כל transfected עם מיקרוגרם 8 הביטוי פלסמיד. הליך זה שונה הוא השימוש בפרט כאשר בוחנים את היכולת של נגזרים מוטציה של חלבון TAP-Fusion לתקשר עם בני זוג ידועים מחייב. ניתוח הדגימות 1 עד 8 על מוכתמים כסף SDS-עמוד ג&#39;ל (או על ידי כתם המערבי אם נוגדן זמין) היא דרך מצוינת של פתרון בעיות, טכניקה לא תצליח להפיק תוצאות מתקבלות על הדעת. היעילות של משקעים כל זיקה מבוסס elution ספציפי ניתן לנתח שימוש בגישה זו דגימה שיטתית. דוגמאות אחד עד שמונה יש לנקוט במהלך optimשנפלו על הקרקע הפורייה של פרוטוקול לפיתיון כל חדש. הטכניקה תיוג TAP מספק אלטרנטיבה חזקה ויציבה לגישות אחרות כגון GST למשוך ומורדות, שמרים שני מבחני היברידיות וכו &#39;טיהור זיקה כפולה צעדים elution ספציפיים (מחשוף TeV ו elution ביוטין) לספק הספציפיות להחמיר כדי להישמר רמה גבוהה לאורך כל תהליך טיהור. קשה טכניקה זו ניתן להחיל על כל חלבון ולכן מייצג שיטה מצוינת לזיהוי שותפים מחייב עבור היעד חלבון של עניין.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> רוש </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> הארנב IgG agarose </td><td> סיגמא </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TeV פרוטאז </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז קוקטייל </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> Ultralink ללא יכולת לזוז streptavidin חרוזים פלוס </td><td> לנקב </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 concentrator צנטריפוגלי (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest כסף ערכת צביעה </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex Colloidal כחול Coomassie ערכת צביעה </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> צינורות prelubricated 1.7ml</td><td> שחקן המשנה </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Microcapillary טיפים פיפטה </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4-12% Bis-טריס צבע ג&#39;ל </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> מאגר 5x SDS לדוגמא </td><td> דיג </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

שלב קריטי ולעיתים קרובות הגבלת בהבנת תפקידו של המארח חלבונים נגיפיים הוא זיהוי של אינטראקציה שותפים חלבונים תאיים או ויראלי. ישנן גישות רבות המאפשרות את הזיהוי של בני הזוג אינטראקציה, כולל מערכת שמרים 2 היברידית, כמו גם למשוך את מבחני באמצעות חלבונים רקומביננטי ו immunoprecipitation של חלבונים אנדוגניים ואחריו זיהוי ספקטרומטריית מסה 1. מחקרים שנעשו לאחרונה הדגיש את התועלת של טיהור פעמיים זיקה בתיווך תג, יחד עם שני צעדים elution ספציפיים זיהוי של חלבונים אינטראקציה. גישה זו, כינה טנדם טיהור זיקה (TAP), שימש בתחילה בשמרים 2,3 אך לאחרונה הותאם לשימוש בתאי יונקים 4-8. כהוכחה מושג של הקמנו טיהור זיקה טנדם (TAP) שיטה באמצעות היטב מאופיין אוקריוטים תרגום ייזום FACטור eIF4E 9,10. eIF4E הסלולרי גורם התרגום הוא מרכיב קריטי של המתחם eIF4F הסלולר מעורב בייזום יתר תלויה התרגום 10. תג TAP השתמשו במחקר הנוכחי מורכב משני יחידות ז חלבון פפטיד מחייב streptavidin מופרדים על ידי וירוס Etch טבק (TeV) מחשוף רצף פרוטאז. תג TAP השתמשו במחקר הנוכחי מורכב משני יחידות ז חלבון פפטיד מחייב streptavidin מופרדים על ידי וירוס טבק Etch (TeV) מחשוף פרוטאז רצף 8. לוותר על הצורך של הדור של שורות תאים משובטים, פיתחנו שיטה מהירה שמסתמכת על הביטוי של החלבון-TAP מתויג הפיתיון מן הפלסמיד שמרו episomally מבוסס על pMEP4 (Invitrogen). ביטוי eIF4E Murine מתויג מזה פלסמיד נשלט באמצעות קדמיום כלוריד מושרה האמרגן metallothionein. תמוגה של התאים המבטאים וטיהור זיקה לאחר מכן באמצעות קשירה Rabbit IgG agarose, מחשוף TeV פרוטאז, קשירה streptavidin agarose צמודות elution ביוטין לאחר מכן זיהו חלבונים ספציפיים רבים, ככל הנראה, eIF4E הנפתח (בהשוואה לשלוט שורות תאים המבטאים את תג TAP לבד). זהותם של חלבונים התקבלו על ידי כריתה של להקות מ 1D ספקטרומטריית SDS-PAGE ובעקבות המוני במקביל. המרכיבים שזוהו כללו את החלבונים eIF4E ידועים מחייבים eIF4G ו 4EBP-1. בנוסף, רכיבים אחרים של המתחם eIF4F, מתוכם eIF4E הוא מרכיב זוהו, כלומר eIF4A פולי ו-חלבון מחייב. היכולת לזהות לא רק בני זוג ידועים מחייבים ישיר, כמו גם חלבונים אינטראקציה משניים, מדגישה עוד יותר את התועלת של גישה זו באפיון של חלבונים של תפקוד לא ידוע.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification at JoVE.com

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

identification-protein-interacting-partners-using-tandem-affinity

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

37.4K Views.  Imperial College London. טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

Video: Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Tandem Affinity Purification Assay to Study Protein-Protein Interactions

Source: Ma, Z., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55236">Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates tandem affinity purification &#8212; a technique to purify protein complexes from eukaryotic cells to study protein-protein interaction. The complex contains two proteins labeled with different epitope tags. Upon the purification of the complex using two resins with an affinity for the two different tags in a sequential manner, the presence of both proteins in the elute confirms the interaction between the two.

בדיקת טיהור זיקה טנדם לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Source: Ma, Z., et al. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates tandem ...

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video