Name: resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).

<ol>
	<li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+(CCM3)+protein.">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li><li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking,+mass+spectrometry,+and+bioinformatics.">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions.">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li><li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure.">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li><li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li><li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes.">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes.">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li><li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+activator+Mirk/Dyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha/beta+MAP+kinase.">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li><li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+soluble+protein+complexes.">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li><li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics.">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li><li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE/LC-MS/MS+and+clustering+methods.">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li><li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry.">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li><li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+(NuRD)+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells.">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+(Wnt)+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li><li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex.">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+(NuRD)+complex.">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li><li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+WDR5+interaction+(Win)+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases.">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics.">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners.">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן, אנו מתארים את שימוש טיהור זיקה ואחריו ג&#39;ל אלקטרופורזה כחולה מקורית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כמותית כדי לפתור קומפלקסי חלבונים. גישה זו מציעה שיטה לפענח רשימות אינטראקצית חלבון חד ממדיות לתוך אסיפות חלבון פונקציונליות. אנחנו מדגימים את השיטה מבוססת על שימוש חלבונים-tagged אפיטופ. עם זאת, אם שורת תאי מבטאי חלבון מתויג אינה זמינה, אלטרנטיבה יכולה להיות להשתמש נוגדנים כנגד החלבון של עניין, בתנאים שיש פפטיד זמין להשיג elution התחרותי ילידים. כמות של חומר המוצא וכמות חרוזים ייתכן שיהיה צורך לשנות בהתאם לרמת הביטוי של חלבון המטרה. אנחנו בדרך כלל לבצע פרוטוקול זה עם 2-5 x 10 8 תאים חומר מוצאים, וזה מספיק אפילו בשביל חלבונים עם רמת ביטוי נמוכה. רכב חיץ תמוגה צריך להיבחר באופן אמפירי כדי להשיגליד כדי להשלים solubilization של פיתיון. זה עשוי להיות מאתגר עבור סוגים מסוימים של חלבונים, ב הכרומטין מסוים או חלבונים בממברנה מחייב. אפשרויות חלופיות כוללות הגדלה כמות מלח, ובלבד מורכב החלבון נחקר הוא יציב מלח גבוה, או באמצעות sonication ו / או טיפול nuclease עבור חלבוני מחייב הכרומטין 20, 29. במקרה של חלבונים בממברנה, מיתוג דטרגנט DDM או digitonin עשוי להיות רצוי 30. במקרה של ה- DNA מחייבת חלבונים, כדאי לכלול nuclease כגון benzonase במהלך שלב טיהור 20. הסרה מלאה של חומצות גרעין מבטיחה כי האינטראקציות זוהו להתרחש בין חלבונים ואינם בתיווך DNA. מרכיב קריטי להביא בחשבון בעת ​​השימוש בגישה זו היא היציבות של המתחם תחת חקירה. ההליך הוא ארוך עשוי להיות כרוך preservinגרם חלבון הלילה מורכב. השגנו הצלחה טובה עם שני מתחמי שיפוץ הכרומטין (ד בודה ומ פרדו, מידע לא מוצג), אבל זה צריך להיבדק. צעד טיהור הזיקה עשוי להתקצר אם נדרש. טכניקות חלופיות שיאפשרו חלוקה מקורית, כגון כרומטוגרפיה הדרה גודל, כבר בשימוש נרחב במשך 50 שנים לאפיין קומפלקסים חלבונים. אנחנו ואחרים הראו כי ההחלטה של עמוד כחול יליד עדיפה על זו מושגת באמצעות כרומטוגרפיה הדרה גודל 20, 31, 32, 33. יתרון נוסף של עמוד כחול ילידים הוא שזה לא דורש מערכות כרומטוגרפיה, שהם יקרים, אלא משתמש בציוד חלבון electrophoretic כי הוא נפוץ במעבדות. במונחים של הידיים על הזמן, שיטה זו אינה כרוכה בעבודה יותר מ א geLC-MS / MS המסורתיתpproach או חלוקת כרומטוגפיות מחוברת. עם זאת, כפי הטכניקות החלוקות ביותר לעשות, יש לו גבול הרזולוציה שלהם. מתחמים כי הם מאוד הומוגנית או קרובים במסה וצורה עשויים להיות מעבר ברזולוציה שמציעה עמוד ילידי כחול, ומכאן בפרוטוקול כפי שדווח כאן לא יכול להיות מוצלח אוניוורסלי בפתרון מתחמים מובהקים עם יחידות משנה משותפות. בנימה מעודדת, היינו מצליחה להפריד שני מתחמי tetrameric דומים מאוד שיתוף שלוש יחידות משנה (M. פרדו, כתב יד בהכנה). מאז ספקטרומטריית מסה הפכה רגישה יותר ויותר, אפילו בכמויות זעירות של interactors שאינו ספציפי ומזהמים ניתן בדגימות AP-MS. הגישה המוצגת כאן עשויה לסייע אפלית interactors אמיתי מפני זיהום רקע בתחום טיהור הזיקה ידי התמקדות תשומת הלב על חלבונים עם פסגות הגירה בקנה אחד עם פסגות הגירת פיתיון על משקל מולקולרי גבוה יותר מזה שלחלבוני monomeric. מספר קבוצות השתמשו בטכניקות חלוקות ואחריו פרופיל מתאם חלבון להתוות קומפלקסי חלבונים בקנה מידה הסלולר ללא צורך בבידוד קודם 10, 11, 12, 34. עם זאת, זה יכול לגרום לכשל לזהות אינטראקציות תת-stoichiometric. השילוב של צעד העשרה באמצעות טיהור זיקה יכול לעזור להתגבר על זה. הגישה המתוארת כאן צריכה להיות שימושית בדרך כלל בשביל לחקור את הטופולוגיה של קומפלקסים חלבוניים לפרום את המתחמים המרובים חלבון נתון לוקח חלק בתוך אותה בהקשר הסלולר. האסטרטגיה היא פשוט מקובל המעבדות כי לא יכול להיות ציוד חלוקת כרומטוגפיות יקר כדי לפתור קומפלקסי חלבונים.

בתאים, רוב החלבונים תפקידיהם באמצעות אינטראקציות חלבון-חלבון חולף או על ידי יצירת מכלולים חלבון יציב. אפיון אינטראקציות חלבון חיוני בתהליכים תאיים הבנה לחלוטין. טיהור זיקה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (AP-MS) היא אחת האסטרטגיות ביותר מיושמות כלל לזהות אינטראקציות חלבון ילידים. שיפורים משמעותיים ביכולות מכשיר השיגו בעשור האחרון הפכו גישה זו עצמה אדירה. חשוב לציין כי האינטראקציות שזוהו על ידי ניסויי AP-MS כוללות תערובת של עמותות ישירות ועקיפות בין הפיתיון פושט. בנוסף, לעתים קרובות חלבונים להשתתף בכמה מתחמים שונים בתוך אותו בהקשר הסלולר, אשר עשוי להיות תפקידים ביולוגיים שונים, ולכן interactors שמזוהים על ידי AP-MS אולי מייצגות מגוון של מכלולי חלבון נפרדים או ישויות פונקציונליות. לא ניתן לגזורמידע טופולוגי כאלה מראש מהרשימות מונו-ממדי של החלבונים שיוצרים ניסויי AP-MS פשוט. עם זאת, הטכניקה ניתן לניצול נוסף כדי להגדיר את הארכיטקטורה של קומפלקסי חלבונים על ידי שילוב עם שיטות אחת או יותר כדי לפתור מכלולים אלה. על מנת לפתור את הטופולוגיה של אינטראקציות חלבון המזוהות באמצעות AP-MS, מספר אסטרטגיות יושמו. גישה אחת היא לבצע ניסויי AP-MS איטרטיבי באמצעות הפושט מזוהה בסיבוב קודם של ניסויים כמו פיתיונות 1. למרות מאוד אינפורמטיבי, זה בהחלט משימת עבודה אינטנסיבית הוא בניסוי ומדוקדק. חלבון cross-linking בשילוב עם ספקטרומטריית מסה נמצא בשימוש יותר ויותר כדי להפיק מידע טופולוגי על קומפלקסים חלבונים 2, 3, 4, 5. עם זאת, computatioניתוח סופי של פפטידים צולבים עדיין נותר משימה מאתגרת ולכן הוא צוואר הבקבוק בתהליך העבודה. הופעתו של ריאגנטים MS-cleavable cross-linking צריכה להקל מיפוי של שאריות חומצת אמינו הנמצאות בסמיכות אינטראקצית חלבונים 6, 7. חלופה נוספת היא לשלב טיהור זיקה עם טכניקות הפרדה מאונכות לפני 8, 9. חלוקת זיהוי תכונות חומרים על ידי סינון ג&#39;ל או החלפת יונים, או חלוקת שיפוע סוכרוז יש גם לאחרונה נעשתה שימוש בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כמותית לתאר מתחמי multiprotein ברמה מערכתית, על ידי עקיפת שלב הבידוד המורכב 10, 11, 12, 13. ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי כחול (BN-עמוד) יושמה באופן נרחבלחקור אינטראקציות חלבון מקומיות, בדרך כלל אלה בקומפלקסי חלבון קרום המיטוכונדריה 14. טכניקת פרדה זו גם שמשה לאחרונה בשילוב עם כימותי חלבון ללא תווית ו פרופיל מתאם, לא רק על מתחמי המיטוכונדריה 15, 16, 17, אלא גם עבור התרת קומפלקסי חלבונים אחרים מתאי כולה 18, 19. החוקרים שערו כי השילוב של טיהור זיקה עם גישות חלוקות מקורות עוקבות וכמותיים MS אמור לספק אסטרטגיה שימושית לפתרון מכלולי חלבון מרובים המכילים חלבון מסוים. כאן אנו מתארים שיטה המשלבת טיהור זיקה מבוססת אפיטופ גנרית עם ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי הכחול של המתחמים המבודדים, ואחריו sp מסה כמותיתectrometry ו פרופיל מתאם חלבון, כדי לפתור את המכלולים המרובים חלבון עלול להיות מעורב. אנו מעסיקים תאי גזע עוברי בעכבר שבו חלבון של העניין התמזג תג epitope מתבטא מן הלוקוס אנדוגני להשיג קרוב שפע פיסיולוגי ולהבטיח ילידים יעילים בידוד מורכב. גישה זו פורמת את האינטראקציות המרובות חלבון עוסק, כדי לפתור אותן לתוך אסיפות נפרדות על פי פרופיל המתאם שלהם, בעוד שאינה מצריך עבודה יותר geLC-MS 20 הקונבנציונלי.

<table><tbody><tr><td>Protein G Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>FLAG antibody M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, protein grade, 10% solution</td><td>Millipore</td><td>655206</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl pimelimidate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80490</td><td></td></tr><tr><td>0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAG peptide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 5K NMWCO, PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0112</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td><td>Life Technologies</td><td>BN1001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Cathode Additive</td><td>Life Technologies</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>4x NativePAGE sample loading buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NativeMARK</td><td>Life Technologies</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 5% G-250 sample additive&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>BN2004</td><td></td></tr><tr><td>Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene</td><td>Thermo</td><td>249944</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HTS 96-well filtration system</td><td>Thermo</td><td>MSDVN6550</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96-well cap natural</td><td>Thermo</td><td>276002</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, sequencing grade</td><td>Roche</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant (software)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td></tr><tr><td>Perseus (software)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td></tr></tbody></table>

resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

זרימת העבודה של פרופיל מתאם חלבון יליד הכחול טיהור הזיקה ידי ספקטרומטריית מסה (ABC-MS) אסטרטגיה מתוארת באיור 7. קומפלקסים חלבונים Native סביב חלבון של עניין מבודדים על ידי טיהור זיקה באמצעות נוגדנים נגד תג אפיטופ (ב FLAG במקרה זה) ו elution תחרותי. המתחמים נפתרים על ידי BN-עמוד, ואת שביל ג&#39;ל כולה הוא נכרת לתוך 48 חלקים, והכינו עבור רובה LC-MS / MS. מידע כמותי MS משמש לצורך יצירת פרופיל ההעברה של כל חלבון מזוהה ברחבי ההפרדה ילידי כחול. חלבונים כי האינטראקציה כדי ליצור פרופילי הגירה דומים מורכבת תצוגה ברורה עם פסגות superimposable. כאשר חלבון של עניין לוקח חלק בלמעלה מ הרכבה אחד, פסגות מרובות הם נצפו פרופיל ההגירה שלה, בהינתן תת-המתחמים נמצאים בתוך כושר ההפרדה של ג&#39;ל הכחול מהקורה. השוואה שיטתית של המיגפרופילים מנה יכולה להיות מושגת על ידי מתאם חלבון פרופיל משתמש אשכולות היררכי. Dendrogram ואת עוצמות השיא עבור כל השברים הם דמיינו במפה-חום, הקלת זיהוי של אינטראקצית חלבונים ששייכים קומפלקסי חלבונים נפרדים (איור 8). השתמשנו באסטרטגיה זו כדי לנתח את השותפים באינטראקציה של Mta2, למקטע הליבה של הכרומטין NuRD שיפוץ 20 מורכבים. כפי שניתן לראות בתרשים 9, פרופיל ההגירה של Mta2 מוצג שני שיאים של עוצמות מובהקות בין 700 kDa ו 1.2 מד&quot;א, עם שיא המסה התחתון מוצג שפע גבוה. תת-יחידות ליבת NuRD אחרות, כולל Mta1 / 3, Hdac1 / 2 ו Mbd3, הראו דפוס הפרדה זהה, אם כי הפסגות לכמה יחידות המשנה, כלומר Chd4, Gatad2a / b ו- Rbbp4 / 7, היה חלוקת השפע ההפוכה (איור 9 א, B). לעומת זאת, הפרופיל של CDK2ap1, גורם רגולטורים הוא מגייס את מורכבות NuRD יזמי גן Wnt 23, הציג רק את שיא המסה הגבוה יותר (איור 9 ג), וכך עשיתי Sall4, A מדכא תעתיק כי גם הוכח לאגד 20 NuRD, 24, 25. לפיכך, החלוקה של חלבוני Mta2 הקשורים מטוהר זיקה לפי דף הכחול ילידים הצליחה לפתור שתי צורות שונות של מורכבות NuRD. גם ABC-MS מאפשרת זיהוי של interactors רומן תוך הקצאה אותם גופי חלבון מסוימים. באמצעות בחינה של אשכולות חלבונים בעוצמות שבריר מיוצג א-מפת חום זיהינו מתאם חזק בין יחידות משנה NuRD ו Wdr5, למקטע רגולטוריות של המתחם methyltransferase MLL 26, עם Wdr5 מוצגות שתי פסגות הגירה חופפות עם p שני NuRDeaks (איור 8), דבר המצביע על אינטראקציה הרומן בין Wdr5 ו NuRD. אנחנו אישר אינטראקציה זו על ידי שיתוף immunoprecipitation ושיתוף ההגירה כרומטוגרפיה הדרה גודל 20. הבחירה של חישוב מרחק מטרי של האשכולות ההיררכיים תשפיע על צורת האשכולות ומכאן המתאמים. אנו ממליצים להתנסות מדדים השונים כדי להשיג את ההתאמה הטובה ביותר עם ידע אינטראקציה קיים של החלבון או מורכבות עניין. באופן כללי השגנו את התוצאות הטובות ביותר עם מטר מרחק מנהטן (L1) 20. מתאם פירסון או מדדי מרחק האוקלידית גם דווח לזיהוי מתחמים המבוססים על טכניקות חלוקה אלטרנטיבית 10, 11, 12. קוואןנתוני titative MS המתקבל שהברים הכחולים ילידים יכולים לשמש גם כדי לקבוע את והרכב של קומפלקסי חלבונים. IBAQ ערך (כימות מוחלטת מבוסס בעוצמה) מספק מדד של השפע היחסי של החלבונים שזוהו 27, 28. ערכי iBAQ לחברי מורכב החלבון בכל שהברים בתוך שיא נדידת פרופיל מתנרמלים לזה של חלבון הפיתיון כדי להשיג כמויות יחסיות. IBAQs מנורמל פני שיא פרופיל עבור חבר מורכב חלבון נתון צריך לעקוב מגמה אופקית, ואת ערכי המגמה לשקף את והרכב של חלבוני האינטראקציה ביחס חלבון הפיתיון. לקבלת ייצוג מפורט יותר של חישובים ורכב, לראות 20. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> איור 7: עבודה סכמטי המסכם את ABC-MS יםtrategy. נתון זה שונה מ 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> איור 8. אשכולות היררכיים של פרופילי הגירת BN-עמוד של interactors Mta2. החלבונים הקשורים Mta2 הצטופפו על סמך מידת הדמיון של פרופילי ההגירה שלהם. רק קבוצת משנה של מפת החום המכילה קומפלקס NuRD מוצג (מצורף באריזת הכחול). התיבה הצהובה מדגישה את הקורלציה החזקה של Wdr5 עם מורכבות NuRD. המשקלים המולקולריים המבוארים נאמדו מן מרחקי ההגירה של סטנדרטי חלבון לרוץ באותו ג&#39;ל. מחקר זה פורסם במקור ב פרוטאומיקה מולקולרי ותאי 20 האגודה האמריקאית לביוכימיה מו<html> ביולוגית lecular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> איור 9. פרופיל הגירה BN-עמוד של יחידות משנה NuRD וחלבונים הקשורים. א) יחידות משנה Mta2 ו NuRD נוכח דפוס בעוצמה דומה. B) יחידות משנת Mta2 ו NuRD עם הדפוס העוצם ההפוך. ג) Mta2 ו Cdk2ap1, המהווה כיום רק ישות NuRD משקל מולקולרי גבוה. המשקלים המולקולריים המבוארים נאמדו מפרופיל הגירה של סטנדרטי החלבון. מחקר זה פורסם במקור ב מולקולרי ותא פרוטאומיקה 20 האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית._blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="קובץ משלימה" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> נתונים משלימים: נתונים לדוגמה. MaxQuant הנגזרות קובץ proteingroups.txt המכיל הזדהויות חלבון וערכי כימותים מניסוי ABC-MS. מחקר זה פורסם במקור ב מולקולרי ותא פרוטאומיקה 20 האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

resolving-affinity-purified-protein-complexes-blue-native-page

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.7K Views.  Wellcome Trust Sanger Institute.  כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים. 

Video: Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

CN-GELFrEE - Native נקה ג&#39;ל eluted שבר נוזלי אלקטרופורזה מילכוד

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Chemistry

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Biology

<meta charset="utf8"></head><body>מיטוב FPLC לטיהור יעיל של חלבון FEN1 המתויג שלו

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: אופטימיזציה של כרומטוגרפיית זיקה לחלבון FEN1 המתויג שלו

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

CN-GELFrEE - Native נקה ג'ל eluted שבר נוזלי אלקטרופורזה מילכוד

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

ג'ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר