1. המדעית Thermo Solaris עיצוב qPCR Assay אלגוריתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האלגוריתם משמש בעיצוב של Solaris qPCR בדיקה / פריימר זוגות אני מתאים את של כל רכיב ובכך לאפשר תנאים אופניים אוניברסלית. התאגדות של מג&quot;ב, או קטין מחייב חריץ, מחצית בתוך החללית מגבירה את אני ומאפשרת בדיקות קצרות להיות מיועד assay גמישות רבה יותר וביצועים. כפי ששמה מרמז, MGBs הם סוג של אנטיביוטיקה שיכולה להשתלב חריץ הקטין של סליל ה-DNA. MGBs המצורפים בסוף 3 או 5 של בדיקה דנ&quot;א. ב פתרון, פלואורסצנציה הכתב FAM של החללית הוא הרווה ידי מרווה Eclipse Dark. כאשר החללית נקשר ברצף היעד, וכתוצאה מכך לשנות קונפורמציה של בדיקה 3-D מאפשר אות ניאון חזק. עקידת לחקור את רצף ה-DNA היעד הוא התייצב על ידי מג&quot;ב, אשר מאפשר את השימוש, בדיקות ספציפיות מאוד קצרים, תוך שמירה על טמפרטורת ההתכה מתאים PCR. לכן, זיהוי אות מתרחשת בשלב חישול של הגברה היעד. במהלך שלב ההארכה, בדיקה מג&quot;ב disassociates ואת הקרינה הוא הרווה שוב. בגלל החללית disassociates, זה לא משפיע על יעילות ה-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפיין נוסף של האלגוריתם Solaris הוא השימוש Superbases. Superbases משתנים בסיסים שיש להם יכולות משופרות מחייב כדי לשפר את היציבות של AT אג&quot;ח לחסל GG עצמית העמותה רצפים עשירים גואנן. יתר על כן, הם אינם סמוכים להרוות fluorophores מצורף בתחנה הסופית 5. בסיסים אלה ממוקמים באופן סלקטיבי, על פי האלגוריתם, כדי להרחיב את הזמינות של רצפי היעד. זה מאפשר להשתמש רצפים, כגון אזורים GC עשיר, שאחרת היה נמנע בעיצוב primers ו בדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת האפשר, את האלגוריתם Solaris משלבת אזורים אקסון צומת פורש באתר היעד. זה מגדיל סגוליות ידי הימנעות הגברה של הדנ&quot;א הגנומי מזהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לציין, האלגוריתם מזהה גם רצף קונצנזוס של כל גרסאות אחוי ידוע, כך שכל מכוסים על ידי בדיקה יחיד / קבוצה פריימר. לכן, רק אחד assay דרוש גן מסוים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, qPCR עיצוב Solaris אלגוריתם Assay מנצל פרמטרים מחמירים מאוד שיקולים עיצוב קריטי כולל תוכן אורך GC, אני, והוא משתרע של נוקלאוטידים הומוגנית. רצפים וכתוצאה מכך הם תפציץ ניתח עבור סגוליות 3 באמצעות מאגרי מידע שונים: גנומי, תמליל, ו pseudogene. </li></ol> 2. קבלת Solaris ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג את המתאים Solaris ריאגנטים, בקר <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / Solaris</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם באתר לחץ על &quot;חיפוש GENEius המוצר&quot;. כדי לעבור ישירות לחפש את המוצר GENEius, ללכת <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בתיבת החיפוש חקירה ולבחור את האורגניזם היעד המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיפוש מוצר GENEius יכול לעבד רבים מזהים גנים שונים. הנה, הזן אחד הציע מונחי חיפוש כדי למצוא את הגן של עניין, לרבות שופט Seq ההצטרפות, מזהה ג&#39;ין, סמל ג&#39;ין, תיאור הגן, את מזהה סנגר או מספר ההצטרפות, או מספר קטלוג. לאחר מכן, לחץ על &quot;חיפוש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הגן של עניין ולחץ על &quot;בחר&quot; בצד שמאל. פעולה זו תפתח חלון המציג את המוצרים השונים Thermo Scientific זמין עבור הגן של עניין. תחת &quot;מוצרים&quot; בחר את &quot;qPCR איתור&quot; Tab. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;Assay Gene Expression סולאריס&quot; הכותרת, תוכלו לראות את אחד מעוצב בצורה אופטימלית Solaris בדיקה / assay פריימר. זה assay אחד לא לכסות את כל גרסאות אחוי ידוע היעד הגן שלך. בחרו את הכמות הרצויה. הם זמינים 100, 200, 400, ו 1000 X 25 תגובות μl (אם assay מזוהה עשה סדר, אל, את גודל חבילת 100 לא יהיה זמין). לחץ על &quot;הוסף לסל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא, בחר את תערובת אב מתאים Cycler התרמית אשר ישמשו. כדי לקבוע איזו תערובת מאסטר יעבדו הכי טוב עם המכשיר זמין, לחץ על &quot;גלה אילו מיקס מאסטר עובד הכי טוב עם Cycler PCR שלך!&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את Cycler qPCR אשר ישמשו בתפריט כדי לקבוע אילו לערבב לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל חלון החיפוש המוצר GENEius, ובחר לערבב מאסטר המתאים. תמהיל המאסטר מגיע 100, 200, 400, ו 1000 גדלים התגובה. לחץ על &quot;הוסף לסל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גנים התייחסות המוצעות cDNA Verso ערכות סינתזה יכול להיות גם הורה לניתוח qRT-PCR להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר qPCR ריאגנטים Solaris להגיע, לאחסן אותם ב -20 ° C עד מוכן לשימוש. ריאגנטים הבאות צריכות להתקבל: פתרון 20X המכיל שני primers סיפק 800 nM כל אחד בדיקה גנים ספציפיים הניתנים 200 ננומטר, sequence מידע עבור בדיקה והן primers, ו-Solaris הביטוי qPCR ג&#39;ין מיקס מאסטר בריכוז 2X. Solaris הביטוי qPCR מבחני ג&#39;ין יציבים עבור מינימום של 12 חודשים. הימנע להקפיא חזר הפשרה. </li></ol> 3. qPCR ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין פרוטוקול qPCR עם cDNA. RNA סה&quot;כ צריך להיות חילוץ באמצעות שיטה טור ספין. מדעי Thermo ערכת cDNA Verso סינתזה מומלץ שעתוק לאחור כדי ליצור cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו qPCR על ידי הפשרת primers, בדיקות, ומערבבים מאסטר על הקרח. כמו כן יש על יד מים PCR כיתה ו אטום צלחות qPCR לבן, אשר יכולים לשפר את הרגישות של ה-PCR בזמן אמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמהיל מאסטר מכיל את כל הרכיבים בפעם PCR אמיתי כולל: פולימראז Thermo-Start 1) ה-DNA, גרסה חמה ההתחלה של פולימראז הדנ&quot;א Thermoprime. סוג זה של פולימראז משמש למניעת הלא ספציפית הגברה במהלך התגובה, להגדיר דורש שלב ההפעלה על 95 מעלות צלזיוס 15 דקות. 2) dNTPs בתמהיל Solaris הורים, dTTP מחליף dUTP כדי למקסם את היעילות הגברה 3) המאגר התגובה קנייניות, מותאם לעבודה עם Solaris פריימר / מבחני בדיקה. זה חיץ תגובה מכיל צבע כחול כדי להגביר את הניגודיות בין מגיב ופלסטיק. 4) רוקס, אם המכשיר שלך דורש qPCR רוקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע פתרונות יש להפשיר, לערבב ידי מצליף הצינור (לא מערבולת). ספין אותם כדי למנוע אובדן של מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להכין 15 מ&quot;ל סטרילי צינור פלקון להגדיר את תערובת תגובה עבור הגן של עניין, ועוד אחד של הגן התייחסות, קנה המידה בהתאם למספר דוגמאות. הכינו מספיק כאלה כי שלושה משכפל יכול להיות מוכן מדגם זה, כולל שליטה אין תבנית (NTC) דגימות עקומת רגיל, אם שיטת עקומת סטנדרט ישמש לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה לרוץ על צלחת 96 היטב, לערבב את הדברים הבאים: 5 μL של מיקס מאסטר 2X Solaris qPCR, 0.5 μl של קבוצת Solaris פריימר / בדיקה (20X), ומים PCR כיתה כזה כי היקף התגובה האחרונה, פעם cDNA הוא הוסיף יהיה 25 μL. עבור כל דגימה לרוץ על צלחת 384 לערבב היטב את הדברים הבאים: 12.5 μL של מיקס מאסטר 2X Solaris qPCR, 1.25 μl של קבוצת Solaris פריימר / בדיקה (20X), ומים PCR כיתה כזה כי היקף התגובה האחרון, לאחר cDNA הוא הוסיף יהיה 10 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettor רב ערוצי, להעביר את תערובת מאסטר בארות המתאים הצלחת. צבע כחול הכלולים לערבב האב יסייע להתקדמות pipetting מעקב על הצלחות הלבנות. לאחר מכן יש להוסיף את תבנית 1-5 cDNA μL (עבור צלחת 96 באר) או 1-2 μL של תבנית cDNA (עבור 384 צלחת היטב). פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. מניחים את צלחת בצנטריפוגה ספין למטה כדי להסיר בועות, כמו אלה יפריע בקריאה פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית Cycler תרמי: האנזים חייב להיות מופעל עם 95 מעלות צלזיוס 15 דקות (1 מחזור). ואז 40 מחזורים של 95 ° C, denaturation למשך 15 שניות, חישול והסיומת ב 60 ° C למשך 60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת המכשיר qPCR. הפעל את התוכנית. </li></ol> נציג qPCR התוצאות באמצעות Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מבחני Solaris לתת זיהוי אמין גם בריכוזים נמוכים מאוד קלט, כמו להישפט על ידי היעילות PCR וערכים r2. עשר של פי 10 דילולים של cDNA מסונתז מתוך רצף RNA סינתטי amplicon או amplicon רצף הדנ&quot;א היה מוגבר על מכשיר ABI 7900HT באמצעות Solaris הביטוי qPCR Assay ג&#39;ין עבור F2RL1 או CDC20, בהתאמה. יומן בהיקף העיקולים הגברה ועקומות תקן מוצגים יחד עם הביצועים של כל assay כולל יעילות, ערך r2, טווח דינמי מתוך 10 LOG10 דילולים, ואת הגבול התחתון של זיהוי. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מבחני Solaris לתת תוצאות עקביות אפילו בין חוקרים במעבדות שונות. siRNAs מיקוד ALDOA ו PPIB, כמו גם בקרת Non-מיקוד (NTC), היו transfected לתאי הלה ב nM 100, 10, 1 ו 0.1 ריכוזי הסופי. תאים נקצרו ו-RNA בודד הכולל 48 שעות שלאחר הטיפול. cDNA היה מסונתז באמצעות Thermo Verso מדעי cDNA ערכת סינתזה. Aliquot של cDNA היה מוגבר בשתי מעבדות מופרדים גיאוגרפית באמצעות Solaris הביטוי qPCR מבחני ג&#39;ין לגילוי ALDOA, PPIB ו GAPDH על LightCycler רוש 480 (384 גם) פלטפורמה. מציאה חושבה בשיטת ΔΔCq (מנורמל ל GAPDH התייחסות גנים NTC שטופלו בתאים). רמות אותו מציאה היו הפגינו הן מטרות גנים בין שני החוקרים בשני האתרים.

המחברים של מאמר זה הינם עובדים של Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris מבחני qPCR לספק שיטה פשוטה, משופרת עבור ביצוע ניתוח qPCR. באמצעות אלגוריתם חומרה גבוהה, שילוב מג&quot;ב טכנולוגיה Superbases, אלה קבוצות פריימר ועל בדיקה למקסם את נאמנות וחוסנם של ניסויים qPCR. אחת פריימר ולהגדיר בדיקה מזהה כל גרסאות אחוי ידוע של גן מסוים. אתר היעד, במידת האפשר, כולל אזורים אקסון פורש, על מנת להבטיח כי הדנ&quot;א הגנומי לא מוגבר. תכונות אלה מאפשרות להריץ בו זמנית מספר רב של דגימות, מקטינים מאד את משך הזמן הדרוש כדי לבצע ניסויים מורכבים. מאז לערבב הראשי הוא כחול, אפשר להשתמש בצלחות אטום לבן, לשפר את הרגישות של qPCR, מבלי לאבד את תחושת pipetting. Taken הכל ביחד, את התכונות העיצוב של Assay Solaris qPCR להפוך את זה assay assay qPCR רומן פשוט, אך בעל ביצועים גבוהים, כי הוא גם ספציפי וחזק.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

QPCR הביטוי Solaris Assay ג&#39;ין הוא סוג חדש של קבוצת פריימר / בדיקה, שנועדה לפשט את תהליך qPCR תוך שמירה על רגישות ודיוק של assay. פריימר / בדיקה אלה סטים מוגדרים מראש שנועדו% 98&gt; של הגנום האנושי עכבר ושיפורים תכונה משמעותית מטכנולוגיות זמין קודם לכן. שיפורים אלה התאפשרו בזכות אלגוריתם רומן העיצוב, שפותחו על ידי מומחים Thermo Scientific ביואינפורמטיקה. מספר תכונות נוחות שולבו Assay Solaris qPCR כדי לייעל את תהליך ביצוע כמותי בזמן אמת PCR. ראשית, פרוטוקול דומה חלופות מועסקים בדרך כלל, ולכן השיטות במהלך qPCR צפויים להיות מוכרים. שנית, תמהיל הראשי הוא כחול, מה שהופך את ההגדרה תגובות qPCR קל יותר לעקוב. שלישית, התנאים רכיבה תרמית זהים עבור כל מבחני (גנים), כך שניתן להפעיל דגימות רבות בזמן וצמצום הפוטנציאל לטעויות. לבסוף, בדיקה ורצף מידע פריימר מסופקים, לפשט את תהליך הפרסום. כאן, אנו מדגימים כיצד להשיג את ריאגנטים המתאימים Solaris השימוש במוצר GENEius החיפוש תכונה למצוא באתר האינטרנט של ההזמנה (www.thermo.com / Solaris) ואת אופן השימוש ריאגנטים Solaris לביצוע qPCR בשיטה עקומה סטנדרטית.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

QPCR הביטוי Solaris מבחני ג&#39;ין הם הרומן תוכנן מראש פריימר / בדיקה qPCR שילובים שנועדו לפשט את תהליך qPCR מבלי להקריב את הספציפיות וחוסנם של assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

49.7K Views.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

Video: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Cancer Research

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

זיהוי מולקולרי באתר של קרקע בתפו Phytopathogens באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Environment

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medicine

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Immunology and Infection

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Quantifying Environmental Microorganisms and Viruses Using qPCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona 
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase chain reaction (qPCR), also known as real-time PCR, is a widely-used molecular technique for enumerating microorganisms in the environment. Prior to this approach, quantifying microorganisms was limited largely to classical culture-based techniques. However, the culturing of microbes from environmental samples can be particularly challenging, and it is generally held that as few as 1 to 10% of the microorganisms present within environmental samples are detectable using these techniques. The advent of qPCR in environmental microbiology research has therefore advanced the field greatly by allowing for more accurate determination of concentrations of microorganisms such as disease-causing pathogens in environmental samples. However, an important limitation of qPCR as an applied microbiological technique is that living, viable populations cannot be differentiated from inactive or non-living populations.
This video demonstrates the use of qPCR to detect pepper mild mottle virus from an environmental water sample.

כימות מיקרואורגניזמים סביבתיים ווירוסים באמצעות qPCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase ...

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

Transcript

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video