JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מבסס מודל חולדה של הסתיידות כלי דם הנגרמת על ידי תזונה עתירת שומן (HFD) בשילוב עם ויטמין D3 (VD3). המודל שימש להערכת היעילות הטיפולית של סלידרוסיד במניעה וטיפול בהסתיידות כלי הדם, ומספק תובנות לגבי מנגנוני הפעולה הפוטנציאליים שלו באמצעות פרמקולוגיה ברשת וניסויים in vivo .

Abstract

הסתיידות כלי דם (VC) היא מצב פתולוגי קריטי הקשור לתחלואה ותמותה משמעותית. מחקר זה משתמש בגישה היברידית של פרמקולוגיה של רשת וביולוגיה מולקולרית כדי לתאר את המנגנונים הטיפוליים של סלידרוסיד (SAL), תרכובת פעילה מרודיולה קרנולאטה, כנגד VC. באמצעות כריית מסדי נתונים וניתוח רשתות, זוהו 388 מטרות SAL המצטלבות עם 2871 מטרות הקשורות ל-VC, וכתוצאה מכך 208 מטרות משותפות. רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) שנבנתה באמצעות מסד הנתונים של String וניתוח טופולוגי ב-Cytoscape 3.9.1 איתרה 10 מטרות מפתח, כולל IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 ו-STAT3, בין היתר. הגנים שזוהו התרכזו במסלולי השומנים וטרשת העורקים, מה שמצביע על כך שהשיפור ב-VC על ידי SAL עשוי להתרחש באמצעות ויסות ביטוי חריג של גורמים ליפידים ודלקתיים. כמו כן, נמצא כי SAL מעכב את הביטוי החריג של גורמים דלקתיים, ובכך מפעיל את מסלול JAK2/STAT3 כדי להתערב בהתקדמות VC. מסלול JAK2/STAT3 הוא מנגנון מולקולרי מרכזי שבאמצעותו SAL מונע הידרדרות נוספת של VC. ניתוחי העשרה פונקציונליים חשפו את המעורבות של מטרות אלה בתגובות דלקתיות ובמטבוליזם של שומנים, מסלולים מרכזיים ב-VC. מחקרי in vivo בחולדות הראו את היעילות של SAL בהפחתת דיסליפידמיה ודלקת בכלי הדם, עם שיפור פרופילי השומנים בסרום ושקיעת סידן מופחתת בכלי הדם. המחקר המכניסטי, המבוסס על ניתוח כתמים מערביים, הדגים את יכולתו של סלידרוסיד לווסת את מסלול האיתות JAK2/STAT3, להדגיש את הפוטנציאל שלו כמודולטור במנגנון מולקולרי קריטי זה ולהציע מטרה טיפולית פוטנציאלית ל-VC. כוחו של מחקר זה טמון בקפדנות המתודולוגית שלו, המשלב תחזיות חישוביות עם אימות in vivo . גישה מקיפה זו מבססת מסגרת איתנה לחקר המנגנונים הטיפוליים של תרכובות טבעיות במאבק ב-VC.

Introduction

הסתיידות כלי דם (VC) מתייחסת לשקיעה לא תקינה של סידן בתוך דפנות כלי הדם, מה שמוביל להתקשות העורקים ולירידה בגמישות, ובסופו של דבר פוגע בתפקוד כלי הדם. באופן מסורתי, VC חולק לשני סוגים: הסתיידות אינטימית, הקשורה להצטברות שומנים, והסתיידות מדיאלית. הראשון קשור קשר הדוק לחדירה דלקתית, המעוררת טרנספורמציה אוסטאוגנית בדופן כלי הדם, המאופיינת בהגירה, התפשטות והתמיינות של תאי שריר חלק בכלי הדם (VSMCs) לתאים דמויי אוסטאובלסטים1.

היכולת של VSMCs לעבור התמיינות אוסטאוגנית, המושפעת מגורמים כמו הזדקנות, גנטיקה ותנאים סביבתיים כמו סוכרת ומחלת כליות כרונית, היא תורמת מרכזית ל-VC הקשור לגיל. טרנספורמציה דמוית אוסטאובלסטים זו מחמירה הסתיידות וניוון עורקים1.

VC הוא מצב רב-פנים, המונע על ידי שינויים ניווניים, חוסר איזון מטבולי ומצבים מערכתיים שונים. כ-80% מהפגיעות בכלי הדם ו-90% ממקרי מחלת העורקים הכליליים מציגים VC, מה שמגדיל משמעותית את הסיכון לאירועים קרדיווסקולריים חמורים 1,2. לכן, יש צורך דחוף לגלות טיפולים תרופתיים המקלים או הופכים ביעילות מצב זה.

נכון לעכשיו, אסטרטגיות הטיפול ב-VC כוללות התערבויות פרמקולוגיות שונות, אם כי אין תרופות שתוכננו במיוחד למטרה זו. עבור חולים עם הסתיידות קלה, סטטינים נרשמים לעתים קרובות לייצוב פלאק. עם זאת, בעוד שהם עשויים להפחית את היצרות העורקים הכליליים על ידי הורדת רמות השומנים, השפעתם על ההסתיידות מוגבלת2.

בהתחשב במורכבות של טרשת עורקים, חולים רבים מציגים הפעלת טסיות מוגברת, מה שמחייב שימוש בתרופות נוגדות טסיות כמו אספירין או קלופידוגרל כדי לעכב הצטברות טסיות ולהפחית את הסיכון לפקקת. עם זאת, טיפול באספירין מועיל רק לאנשים עם ציון סידן גבוה בעורקים הכליליים וסיכון נמוך לדימום3.

בנוסף, מחקרים על תוספי מזון, כמו ויטמין K, מצביעים על פוטנציאל למניעת התקדמות VC4. במקרים חמורים, ניתן לשקול התערבויות פולשניות, אם כי לרוב הן אינן מתאימות ל-VC5 נרחב. עבור אנשים ללא VC קיים, ניהול גורמי סיכון, כגון לחץ דם, פרופילי שומנים ובחירות אורח חיים, נותר קריטי6.

ברפואה הסינית משתמשים ברודיולה קרנולטה (Rhodiola crenulata), צמח רב-שנתי ממשפחת הקרסוליים. המרכיב הביו-אקטיבי העיקרי שלו, סלידרוסיד, זוכה לתשומת לב משמעותית בשל פעילותו הביולוגית הבולטת. סלידרוזיד ידוע ביכולתו לעכב אפופטוזיס, להפגין תכונות נוגדות חמצון חזקות ובעל תכונות אנטי דלקתיות 7,8. תכונות אלו תורמות לפוטנציאל שלו לשפר את תפקוד כלי הדם, לעכב את הזדקנות כלי הדם ולהגן על האנדותל של כלי הדם. כסוכן טיפולי פוטנציאלי ל-VC, לסלידרוזיד יש ערך משמעותי למחקר. עם זאת, המנגנונים המדויקים שבאמצעותם סלידרוסיד משפר VC עדיין לא ברורים במלואם ומצדיקים חקירה נוספת כדי לרתום את הפוטנציאל הטיפולי שלו לטיפול ב-VC.

כדי לחקור מנגנונים אלה, מחקר זה ממנף פרמקולוגיה רשתית, מתודולוגיה חדשנית המשלבת פרמקולוגיה, ביואינפורמטיקה ומדעי המחשב כדי לנתח מערכות ביולוגיות ולהבהיר מנגנוני תרופות. בהשוואה למחקר מסורתי של תרופות למטרה אחת, פרמקולוגיה של רשת מציעה גישה מקיפה יותר על ידי ניתוח השפעות התרופה על מטרות ביולוגיות ומסלולי איתות מרובים. ככלי מרכזי בפיתוח תרופות מודרניות, הוא בונה רשתות של תרופות, מטרות ומסלולים כדי לחשוף את המנגנונים הבסיסיים של פעולת התרופות 9,10. למרות השימוש הנרחב בו בחקר מנגנונים טיפוליים, היה מחקר מוגבל על המנגנונים האינטראקטיביים בין סלידרוסיד ו-VC מנקודות מבט של ביואינפורמטיקה ופרמקולוגיה רשתית.

מחקר זה בונה מפת רשת מולקולרית של ההשפעה הפוטנציאלית של סלידרוסיד על VC על ידי זיהוי וניתוח מטרות מפתח באמצעות כריית מסדי נתונים נרחבים. נוצרת רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI), וניתוח טופולוגי מיושם כדי להדגיש צמתים קריטיים בתהליך ההסתיידות.

כדי לאשר את התחזיות החישוביות, פותח מודל חולדה של VC על ידי מתן תזונה עתירת שומן עם ויטמין D3 (VD3). מודל זה משכפל את המאפיינים הפתולוגיים של קרנות הון סיכון אנושיות. פגיעה בכלי הדם מוערכת באמצעות טכניקות היסטולוגיות, פרופילי שומנים בסרום וסמני דלקת מוערכים כדי לחקור את ההשפעות המערכתיות של סלידרוסיד, והביטוי של חלבונים הקשורים ל-SAL anti-VC נמדד באמצעות Western Blotting כדי לחקור את ההשפעה של סלידרוסיד על VC המושרה בניסוי, מחקר זה נועד לתרום תובנות חשובות לגבי הפוטנציאל של תרכובת זו כאסטרטגיה טיפולית למאבק ב-VC.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת חיות הניסוי של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית (אישור מס' 2023091). מחקר זה מקפיד על הנחיות בינלאומיות, כולל הנחיות הקהילה האירופית והנחיית EEC משנת 1986, המבטיחות טיפול אתי בבעלי חיים לאורך כל המחקר. חולדות וויסטאר זכרות (8-10 שבועות, משקל 200-220 גרם) שימשו למחקר. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. חיזוי פרמקולוגיה ברשת של מטרות פוטנציאליות של סלידרוסיד-VC

הערה: פרמקולוגיה של רשת משתמשת בשיטות חישוביות וניתוח נתונים בקנה מידה גדול כדי לחקור את האינטראקציות המורכבות בין מולקולות תרופות ומטרות ביולוגיות כגון מסלולים, גנים וחלבונים בתוך אורגניזם11,12. גישה זו מסייעת לפענח את הפונקציות הביולוגיות והיחסים של הישויות הנחקרות. המתודולוגיה כוללת שימוש במאגרי מידע, עיבוד מידע כימי, רכישת נתונים ביו-אקטיביים, אחזור נתוני חלבון, ניתוח פרופילי ביטוי גנים, בניית רשתות אינטראקציה וניתוח העשרה של מסלולים11. איור 1 מציג את רשת האינטראקציה של מטרות הליבה בין סלידרוסיד להסתיידות כלי הדם.

  1. בניית מסד הנתונים של היעד "מרכיבים"
    1. השתמש ב-"Salidroside" כמילת המפתח למרכיבים לחיפוש במאגרי מידע13 (ראה טבלה משלימה 1), כגון HERB, TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA ו-STITCH.
    2. סקירת ספרות רלוונטית לזיהוי מטרות הקשורות לסלידרוזיד, כאשר המינים מוגדרים להומו ספיינס. לאחר הסרת כפילויות, תקנן את חלבוני המטרה באמצעות UniProt (ראה טבלה משלימה 1) והקים מסד נתונים מקיף של יעד Salidroside14.
  2. בניית מסד הנתונים של מטרות "מחלות"
    1. השתמש ב"הסתיידות כלי דם" כמילת המפתח לחיפוש במאגרי מידע15 (ראה טבלה משלימה 1), כולל GeneCards, OMIM, PharmGkb ו-DrugBank, כאשר המינים מוגדרים כהומו ספיינס. לאחר ביטול הכפילויות, צור מסד נתונים של יעד הסתיידות כלי דם.
  3. חיזוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות
    1. הזן את היעדים עבור סלידרוסיד והסתיידות כלי דם (ראה טבלה משלימה 1) כדי לזהות מטרות נפוצות. צור דיאגרמת ון כדי לדמיין את המטרות הטיפוליות הפוטנציאליות לסלידרוסיד בטיפול בהסתיידות כלי הדם.
  4. בניית רשת "הסתיידות חלבון-כלי דם" (PPI)
    1. אספו את המטרות הפוטנציאליות לרשימת חלבונים מרובים ונתחו אותן באמצעות STRING (ראו טבלה משלימה 1), כאשר האורגניזם מוגדר להומו ספיינס וציון האינטראקציה מוגדר לביטחון בינוני (>0.4)16. חלץ את נתוני ה- PPI בפורמט TSV להמשך ניתוח.
      הערה: בהתחשב בכך ש-85% מהגנים של חולדות הם הומולוגיים לגנים אנושיים, ומבצעים פונקציות ביולוגיות דומות, חולדות נבחרו כנבדקים ניסיוניים לאימות ההשפעות של סלידרוסיד על הסתיידות כלי דם17.
  5. בחירה ובניית רשת של יעדי מפתח
    1. ייבא את נתוני רשת ה-PPI ל-Cytoscape 3.9.1 (ראה טבלה משלימה 1) לניתוח באמצעות התוסף CytoNCA כדי להעריך פרמטרים כגון בין (BC), קרבה (CC), תואר (DC), וקטור עצמי (EC), קישוריות ממוצעת מקומית (LAC) ומרכזיות רשת (NC). בחר יעדי מפתח עם CC=1 כדי לבנות מפת ספקטרום פעולת יעד ליבה עבור 'SAL-VC'.
    2. השתמש בתוסף CytoHubba כדי לזהות את 10 הגנים המרכזיים המובילים על סמך מרכזיות מקסימלית של קליקה (MCC), רכיב שכונה מקסימלי (MNC) וחישובי מעלות, ויצירת מפת ספקטרום גנים של Hub.
  6. ניתוח העשרה במסלולי GO ו-KEGG
    1. בצע המרת מזהה גן באמצעות DAVID (ראה טבלה משלימה 1), ובחר ENSEMBL_GENE_ID עבור סוג הגן -9606 למידע על מינים. נתח את רשימת הגנים שהומרו באמצעות Omicshare (ראה טבלה משלימה 1) להעשרה פונקציונלית של GO ומסלול KEGG, עם מובהקות מוגדרת בערך P < 0.0518.
      הערה: ניתוח פונקציונלי של GO כולל תפקוד מולקולרי (MF), תהליך ביולוגי (BP) ורכיב סלולרי (CC). ניתוח מסלול KEGG כולל העשרת מסלול והעשרת סיווג מסלולים19. תוצאות ניתוח ההעשרה מתוארות באיור 2.

2. ניסויים בבעלי חיים

  1. התאקלמות
    1. התאקלמו בחולדות Wistar בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) עם מחזור אור/חושך של 12 שעות. ודא שיש להם גישה חופשית למזון ומים כדי לשמור על בריאותם לפני תחילת הניסויים. בצע האכלה אדפטיבית למשך שבוע.
  2. הקמת מודל
    1. התאקלמו את החולדות לתנאי הסביבה והקצו אותן באופן אקראי לחמש קבוצות: קבוצת ביקורת (Ctrl, ND + רכב), קבוצת מודל (דגם, HFD + רכב), קבוצת מינון נמוך SAL (SAL-L, HFD + SAL 5 מ"ג/ק"ג), קבוצת מינון גבוה SAL (SAL-H, HFD + SAL 10 מ"ג/ק"ג) וקבוצת סימבסטטין (SIM) (HFD + SIM 5 מ"ג/ק"ג).
    2. תנו דיאטה רגילה (ND) לקבוצת Ctrl ודיאטה עתירת שומן (HFD) לקבוצות הנותרות למשך כל הניסוי. ביום הראשון למתן HFD, יש להזריק מנה תת עורית אחת של 600,000 IU/kg VD3 לכל הקבוצות למעט קבוצת Ctrl20,21. לאחר מכן יש ליטול זריקות תת-עוריות שבועיות של 100,000 יחב"ל/ק"ג VD3 במשך 8 השבועות הבאים (איור 3).
    3. עקוב אחר מצב הבריאות וההישרדות של בעלי החיים מדי יום. התחל התערבויות ניסיוניות בשבוע התשיעי.
    4. המתת חסד של בעלי החיים בסיום המחקר (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). אספו דגימות סרום, אפשרו להן לעמוד במשך 30 דקות, וצנטריפוגה כדי לבודד את הסרום (בעקבות דיווחים שפורסמו בעבר20,21). יש לנתח רקמות כלי דם (אבי העורקים הבטני), ולשטוף במי מלח עם פוספט (PBS) כדי להסיר דם.
    5. תקן חלק אחד של הרקמה ב-4% פרפורמלדהיד לבדיקה היסטולוגית ואחסן חלק אחר בחנקן נוזלי לניתוח מולקולרי.
      הערה: יש לדלל סלידרוסיד במים חמים לפני השימוש.

3. הערכת פגיעה ברקמות כלי הדם באמצעות צביעת HE, VK, EVG

הערה: תקן רקמת כלי דם (אבי העורקים הבטני) ב-4% פרפורמלדהיד, מיובש באתנול לאחר 48 שעות, ומוטבע בפרפין. חותכים את גושי הפרפין המוטבעים לפרוסות של 5 מיקרומטר לצביעה של המטוקסילין-אאוזין (HE), אלסטיקה ואן גיסון (EVG) ופון-קוסה (VK), ומתבוננים במורפולוגיה ההיסטולוגית תחת מיקרוסקופ אור. צביעת HE משמשת להערכת שינויים במורפולוגיה של הרקמות. ברקמת כלי הדם, הוא מדגיש שינויים מבניים בדופן כלי הדם, כולל התפשטות תאי שריר חלק, סידור תאים לא מאורגן ודלקת. צביעת EVG מדמיינת סיבים אלסטיים וקולגן, החיוניים להערכת נזק לסיבים אלסטיים או שיפוץ ברקמת כלי הדם ומסייעים בהבנת השפעת ההסתיידות על גמישות כלי הדם. צביעת VK מזהה משקעי סידן, תכונה מרכזית ב-VC, מה שהופך אותה לקריטית להערכת היקף והתפלגות ההסתיידות ברקמת כלי הדם22,23.

  1. צביעת HE לזיהוי נזק לרקמות כלי הדם
    1. דה-פרפיניזציה והחזרת נוזלים
      1. הפחת חלקים בשני שינויים של קסילן למשך 8 דקות כל אחד והתייבש מחדש באמצעות סדרת אתנול מדורגת (100%, 95%, 85%, 75%) למשך 3 דקות לכל שלב. לאחר מכן יש לשטוף במי ברז זורמים במשך 2 דקות.
    2. מכתים המטוקסילין
      1. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין למשך 5-10 דקות ושוטפים להסרת כתמים עודפים, ולאחר מכן שוטפים במי ברז זורמים.
        הערה: מומלץ כתם בהיר של 5 דקות כדי למנוע כתמים כהים מדי, שעלולים להשפיע על הצבע הציטופלזמי.
    3. בידול
      1. הבדיל בין החלקים בתמיסת בידול למשך 30 שניות, ולאחר מכן שתי שטיפות במי ברז למשך 3 דקות כל אחת.
    4. צביעה נגדית של אאוזין
      1. מניחים את החלקים בכתם אאוסין למשך דקה. לאחר הסרת הכתם העודף, בצע התייבשות מהירה.
    5. התייבשות, הבהרה והרכבה
      1. להתייבשות מהירה, טבלו את החלקים ב-75%, 85%, 95% ו-100% אתנול למשך 3 שניות כל אחד, ולאחר מכן 100% אתנול למשך דקה.
        הערה: התייבשות מהירה מומלצת מכיוון שאאוזין עלול לאבד צבע במים ובשיפועי אתנול.
  2. צביעת VK לזיהוי סידן
    1. דה-פרפיניזציה והחזרת נוזלים
      1. בצע שלב זה לאחר שלב 3.1.1.
    2. תגובת כסף חנקתי
      1. כתם את החלקים יבשים, מתאר בעזרת מברשת עדינה וצבוע עם פון קוסה (ראה טבלת חומרים). חשפו אותם לאור אולטרה סגול למשך 4 שעות, ולאחר מכן שטפו היטב במי ברז זורמים.
    3. צביעה נגדית עם המטוקסילין
      1. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין למשך 5 דקות, שוטפים במי ברז זורמים, מבדילים ושוטפים שוב, ולאחר מכן שוטפים מי ברז זורמים.
    4. צביעה נגדית של אאוזין
      1. ייבשו את החלקים באמצעות אתנול מדורג (85% ו-95% למשך 5 דקות כל אחד), ולאחר מכן צבעו באאוזין למשך 5 דקות.
    5. התייבשות והרכבה
      1. ייבשו את החלקים באמבטיות אתנול (100% אתנול I, II, III למשך 5 דקות כל אחד) והבהירו באמבטיות קסילן (קסילן I ו-II למשך 5 דקות כל אחת). לאחר מכן, הרכיבו את החלקים עם בלסם ניטרלי.
    6. בדיקה מיקרוסקופית ולכידת תמונות
      1. בחנו את החלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ אור וצלמו תמונות לניתוח.
        הערה: ודא שמשקעי הסידן נראים חומים-שחורים עד שחורים כהים, הגרעינים כחולים והרקע אדום. הכן את תמיסת חנקת הכסף להכתמת VK טרייה מיד לפני השימוש.
  3. צביעת EVG לסיבי אלסטיות וקולגן
    1. דה-פרפיניזציה והחזרת נוזלים
      1. טפלו בקטעי הפרפין בחום למשך 50 דקות, ולאחר מכן טבלו אותם בקסילן למשך 20 דקות להסרת פרפין. המשך על ידי הכפפת החלקים לסדרת אתנול מדורגת (100%, 95%, 85%, 75%) למשך 5 דקות כל אחד, ומסתיים בשטיפה במי ברז זורמים למשך 5 דקות.
    2. צביעת EVG
      1. מרחו את תמיסת הצביעה EVG (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו לזמן קצר במי ברז זורמים למשך 5 שניות כדי להסיר כתמים עודפים.
      2. לאחר מכן, יש למרוח את תמיסת העבודה של Verhoeff (ראה טבלת חומרים) למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטיפה קצרה נוספת במי ברז זורמים למשך 5 שניות. יש למרוח את תמיסת ההבחנה של Verhoeff למשך 5 שניות עד שסיבי האלסטין נראים בבירור, ולאחר מכן לשטוף במי ברז זורמים למשך 5 שניות.
        הערה: מערבבים את הרכיבים A, B ו-C (מסופקים בערכה הזמינה מסחרית) ביחס של 5:2:2 כדי להכין את פתרון העבודה של Verhoeff לפני השימוש. השתמש בתמיסה תוך שעתיים וחדש לפי הצורך במהלך תהליך הצביעה כדי למנוע התייבשות של החלקים.
    3. התייבשות והרכבה
      1. יבש את החלקים באמצעות סדרת אתנול מדורגת (75%, 85%, 95% ו-100%) למשך 5 שניות כל אחד, ולאחר מכן הבהרה בשני שינויים של קסילן למשך דקה אחת כל אחד. לאחר תקופת ייבוש אוויר קצרה, הרכיבו את החלקים עם בלסם ניטרלי.
    4. בדיקה מיקרוסקופית וניתוח תמונה
      1. בחן את החלקים המוכתמים במיקרוסקופ אור כדי להמחיש סיבי אלסטיות וקולגן, וצלם תמונות לניתוח לאחר מכן.

4. בדיקת פוספטאז אלקליין (ALP).

הערה: השתמש ב-ALP כאינדיקטור מרכזי להערכת היעילות של טיפולים נגד הסתיידות.

  1. הכנת ריאגנטים
    1. ממיסים את המצע מפתח הצבע במאגר קרבונט קר כקרח של 0.05 M pH 9.6 לנפח סופי של 2.5 מ"ל.
      הערה: הכן את המאגר על ידי המסת 1.59 גרם נתרן פחמתי ו-2.93 גרם נתרן ביקרבונט ב-1,000 מ"ל מים מזוקקים כפולים.
  2. דילול מצע
    1. יש לדלל 10 מיקרוליטר של תמיסת p-nitrophenol (10 מ"מ) עם 0.05 מ"מ pH 9.6 מאגר קרבונט לנפח סופי של 0.2 מ"ל כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 מ"מ.
  3. הכנת מדגם
    1. הומוגניזציה של אבי העורקים הבטני במאגר ליזה. צנטריפוגה את ההומוגנאט (~12,000 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס) ואוספים את הסופרנטנט לזיהוי פעילות ALP.
      הערה: ודא שמאגר הליזיס נקי ממעכבי פוספטאז. אחסן דגימות בדיקה ממתינות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, הימנעות ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
  4. הכנת מיקרופלייט לבדיקה
    1. הכן צלחת של 96 בארות עם בארות ריקות, סטנדרטיות ודוגמאות. הוסף 50 מיקרוליטר של התמיסה הסטנדרטית לבארות סטנדרטיות ו-50 מיקרוליטר של דגימות בדיקה ממתינות לדגימת בארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. סיום תגובה ומדידת ספיגה
    1. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובה. מדוד את הספיגה ב-405 ננומטר וחשב את פעילות ה-ALP על סמך ערכי הספיגה (בהתאם להוראות היצרן, ראה טבלת חומרים).
      הערה: בארות המכילות את התקן או דגימות עם פעילות ALP יציגו גוונים שונים של צהוב. הצבע יציב עד שעתיים.

5. קביעת תכולת סידן

הערה: קביעת תכולת הסידן היא קריטית להערכת מידת המינרליזציה ברקמות ביולוגיות.

  1. הכנת רקמות
    1. טוחנים את הרקמה לחתיכות קטנות והופכים להומוגניזציה במאגר ליזה.
  2. דילול וצנטריפוגה לדוגמא
    1. מדללים את הרקמה במאגר ליזה ביחס של 1:10. הומוגניזציה של התערובת והצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, 12,000 x גרם למשך 5 דקות. אסוף את הסופרנטנט לניתוח.
      הערה: הכן דילולים סטנדרטיים של סידן (0-1.0 מ"מ) באמצעות תמיסה סטנדרטית של סידן של 5 מ"מ (ראה טבלת חומרים).
  3. הגדרת צלחת ודגירה
    1. הוסף 50 מיקרוליטר של דגימות סטנדרטיות או בדיקה לכל באר של צלחת של 96 בארות. מוסיפים 150 מיקרוליטר של תמיסת עבודה לבדיקה, מערבבים היטב ודוגרים את הצלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מדוד את הספיגה ב-575 ננומטר ובנה עקומה סטנדרטית.
  4. חישוב תכולת הסידן
    1. חשב את תכולת הסידן באמצעות העקומה הסטנדרטית, תוך שילוב גורם הדילול, נפח הדגימה והמשקל האטומי של הסידן.

6. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA) לציטוקינים דלקתיים (IL-6, TNF-α, IL-1β)

הערה: IL-6, IL-1β ו-TNF-α הם ציטוקינים מעודדי דלקת מרכזיים המעידים על נוכחות וחומרה של תגובה דלקתית. מדידת הציטוקינים הללו חיונית להבנת התהליך הדלקתי ולהערכת יעילותם של טיפולים אנטי דלקתיים.

  1. איסוף דוגמאות
    1. יש לאסוף נסיוב מאבי העורקים הבטני של החולדה. הניחו לו להיקרש בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. צנטריפוגה את הדגימה ב-3,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואספו את הסופרנטנט.
  2. הכנת מיקרופלייט לבדיקה
    1. הכן צלחת של 96 בארות עם בארות המיועדות לתקנים ודגימות בדיקה. הוסף 50 מיקרוליטר של תקנים (ראה טבלת חומרים) בריכוזים משתנים לבארות המתאימות.
  3. הכנת מדגם
    1. הוסף 40 מיקרוליטר של מדלל דגימה לכל באר המיועדת לדגימות בדיקה. הוסף 10 מיקרוליטר מהדגימה לאותן בארות, וכתוצאה מכך דילול פי 5.
  4. דגירה עם ריאגנטים עם תווית אנזימים
    1. הוסף 100 מיקרוליטר של ריאגנטים מסומנים באנזים ספציפיים ל-IL-6, TNF-α או IL-1β לכל הבארות מלבד הריק. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  5. כביסה
    1. השלך את הנוזל מכל הבארות למעט הריק. שוטפים את הבארות בתמיסת שטיפה 1x (מוכנה כדילול פי 20 במים מזוקקים). חזור על שלב כביסה זה חמש פעמים וייבש את הבארות.
  6. התפתחות וסיומת צבע
    1. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסות מצע A ו-B (מהערכה הזמינה מסחרית, ראה טבלת חומרים) לכל באר. מערבבים בעדינות ומדגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 15 דקות. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובה.
  7. מדידת ספיגה וניתוח נתונים
    1. הגדר את הריק כאפס. מדוד את הספיגה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. צור עקומה סטנדרטית המבוססת על ערכי OD וריכוזים סטנדרטיים. חשב את ריכוזי הדגימה באמצעות אינטרפולציה והתאם את גורם הדילול.

7. בדיקת פרופיל שומנים

הערה: בדיקת פרופיל השומנים מזהה רמות שומנים חריגות, כאשר רמות שומנים גבוהות או לא מאוזנות עלולות להאיץ את הסיכון להסתיידות כלי הדם.

  1. סה"כ כולסטרול וטריגליצרידים (TC ו-TG)
    1. אסוף סרום והכן צלחת של 96 בארות עם בארות ייעודיות לדגימות בדיקה ריקות, כיול וממתינות. הוסף 2.5 מיקרוליטר של סרום, תקן כיול או תמיסה ריקה לכל באר.
    2. הוסף 250 מיקרוליטר מתמיסת העבודה לכל באר. מערבבים בעדינות ומדגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מדוד את הספיגה ב-500 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
  2. ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה וליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (LDL-C ו-HDL-C)
    1. אסוף סרום והכן צלחת של 96 בארות עם בארות המיועדות לדגימות בדיקה ריקות, כיול וממתינות. הוסף 2.5 מיקרוליטר של סרום, תקן כיול או תמיסה ריקה לבארות המתאימות.
    2. הוסף את המגיב המתאים (מגיב אחד עבור 180 מיקרוליטר או מגיב שני עבור 60 מיקרוליטר, ראה טבלת חומרים) לכל באר כמפורט בהוראות ערכת הבדיקה. דגירה בטמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) ולמשך הזמן (מגיב אחד למשך 5 דקות או מגיב שני למשך 10 דקות) המומלץ לכל מגיב.
    3. מדוד את הספיגה באורך הגל הספציפי (600 ננומטר) המצוין עבור LDL-C או HDL-C באמצעות קורא מיקרו-פלטות.

8. כתמים מערביים

הערה: כתם מערבי (WB) הוא חיוני בהערכת רמות הביטוי של חלבוני מפתח, ומאפשר זיהוי של צורות כוללות וזרחניות כאחד.

  1. הכנת רקמות
    1. שוקלים 0.05 גרם טישו ושוטפים היטב עם PBS כדי להסיר עודפי פסולת. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל 1x מעכבי פוספטאז ופרוטאז. דגרו את הרקמה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והומוגניזציה באמצעות מטחנת טישו.
  2. מיצוי חלבון
    1. אפשר לדגימה ההומוגנית לעמוד למשך דקה אחת, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ו-12,000 x גרם למשך 15 דקות. אסוף את הסופרנטנט לניתוח חלבון. קבע את ריכוז החלבון בשיטת BCA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). השתמש בעקומה סטנדרטית כדי לחשב את הריכוז.
      הערה: יש לקרר מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס לפני השימוש. מדוד את ריכוז החלבון ב-562 ננומטר.
  3. הכנת מדגם
    1. מערבבים את דגימת החלבון עם מאגר טעינה פי 5 המכיל β-מרקפטואתנול ו-SDS ביחס של 4:1. מחממים את התערובת בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנטרל את החלבונים.
      הערה: אם נדרש מאגר טעינה 1x, יש לדלל את המאגר 5x עם מאגר ליזה.
  4. הכנת ג'ל SDS-PAGE
    1. הכן ג'ל SDS-PAGE 12% והנח אותו במנגנון האלקטרופורזה. הוסף מאגר אלקטרופורזה 1x עד לסימון האמצע לפי ההוראות (ראה טבלה משלימה 2).
  5. אלקטרופורזה
    1. אחזר את דגימות החלבון מ-20 מעלות צלזיוס. טען 60 מיקרוגרם חלבון לבאר והפעל את הג'ל.
    2. הגדר את הזרם ל-50 mA למשך 20 דקות עבור ג'ל הערימה, ולאחר מכן הגדל ל-100 mA למשך 60 דקות עבור הג'ל המפריד עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית.
  6. העברת ממברנה
    1. הפעל את קרום ה-PVDF במתנול למשך 5 דקות.
    2. הרכיבו את כריך ההעברה בסדר הבא: נייר סינון → ג'ל SDS-PAGE → קרום PVDF → נייר סינון. העבירו חלבונים ב -300 mA למשך 60 דקות.
      הערה: ודא שאין בועות אוויר כלואות בין ג'ל SDS-PAGE לממברנת PVDF.
  7. חסימת
    1. דגרו את קרום ה-PVDF ב-5% BSA (מוכן ב-1x TBST) בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין למשך 60 דקות. שוטפים את הממברנה עם 1x TBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
  8. דגירה ראשונית של נוגדנים
    1. לדגור את הממברנה ב-5 מ"ל של הנוגדן הראשוני המתאים (למשל, p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB p65, NF-κB p65, IκBα) מדולל במאגר חוסם בטמפרטורת החדר למשך 2.5 שעות.
  9. דגירה משנית של נוגדנים
    1. שטפו את הממברנה עם 1x TBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים. דגירה עם הנוגדן המשני המתאים בטמפרטורת החדר למשך שעה. שוטפים שוב את הממברנה עם 1x TBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
  10. זיהוי
    1. דמיין רצועות חלבון באמצעות זיהוי כימילומינסנציה ECL24 (ראה טבלת חומרים).
  11. ניתוח צפיפות
    1. כימות רצועות חלבון באמצעות תוכנת ImageJ. עקוב אחר תהליך עבודה זה ב- ImageJ: Image → 8 סיביות → Process → Subtract Background. לנתח מדידות → סט → לנתח קנה מידה → סט. ערוך → הפוך → נתח → מדוד → תוצאות. → הקובץ שמור בשם → intDen.
    2. צור גרפים סטטיסטיים באמצעות תוכנות גרפים וניתוח סטטיסטי.
      הערה: ודא שהתוצאות עקביות בין שכפולים כדי לאמת את הממצאים.

9. ניתוח סטטיסטי

  1. אסוף וארגן נתונים באמצעות GraphPad Prism 9.0.
  2. חשב והתווה קווי שגיאה באמצעות ± SD ממוצע מנתונים גולמיים.
  3. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA חד כיווני, ואחריו מבחן הפוסט-הוק של Tukey להשוואות מרובות.
  4. קבע את המובהקות הסטטיסטית ב-P < 0.05, כאשר ערכי P קטנים יותר מצביעים על הבדלים גדולים יותר בתוצאות.

תוצאות

ניתוח פרמקולוגיה ברשת

באמצעות מאגרי מידע כגון HERB, TCMSP, Pubmed, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA ו-STITCH, זוהו 388 גני מטרה פוטנציאליים לסלידרוסיד. בנוסף, 2871 גנים פוטנציאליים הקשורים ל-VC אוחזרו ממאגרי מידע כמו GeneCards, OMIM, PharmGkb ו-DrugBank. ניתוח הצטלבות באמצעות דיאגר...

Discussion

VC מאופיין בשינויים ניווניים בתאי כלי הדם וברקמות, עם משקעי מינרלים פתולוגיים בתוך כלי הדם המובילים להתקשות דפנות כלי הדם או להיווצרות פלאק טרשת עורקים, מה שעלול לגרום למחלות כלי דם חסימתיות25. מחקרים מראים שכ-85% מפלאק VC עלול להתפתח לפקקת, שעלולה לעורר אירועים...

Disclosures

ודא שכל המחברים חשפו כל ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה כספית על ידי פרויקט המחלקה המחוזית למדע וטכנולוגיה של ג'ילין (YDZJ202301ZYTS460), ופרויקט מחלקת החינוך של מחוז ג'ילין (JJKH20230991KJ).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30% (29:1) Acrylamide/Bis SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaA1010
4% Paraformaldehyde Fix SolutionBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0099
5*loading bufferBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaP1040
Alkaline Phosphatase Assay KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0321S
AlphaView SoftwareProteinsimple Inc.USAAlphaView SA
BCA Protein Assay KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0012
Bluing SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaG1866
Calcium Colorimetric Assay KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaS1063S
Collagen Fiber And Elastic Fiber Staining Kit(EVG-Verh eff Method)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaG1597
Dewatering machineDiapath Biosciences  Ltd, ItalyDonatello
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., Ltd,ChinaJB-P5
Enzyme-labeled instrument Biotek Co., Ltd,USAEpoch
Ethanol absoluteGHTECH  Co., Ltd, China64-17-5
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) HRPBioworld technology, co, Ltd.,ChinaBS20242-Y
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software.,USAGraphPad Prism 9.0
Hematoxylin-Eosin Stain KitBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaG1120
High-density lipoprotein cholesterol assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA112
HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)Guangzhou saiguo biotech Co.,LTDA0208
Image J SoftwareNational Institutes of Health(NIH),USAImage J 
IκB Alpha Polyclonal antibodyProteintech Group, Inc.A,USA10268-1-AP
JAK2 AntibodyAffinity Biosciences Co., Ltd,ChinaAF6022
Low-density lipoprotein cholesterol assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA113
NF-κB p65 AntibodyProteintech Group, Inc.A,USA10745-1-AP
Pathological microtomeLeica Biosystems,USARM2016
Phosphatase Inhibitor Cocktail TablesF. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland04906845001
Phospho-JAK2 (Tyr931) AntibodyAffinity Biosciences Co., Ltd,ChinaAF3024
Phospho-NF-κB p65(Ser276) AntibodyAffinity Biosciences Co., Ltd,ChinaAF2006
Phospho-STAT3(S727) AntibodyAbways  Science & Technology Co., Ltd ,ChinaCY5291
Protease Inhibitor Cocktail F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland11873580001
PVDF membraneF. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland3010040001
Rat IL-1β ELISA KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaPI303
Rat IL-6 ELISA KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaPI328
Rat TNF-α ELISA KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaPT516
RIPA Lysis BufferBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0013B
SalisorosideShanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd,ChinaS25475
SDSGuangzhou saiguo biotech Co.,LTD,China3250KG001
Sodium carbonateChina National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China1001921933
Sodium hydrogen carbonateChina National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China10018960
Sodium thiosulfateChina National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China20042518
STAT3 AntibodyProteintech Group, Inc.A,USA10253-2-AP
TBST (10×)Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaST673
Total cholesterol assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA111
Triglyceride assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA110
Tris BaseGuangzhou saiguo biotech Co.,LTD1115GR500
Upright optical microscopeNikon Corporation,JapanEclipse E100
Von Kossa Solution Wuhan servicebio technology CO.,LTD,ChinaG1043
Western Blotting Luminol ReagentSanta Cruz Biotechnology, Inc. ,USASC-2048
β-Actin antibody Cell Signaling Technology, Inc.,USAE4967

References

  1. Sutton, N. R., et al. Molecular mechanisms of vascular health: Insights from vascular aging and calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (1), 15-29 (2023).
  2. Henein, M. Y., Owen, A. Statins moderate coronary stenoses but not coronary calcification: Results from meta-analyses. Int J Cardiol. 153 (1), 31-35 (2011).
  3. Ajufo, E., et al. Value of coronary artery calcium scanning in association with the net benefit of aspirin in primary prevention of atherosclerotic cardiovascular disease. JAMA Cardiol. 6 (2), 179-187 (2021).
  4. Vossen, L. M., Kroon, A. A., Schurgers, L. J., De Leeuw, P. W. Pharmacological and nutritional modulation of vascular calcification. Nutrients. 12 (1), 100 (2019).
  5. Kereiakes, D. J., et al. Principles of intravascular lithotripsy for calcific plaque modification. JACC Cardiovasc Interv. 14 (12), 1275-1292 (2021).
  6. Demer, L. L., Watson, K. E., Boström, K. Mechanism of calcification in atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 4 (1), 45-49 (1994).
  7. Chen, F., et al. Network pharmacology analysis combined with experimental validation to explore the therapeutic mechanism of salidroside on intestine ischemia-reperfusion. Biosci Rep. 43 (8), BSR20230539 (2023).
  8. Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer ags cells through the pi3k/akt/MTOR pathway. Biomed Pharmacother. 122, 109726 (2020).
  9. Zhang, P., et al. Network pharmacology: Towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), bbad518 (2023).
  10. Jiao, X., et al. A comprehensive application: Molecular docking and network pharmacology for the prediction of bioactive constituents and elucidation of mechanisms of action in component-based Chinese medicine. Comput Biol Chem. 90, 107402 (2021).
  11. Li, S., Zhang, B. Traditional Chinese medicine network pharmacology: Theory, methodology and application. Chin J Nat Med. 11 (2), 110-120 (2013).
  12. Wang, X., Hu, Y., Zhou, X., Li, S. Editorial: Network pharmacology and traditional medicine: Setting the new standards by combining in silico and experimental work. Front Pharmacol. 13, 1002537 (2022).
  13. Huang, Z., Yang, Y., Fan, X., Ma, W. Network pharmacology-based investigation and experimental validation of the mechanism of scutellarin in the treatment of acute myeloid leukemia. Front Pharmacol. 13, 952677 (2022).
  14. Zhang, R., Zhu, X., Bai, H., Ning, K. Network pharmacology databases for traditional Chinese medicine: Review and assessment. Front Pharmacol. 10, 123 (2019).
  15. Wang, C., Liu, X., Guo, S. Network pharmacology-based strategy to investigate the effect and mechanism of alpha-solanine against glioma. BMC Complement Med Ther. 23 (1), 371 (2023).
  16. Li, X., et al. Network pharmacology prediction and molecular docking-based strategy to explore the potential mechanism of Huang Lian jiedu decoction against sepsis. Comput Biol Med. 144, 105389 (2022).
  17. Holmes, R. S., et al. Recommended nomenclature for five mammalian carboxylesterase gene families: Human, mouse, and rat genes and proteins. Mamm Genome. 21 (9-10), 427-441 (2010).
  18. Geng, J., Zhou, G., Guo, S., Ma, C., Ma, J. Underlying mechanism of traditional herbal formula Chuang-ling-ye in the treatment of diabetic foot ulcer through network pharmacology and molecular docking. Curr Pharm Des. 30 (6), 448-467 (2024).
  19. Chen, X., et al. Puerarin inhibits emt induced by oxaliplatin via targeting carbonic anhydrase xii. Front Pharmacol. 13, 969422 (2022).
  20. Herrmann, J., Babic, M., Tolle, M., Van Der Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. Int J Mol Sci. 21 (6), 2204 (2020).
  21. Zhou, H., X, W., Yuan, Y., Qi, X. Comparison of methods for establishing a rat model of atherosclerosis using three doses of vitamin D3 and atherogenic diet. Chin J Arterioscler. 20 (11), 995-998 (2012).
  22. Zhang, Y., et al. Il-18 mediates vascular calcification induced by high-fat diet in rats with chronic renal failure. Front Cardiovasc Med. 8, 724233 (2021).
  23. Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic verhoeff-van gieson staining in dermatopathology. J Cutan Pathol. 40 (2), 211-225 (2013).
  24. Tang, X., et al. Underlying mechanism and active ingredients of tianma gouteng acting on cerebral infarction as determined via network pharmacology analysis combined with experimental validation. Front Pharmacol. 12, 760503 (2021).
  25. Lee, S. J., Lee, I. K., Jeon, J. H. Vascular calcification-new insights into its mechanism. Int J Mol Sci. 21 (8), 2685 (2020).
  26. Magdic, J., et al. Intracranial vertebrobasilar calcification in patients with ischemic stroke is a predictor of recurrent stroke, vascular disease, and death: A case-control study. Int J Environ Res Public Health. 17 (6), 2013 (2013).
  27. Zhou, L., et al. Salidroside-pretreated mesenchymal stem cells contribute to neuroprotection in cerebral ischemic injury in vitro and in vivo. J Mol Histol. 52 (6), 1145-1154 (2021).
  28. Hutcheson, J. D., Goettsch, C. Cardiovascular calcification heterogeneity in chronic kidney disease. Circ Res. 132 (8), 993-1012 (2023).
  29. Zhang, X., et al. Salidroside: A review of its recent advances in synthetic pathways and pharmacological properties. Chem Biol Interact. 339, 109268 (2021).
  30. Zhang, P., Li, Y., Guo, R., Zang, W. Salidroside protects against advanced glycation end products-induced vascular endothelial dysfunction. Med Sci Monit. 24, 2420-2428 (2018).
  31. Li, Y., et al. Salidroside promotes angiogenesis after cerebral ischemia in mice through shh signaling pathway. Biomed Pharmacother. 174, 116625 (2024).
  32. Gao, X. F., Shi, H. M., Sun, T., Ao, H. Effects of radix et rhizoma Rhodiolae kirilowii on expressions of von Willebrand factor, hypoxia-inducible factor 1 and vascular endothelial growth factor in myocardium of rats with acute myocardial infarction. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 7 (5), 434-440 (2009).
  33. Li, X., Liu, C., Li, Y., Xiong, W., Zuo, D. Inflammation promotes erythropoietin induced vascular calcification by activating p38 pathway. Bioengineered. 13 (3), 5277-5291 (2022).
  34. Bessueille, L., Magne, D. Inflammation: A culprit for vascular calcification in atherosclerosis and diabetes. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2475-2489 (2015).
  35. Li, R., et al. Salidroside prevents tumor necrosis factor-alpha-induced vascular inflammation by blocking mitogen-activated protein kinase and nf-kappa B signaling activation. Exp Ther Med. 18 (5), 4137-4143 (2019).
  36. Xing, S. S., et al. Salidroside attenuates endothelial cellular senescence via decreasing the expression of inflammatory cytokines and increasing the expression of sirt3. Mech Ageing Dev. 175, 1-6 (2018).
  37. Hopkins, A. L. Network pharmacology. Nat Biotechnol. 25 (10), 1110-1111 (2007).
  38. Xin, P., et al. The role of jak/stat signaling pathway and its inhibitors in diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106210 (2020).
  39. Fu, X., et al. Glycosides from buyang huanwu decoction inhibit atherosclerotic inflammation via jak/stat signaling pathway. Phytomedicine. 105, 154385 (2022).
  40. Macri, F., et al. High phosphate-induced jak-stat signalling sustains vascular smooth muscle cell inflammation and limits calcification. Biomolecules. 14 (1), 107328 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JAK2 STAT3in vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved