טכניקות Patch-Clamp לניתוח שלפוחית אנדוליזוזומלית בודדת

פרוטוקול זה מפרט שיטה למדידה ישירה של פעילות תעלות יונים על שלפוחיות תוך תאיות באמצעות מערכת מהדק טלאי אנדוליזוזומלי ידנית. אנו מדגימים את השיטה הכוללת הגדלת אנדוליזוזומים ובידוד ידני של שלפוחיות אלה. גישה זו מבטיחה שחוקרים יוכלו לשכפל וליישם במדויק את ההליך.

תעלות יונים אנדוליזוזומליות הן קריטיות להומאוסטזיס של יונים אנדוליזוזומליים ו-pH, ויסות פוטנציאל הממברנה וסחר בשלפוחית. עם זאת, גישה אלקטרופיזיולוגית לתעלות אלה בתוך שלפוחיות תוך-תאיות קטנות הייתה אתגר. הפיתוח של טכניקות מהדק טלאי אנדוליזוזומלי היה חיוני בהתגברות על מחסום זה, ואפשר מדידה ישירה של פעילות תעלות יונים בממברנות אנדוליזוזומליות.

בהשוואה לטכניקות הקיימות, מהדק טלאי אנדוליזומלי יכול להקליט בו זמנית מספר תאים ולהשתלב בקלות עם שיטות מדידה אחרות. הפעלה ידנית מציעה את היתרון של הדמיית שלפוחיות ממוקדות. זה גם מתייחס למגבלת הנוכחות ההכרחית של Ca²⁺ בצד אחד של הממברנה האנדוליזוזומלית, מה שמגדיל את הגמישות של תכנון הניסוי. שימוש בטכניקות מהדק טלאי אנדוליזוזומלי מאפשר מדידה וניתוח ישירים של פעילות תעלות יונים בתוך אנדוליזוזומים.

בהתחשב בקשר ההדוק בין תפקוד תעלות יונים אנדוליזוזומלי חריג למחלות כגון מחלות ניווניות והפרעות מטבוליות, חקירה ומווסת ערוצים אלה עשויים לחשוף מטרות תרופתיות חדשות. על ידי החזרת איזון היונים התוך-תאי, אנו עשויים להקל או לרפא מחלות קשורות. לכן, טכניקה זו חיונית לגילוי מטרות תרופות חדשות ולפיתוח תרופות רלוונטיות.

תעלות יונים ממלאות תפקיד מכריע בתהליכים פיזיולוגיים רבים. בעוד שתעלות יונים על פני השטח זכו לתשומת לב משמעותית, חשיבותם של ערוצים תוך-תאיים, במיוחד אלה שבתוך אנדוליזוזומים, מוכרת בהדרגה. המערכת האנדוליזוזומלית מורכבת מאברונים רב-תפקודיים הקשורים לממברנה המתמחים בתפקודים תאיים בסיסיים, כולל מחזור אנדוזומים (RE), אנדוזומים מוקדמים (EE), אנדוזומים מאוחרים (LE), ליזוזומים (LY) ואברונים היברידיים בעלי מאפיינים אנדוליזוזומליים ותאים אחרים, כגון פגוזומים ואוטופאגוזומים.

EE, הידוע גם בשם מיון אנדוזומים (SE), הוא אחד היעדים המוקדמים יותר לחומרים שהופנמו מממברנת הפלזמה (PM). EEs הם תאים קריטיים האחראים על מיון מטען למסלולים אנדוציטיים שונים, כגון מסלול ההתבגרות ל-LE/LY לצורך פירוק, מסלול המיחזור המהיר בחזרה ל-PM ומסלול המיחזור האיטי הכולל את תא המיחזור או ה-RE ההיקפי. גופים רב-שלפוחיתיים (MVBs) שמקורם באנדוזומים הם תאים כדוריים המוקפים בקרום מגביל, שניתן למלא בשלפוחיות תוך-לומינליות (ILVs)¹. כדי לשמור על תפקודם התקין של אברונים אלה, הם דורשים תעלות יונים ממברנות כדי לווסת את ה-pH השלפוחיתי, האוסמולריות והעברת האותות. עם זאת, מדידת הפעילות של ערוצים אלה אינה פשוטה.

עבור תעלות יונים הממוקמות על קרום הפלזמה, טכניקת מהדק התיקון שפותחה בשנות ה-70 היא כבר מזמן שיטת תקן הזהב². עם זאת, גישה לתעלות אלקטרופיזיולוגית בתוך שלפוחיות תוך תאיות קטנות נותרה אתגר. יישום תקן הזהב למדידת תעלות יונים על קרום הפלזמה לזה על אברונים תוך-תאיים עומד בפני שלושה אתגרים עיקריים. ראשית, גודלם של האנדוליזוזומים הוא בדרך כלל קטן מאוד (קוטר של פחות מ-1 מיקרומטר), מה שמקשה על התבוננות ובידוד תחת מיקרוסקופ וקטן יותר מקוטר הפתיחה של מיקרופיפטות זכוכית טיפוסיות, מה שהופך את הניסוי לבלתי ניתן לביצוע. שנית, בידוד אנדוליזוזומים ישירות מתאי המטרה תוך שמירה על שלמות האברונים דורש מיומנויות מיוחדות. שלישית, בשל היעדר שלד ציטולוגי באברונים תוך-תאיים, יצירת אטימה על הממברנה האנדוליזוזומלית בתוך פיפטת התיקון ולאחר מכן קריעתה להשגת תצורה אנדוליזוזומית שלמה יכולה להיות מאתגרת, מכיוון שהיא פוגעת בשלמות המבנית של האברון³.

פותחו מספר שיטות כדי להתגבר על בעיות אלה, כולל רישום דו-שכבתי של שומנים, שינוי רצפי מיקוד ליזוזומליים וטכניקות אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה הנתמכת על ידי מוצק (SSM או SSME). שיטת ההקלטה הדו-שכבתית של השומנים כוללת שחזור ממברנות פוספוליפידים סינתטיות עם תעלות יונים מטוהרות, המאפשרת מחקר אלקטרופיזיולוגי מפורט של תפקוד חלבון הממברנה בתנאים מבוקרים ^4,5. שינוי רצפי מיקוד ליזוזומליים בתעלות יונים כרוך בניתוב מחדש של תעלות יונים אנדוליזוזומליות לקרום הפלזמה למדידה בשיטות תיקון-מהדק קונבנציונליות⁶. טכניקות אלקטרופיזיולוגיה מבוססות ממברנה הנתמכות על ידי מוצק (SSM או SSME), הידועות גם בשם שיטת מהדק התיקון המישורי האנדוליזוזומלי, משתמשות בשבבי זכוכית מישוריים עם מצע מוצק עם פתחים קטנים (קוטר <1 מיקרומטר) בשבבי בורוסיליקט מישוריים מיקרו-מבניים. שבבי זכוכית צמצם קטנים אלה מאפשרים ניתוח של אנדוליזוזומים קטנים, אפילו ילידים, באמצעות מערכת בקרת יניקת לחץ (Nanion). עם זאת, בשתי השיטות הראשונות, תעלות היונים אינן נמצאות בסביבתן הפיזיולוגית הטבעית. ניסיונות לתעד תעלות ליזוזומליות המתבטאות על קרום הפלזמה או משוחזרות לשכבות דו-שכבתיות של שומנים הניבו במידה רבה תוצאות לא ודאיות וסותרות.

למרות שטכניקות מהדק טלאי מישוריות טיפלו ביעילות בנושא ההפרעות המלאכותיות ומציעות את היתרון של מדידות בתפוקה גבוהה, הפתרונות המשמשים מוגבלים גם בשיטה זו. טכניקת מהדק התיקון האנדוליזוזומלי שהוצגה במאמר זה יכולה להקליט בו זמנית מספר תאים ולהשתלב בקלות עם שיטות מדידה אחרות. הפעלה ידנית מספקת את היתרון של הדמיית שלפוחיות מטרה. הוא גם מתגבר על המגבלה הבלתי נמנעת של Ca²⁺ בתמיסה בצד אחד של הממברנה האנדוליזוזומלית, ומגדיל את החופש של תכנון ניסיוני³. לאחרונה, טכניקות מהדק טלאי אנדוליזוזומלי מילאו תפקיד מפתח במחקר פיתוח תרופות. לדוגמה, במחלות נוירודגנרטיביות, טכניקה זו סייעה בזיהוי תרופות חדשות המכוונות לתעלות יונים אנדוליזוזומליות הקשורות למחלות אלצהיימר ופרקינסון ^7,8. חוקרים יכולים גם להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור את תפקידן של תעלות יונים אנדוליזוזומליות בתאי גידול⁹, ובכך לשלוט בצמיחת הגידול והתפשטותו. בנוגע למחלות מטבוליות, מחקרי טלאי אנדוליזוזומלי חושפים תרכובות המווסתות את תעלות היונים האנדוליזוזומליות, ומציעות גישות טיפול חדשות לסוכרת והשמנת יתר. טכניקת התיקון-מהדק האנדוליזוזומלי מסייעת בהבנת תפקוד אנדוליזוזומלי ומציאת טיפולים פוטנציאליים⁶, משפרת משמעותית את ההבנה שלנו לגבי תפקודי תעלות היונים האנדוליזוזומליות ומקדמת גילוי מטרות תרופתיות חדשות.

1. הגדרת מכשירים

1. חומרה
   הערה: ראה איור 1 להגדרת אסדת אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטית.
   1. הגן על ההתקנה מפני הפרעות חיצוניות באמצעות שולחן וכלוב פאראדיי.
   2. השתמש במיקרוסקופ הפוך עם מיקרומניפולטור למיקום יציב של המיקרואלקטרודה.
   3. הגדר מגבר כדי לאסוף ולהגביר את האותות שנרכשו.
   4. השתמש בדיגיטייזר כדי להמיר את האותות האנלוגיים לאותות דיגיטליים.
   5. השתמש בתוכנה לאיסוף וניתוח נתונים כדי להגדיר פרוטוקולים ניסיוניים ולחלץ תוצאות משמעותיות וניתנות לניתוח מהנתונים שנאספו.
2. אלקטרודות
   1. השתמש בשתי אלקטרודות: אלקטרודת אמבטיה ואלקטרודת פיפטה.
      הערה: לפלטינה וכסף כלוריד יש את תכונות הקיטוב הטובות ביותר. אלקטרודות כסף כלוריד מורכבות מחוטי כסף או כדוריות שעברו כלוריד, ולכן יש להן שכבת AgCl על פני השטח החיצוניים של החוט או הגלולה (איור 2).
3. הכנת פיפטה
   1. מושך
      1. התקן את הצינור הנימי לתוך המושך.
         הערה: הפרמטר המשמש לייצור פיפטות להלן הוא ספציפי למכשיר. המכשיר בו השתמשנו במאמר זה מוזכר בטבלת החומרים.
      2. בתנאים ניסיוניים (טמפרטורת החדר 22 מעלות צלזיוס, חוט חימום בצורת דרך, זכוכית בורוסיליקט עם נימה) שאינם שורפים את חוט החימום, הפעל בדיקת RAMP על המושך כדי לקבוע את ערך החום (HEAT) הנדרש להמסת נימי הזכוכית.
      3. תכנן תוכנית משיכה חדשה עם שישה מחזורי משיכה נפרדים תוך שימוש בפרמטרים HEAT, מהירות (VEL) וזמן (TIME) (טבלה 1).
         הערה: HEAT מתייחס לפרמטר המחמם את חוט החימום, ומאפשר לחוט הזכוכית להמיס. מהירות מציינת את המהירות שבה המושך מושך את החוט לשני הכיוונים. הזמן מייצג את משך המרווח בין כל מחזור.
      4. לחץ על כפתור המשיכה הירוק בלוח המקשים.
      5. שחרר את ה-clampכפתור והסר את הפיפטות מהמושך.
      6. בדוק את קצות הפיפטה מתחת לעינית המיקרו-פורג' כדי לקבוע את קוטר הקצה, החדות והגיאומטריה. ודא שקוטר הקצה הוא 0.5-0.9 מיקרומטר.
         הערה: ככל שמשתמשים בחוט בתדירות גבוהה יותר, ערך החום הנדרש להמסת נימי הזכוכית ישתנה.
      7. אם גודל הקצה אינו עומד בציפיות, התאם את הפרמטרים HEAT ו-VEL. טמפרטורות גבוהות יותר ומהירויות גבוהות יותר יפיקו טיפים עדינים וארוכים יותר, ולהיפך. כוונן את ה-HEAT במרווחים של 5 מעלות ואת המהירות במרווחים של 3.
   2. ליטוש
      1. הנח את פיפטות התיקון המשוכות לתוך מחזיק המיקרו-פורג'.
      2. בדוק את קצות הפיפטה באמצעות עדשת אובייקטיבית פי 35 (בשילוב עם עינית פי 15, וכתוצאה מכך הגדלה של פי 525 ).
      3. השתמש במיקרומניפולטור כדי לקרב את פיפטות התיקון לחוט.
      4. הגדר את חוגת הטמפרטורה ל-80.
      5. השתמש במתג הרגליים כדי להפעיל את התנור ולהפעיל דופק חום קצר (1 - 2 שניות), תוך ניטור תהליך הליטוש דרך עינית המיקרו-פורג'.
      6. חזור על התהליך עד שכל הפיפטות מלוטשות.
      7. הנח את הפיפטות שהושלמו בקופסה אטומה כדי למנוע כניסת אבק.
         הערה: המטרה היא להמיס במהירות את הקצה כך שהזכוכית תשנה את גיאומטריית הקצה הסופית מבלי להפוך אותה לחדה מדי. זה מונע מהפיפטה לחדור לקרום השלפוחית עליו היא נלחצת ומקדם ביעילות היווצרות חותם. לאחר הליטוש הסופי, הנתיב הפנימי של קצה הפיפטה צריך להיות צר מאוד, ישר וליניארי.
         לפיפטות ההקלטה הטובות ביותר יש בדרך כלל התנגדות של 5 - 8 MΩ לאחר ליטוש אש. קוטר פתיחת הקצה צריך להיות 2 מיקרומטר. פיפטת תיקון מלוטשת בצורה מושלמת חיונית להיווצרות מוצלחת של ג'יגה-סיל, מכיוון שזו אחת הטכניקות המרכזיות החיוניות להצלחת ההליך.

2. הכנת מדגם

1. תרבית תאים (שימוש ב-HEK293 כדוגמה)
   1. תרבית התאים בחממה לחה סטנדרטית ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   2. תרבית תאי HEK293 ב-DMEM דל גלוקוז בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 100 U/mL פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין.
   3. הנח כיסויים מצופים פולי-ליזין 12 מ"מ בצלחת של 24 בארות.
2. הגדלת אברון
   1. הוסף 1 מיקרומטר ואקואולין-1 לתאי HEK293 בצלחת 24 הבארות (משלב 2.1) ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך הלילה עד שמתחילות להיווצר שלפוחיות מוגדלות.
      הערה: גודל האנדוליזוזומים המוגדלים יכול להגיע ל-1-10 מיקרומטר, תלוי בכלי, בתרכובת, בזמן הדגירה ובסוג התא (איור 3 וטבלה 2).
3. הכנת פתרון
   הערה: הכנת התמיסה הסטנדרטית נועדה לדמות את הריכוזים היוניים בתוך התא והאברונים. לדוגמא, הפתרונות הסטנדרטיים למדידת תעלות יונים על ליזוזומים הם כדלקמן:
   1. הכן תמיסת אמבטיה (במ"מ):140 K-methanesulfonate (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0.39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. התאם את ה-pH ל-7.2 עם KOH. התאם את האוסמולריות ל-300 mosm/L עם גלוקוז.
   2. הכן תמיסת פיפטה (במ"מ): 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. התאם את ה-pH ל-4.6 עם MSA. התאם את האוסמולריות ל-310 mosm/L עם גלוקוז.
      הערה: העבירו את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר, הכינו 45 מ"ל בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 2-4 שבועות.

3. בידוד אברון

1. הסר כיסוי עם תאים מטופלים (ראה סעיף 2) מצלחת 24 הבארות, העביר אותו לתא המיקרוסקופ והוסף 1 מ"ל תמיסת אמבטיה.
   הערה: אסור לאחסן תאים בתמיסת האמבטיה למשך > שעה עבור ניסויי מהדק טלאי אנדוליזוזומלי שלם הכוללים בידוד, איטום ורישום. לאחר שעה, האנדוליזוזומים המוגדלים יתכווצו, יידבקו לפיפטה ויהיו קשים לבידוד.
2. השתמש במחט מילוי פלסטיק תוצרת בית כדי למלא את פיפטת הבידוד בתמיסת פיפטה והתקן את הפיפטה בקצה הקדמי של התיקון-clamp התקנה.
3. הגדר את זווית התנועה האלכסונית של המיקרומניפולטור כך שתהיה קרובה ל-30° (ערך ברירת המחדל של היצרן).
4. תחת המיקרוסקופ (אובייקטיבי פי 40 ועינית פי 10), בדוק את התאים לאיתור אנדוזומים או ליזוזומים מוגדלים מספיק הממוקמים ליד קצה קרום התא לבידוד. הזז את פיפטת הבידוד קרוב לתא שנבחר.
5. הורד את פיפטת הבידוד באמצעות המיקרומניפולטור עד שהיא נוגעת בקצה קרום הפלזמה (איור 4). הזז במהירות את פיפטת הבידוד אופקית כדי לקרוע חתיכה קטנה מקרום הפלזמה.
6. בעזרת אותה פיפטה, לחץ על התא מהצד הנגדי כדי לסחוט החוצה את האנדוזום/ליזוזומים למרחק של ~2 מיקרומטר מהתא.
   הערה: אם יש שאריות של קרום התא על האברון זה עלול למנוע היווצרות של ג'יגה-סיל.
7. בדוק את האנדוליזוזום המבודד תחת המיקרוסקופ.

4. היווצרות Gigaseal

1. מלאו פיפטת תיקון מלוטשת טרייה בתמיסת הפיפטה המתאימה והתקינו את הפיפטה בקצה הקדמי של המגבר.
2. הפעל לחץ חיובי של 20 - 50 מבר על הפיפטה (או השתמש ב-0.03-0.05 מ"ל ממזרק של 1 מ"ל לבקרת לחץ) ושמור על לחץ זה (נעל את השסתום).
   הערה: 1 mbar (millibar) = 0.001 bar = 0.1 kPa (kilopascal) = 1 hPa (hectopascal) = 1,000 dyn/cm2.
3. הזזת קצה הפיפטה לתמיסת האמבטיה, במרכז שדה הראייה, ודא שהלחץ גבוה מספיק כדי לראות את הנוזל זורם לתמיסת האמבטיה.
4. הפעל פולסי זרם חוזרים ונשנים (+5 mV; 5 ms) כדי לקבוע את התנגדות הפיפטה, התנגדות האיטום והתנגדות הסדרה. עקוב אחר גודל קצה הפיפטה, היווצרות האיטום והקמת התצורה האנדוליזוזומלית השלמה.
5. הזז במהירות את הפיפטה קרוב לחלק העליון של שלפוחית המטרה. הביאו את הפיפטה ליד השלפוחית עד שהשלפוחית זזה או מתגלגלת עקב זרימת הנוזל מהפיפטה (איור 5).
6. כוונן את נפח הקיזוזtage של הפיפטה ל-0 mV. שחרר מיד את הלחץ החיובי. באופן אידיאלי, השלפוחית תימשך לכיוון הפיפטה ותתחבר לממברנה, ותיצור ג'יגה-סיל (1-20 GΩ) תוך 1 שניות.חפש ירידה ל- <10 pA של משרעת הזרם המעוררת על ידי דופק המתח של 5 mV, מה שמעיד על היווצרות ג'יגה-סיל מוצלחת.
   הערה: לחץ חיובי יציב חיוני להיווצרות ג'יגה-סיל. לפעמים, נזילות בצינורות יכולות למנוע היווצרות ג'יגה-סיל. מומלץ להשתמש במד לחץ כדי לוודא שאין נזילות. אם מתגלה נזילה, חבר מחדש את הצינור או מרח כמות קטנה של ג'לי נפט על התפרים כדי לשפר את האיטום.

5. מדידה נוכחית

1. שבירת קרום
   הערה: בהתאם לצרכי הניסוי, ניתן לסווג את מגע האלקטרודה לממברנה לארבעה אופנים: אופן מחובר לתא, אופן תא שלם, אופן מבפנים-החוצה ואופן חוץ-החוצה (איור 6).
   1. להקלטת שלפוחית שלמה, השתמש בדופק קצר במתח גבוה (דופק ZAP) של 200 מיקרון או 500 מיקרון כדי לשבור את הממברנה בנקודת המגע בין הפיפטה לאברון הגדר את המתח מ-500 mV ל-1,200 mV, וירד ב-100 mV בכל פעם עד שהממברנה מופרעת.
   2. למצב מבפנים החוצה (הקלטת ערוץ יחיד), לאחר יצירת הג'יגה-סיל, משוך את הפיפטה הרחק מהאברון, קורע חתיכה קטנה מהקרום, חושף את הצד שפונה במקור ללומן השלפוחית.
   3. למצב מבחוץ החוצה, לאחר יצירת הג'יגה-סיל ומעבר למצב השלפוחית כולו, משוך את הפיפטה הרחק מהאברון, קורע חתיכה קטנה מהקרום תוך שמירה על מבנה שלפוחית קטן.
2. הקלטה נוכחית
   1. רשום את הזרם על פני הממברנה האנדוליזוזומלית מכיוון שמתח הכניסה משתנה בניסויי מתח-מהדק-מהדק מתח אנדוליזומלי.
      1. שלוט במתחים אלה על ידי מדרגות מתח או רמפות מתח; להשתמש במגוון רחב של מתחי כניסה (למשל, -100 mV עד +100 mV) בניסויי מהדק מתח אנדוליזוזומלי.

להלן מתאר את הצורות הנוכחיות שנצפו במהלך ניסויי מהדק טלאי אנדוליזומלי. אם הצורה הנוכחית אינה כצפוי, זה יכול להיות בגלל מגע לקוי או דליפה. מגע לקוי עלול להתרחש אם אלקטרודת הייחוס אינה במגע מלא עם תמיסת האמבטיה או אם אלקטרודת הפיפטה עומדת להישבר. דליפה יכולה להתרחש אם יש פע...

למערכי ניסוי אלקטרופיזיולוגיים יש ארבע דרישות מעבדה עיקריות: א) סביבה: שיטות לשמירה על בריאות הדגימה; 2) אופטיקה: שיטות להמחשת הדגימה; 3) מכניקה: שיטות למיקום יציב של המיקרואלקטרודה; ו- iv) אלקטרוניקה: שיטות להגברה והקלטת האות.

כדי לבצע בהצלחה ניסויים אנדוליזו...

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים.

המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה, טייוואן (MOST 110-2320-B-002-022), האוניברסיטה הלאומית של טייוואן (NTU-112L7818), והמכונים הלאומיים לחקר הבריאות, טייוואן (NHRI-EX112-11119SC).