Patch-Clamp-Techniken für die Analyse einzelner endolysosomaler Vesikel

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur direkten Messung der Ionenkanalaktivität auf intrazellulären Vesikeln unter Verwendung eines manuellen endolysosomalen Patch-Clamp-Systems. Wir veranschaulichen die Methode, bei der Endolysosomen vergrößert und diese Vesikel manuell isoliert werden. Dieser Ansatz stellt sicher, dass die Forscher das Verfahren genau replizieren und anwenden können.

Endolysosomale Ionenkanäle sind entscheidend für die endolysosomale Ionen- und pH-Homöostase, die Regulierung des Membranpotentials und den Vesikeltransport. Der elektrophysiologische Zugang zu diesen Kanälen in kleinen intrazellulären Vesikeln war jedoch eine Herausforderung. Die Entwicklung endolysosomaler Patch-Clamp-Techniken hat maßgeblich dazu beigetragen, diese Barriere zu überwinden und die direkte Messung der Ionenkanalaktivität in endolysosomalen Membranen zu ermöglichen.

Im Vergleich zu bestehenden planaren Patch-Clamp-Techniken kann die endolysosomale Patch-Clamp mehrere Zellen gleichzeitig aufzeichnen und problemlos mit anderen Messmethoden kombiniert werden. Die manuelle Bedienung bietet den Vorteil, dass gezielte Vesikel sichtbar gemacht werden können. Es befasst sich auch mit der Begrenzung des unverzichtbaren Vorhandenseins von Ca2⁺ auf einer Seite der endolysosomalen Membran, wodurch die Flexibilität des Versuchsdesigns erhöht wird. Der Einsatz endolysosomaler Patch-Clamp-Techniken ermöglicht die direkte Messung und Analyse der Ionenkanalaktivität in Endolysosomen.

Angesichts des engen Zusammenhangs zwischen der Funktion aberranter endolysosomaler Ionenkanäle und Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen und Stoffwechselstörungen könnte die Untersuchung und Modulation dieser Kanäle neue Angriffspunkte für Medikamente aufdecken. Durch die Wiederherstellung des intrazellulären Ionengleichgewichts können wir damit verbundene Krankheiten lindern oder heilen. Daher ist diese Technik von entscheidender Bedeutung für die Entdeckung neuer Wirkstoffziele und die Entwicklung relevanter Medikamente.

Ionenkanäle spielen eine entscheidende Rolle bei zahlreichen physiologischen Prozessen. Während Oberflächenionenkanäle große Aufmerksamkeit erhalten haben, wird die Bedeutung intrazellulärer Kanäle, insbesondere in Endolysosomen, allmählich anerkannt. Das endolysosomale System besteht aus multifunktionalen, membrangebundenen Organellen, die auf grundlegende zelluläre Funktionen spezialisiert sind, darunter Recycling-Endosomen (RE), frühe Endosomen (EE), späte Endosomen (LE), Lysosomen (LY) und Hybridorganellen mit endolysosomalen und anderen Kompartimenteigenschaften wie Phagosomen und Autophagosomen.

EE, auch als Sortierendosomen (SE) bekannt, sind eine der früheren Adressen für Materialien, die von der Plasmamembran (PM) internalisiert werden. EEs sind kritische Kompartimente, die für die Sortierung von Fracht in verschiedene endozytäre Wege verantwortlich sind, wie z. B. den Reifungsweg zu LE/LY für den Abbau, den schnellen Recyclingweg zurück zum PM und den langsamen Recyclingweg zwischen dem Recyclingfach oder peripheren RE. Multivesikuläre Körper (MVBs), die von Endosomen abgeleitet sind, sind kugelförmige Kompartimente, die von einer Grenzmembran umgeben sind, die mit intraluminalen Vesikeln (ILVs) gefüllt werden ^kann1. Um die normale Funktion dieser Organellen aufrechtzuerhalten, benötigen sie Membranionenkanäle, um den vesikulären pH-Wert, die Osmolarität und die Signaltransduktion zu regulieren. Die Messung der Aktivität dieser Kanäle ist jedoch nicht einfach.

Für Ionenkanäle, die sich auf der Plasmamembran befinden, ist die in den 1970er Jahren entwickelte Patch-Clamp-Technik lange Zeit die Goldstandardmethode². Der elektrophysiologische Zugang zu Kanälen in kleinen intrazellulären Vesikeln ist jedoch nach wie vor eine Herausforderung. Die Anwendung des Goldstandards für die Messung von Ionenkanälen auf der Plasmamembran auf die Messung intrazellulärer Organellen steht vor drei großen Herausforderungen. Erstens ist die Größe von Endolysosomen in der Regel sehr klein (weniger als 1 μm Durchmesser), was es schwierig macht, sie unter einem Mikroskop zu beobachten und zu isolieren, und kleiner als der Öffnungsdurchmesser typischer Glasmikropipetten, was das Experiment inoperabel macht. Zweitens erfordert die Isolierung von Endolysosomen direkt aus den Zielzellen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Integrität der Organellen besondere Fähigkeiten. Drittens kann es aufgrund des Fehlens eines Zytoskeletts in intrazellulären Organellen eine Herausforderung darstellen, eine Versiegelung der endolysosomalen Membran innerhalb der Patch-Pipette zu bilden und sie dann zu zerreißen, um eine Ganz-Endolysosomen-Konfiguration zu erreichen, da dies die strukturelle Integrität der Organelle^{beeinträchtigt 3}.

Um diese Probleme zu überwinden, wurden mehrere Methoden entwickelt, darunter die Aufzeichnung von Lipiddoppelschichten, die Modifikation lysosomaler Targeting-Sequenzen und feststoffgestützte membranbasierte Elektrophysiologie (SSM oder SSME). Die Methode zur Aufzeichnung von Lipiddoppelschichten umfasst die Rekonstruktion synthetischer Phospholipidmembranen mit gereinigten Ionenkanälen, was eine detaillierte elektrophysiologische Untersuchung der Funktion von Membranproteinen unter kontrollierten Bedingungen ermöglicht ^4,5. Die Modifikation lysosomaler Targeting-Sequenzen auf Ionenkanälen beinhaltet die Umleitung endolysosomaler Ionenkanäle zur Plasmamembran zur Messung mit herkömmlichen Patch-Clamp-Methoden⁶. Bei der feststoffgestützten membranbasierten Elektrophysiologie (SSM oder SSME), auch bekannt als endolysosomale planare Patch-Clamp-Methode, werden planare Glaschips mit festem Substrat und kleinen Öffnungen (<1 μm Durchmesser) in mikrostrukturierten planaren Borosilikatchips verwendet. Diese Glaschips mit kleiner Apertur ermöglichen die Analyse kleiner, sogar nativer Endolysosomen mit Hilfe eines Druck-Saug-Kontrollsystems (Nanion). Bei den ersten beiden Methoden befinden sich die Ionenkanäle jedoch nicht in ihrer natürlichen physiologischen Umgebung. Versuche, lysosomale Kanäle aufzuzeichnen, die auf der Plasmamembran exprimiert oder zu Lipiddoppelschichten rekonstituiert wurden, haben weitgehend zu unsicheren und widersprüchlichen Ergebnissen geführt.

Obwohl planare Patch-Clamp-Techniken das Problem der künstlichen Interferenz effektiv angegangen sind und den Vorteil von Hochdurchsatzmessungen bieten, sind auch die verwendeten Lösungen durch diese Methode begrenzt. Die in diesem Artikel vorgestellte endolysosomale Patch-Clamp-Technik kann mehrere Zellen gleichzeitig aufzeichnen und leicht mit anderen Messmethoden kombiniert werden. Die manuelle Bedienung bietet den Vorteil, dass Zielvesikel sichtbar gemacht werden können. Es überwindet auch die unvermeidliche Begrenzung von Ca2⁺ in der Lösung auf einer Seite der endolysosomalen Membran und erhöht die Freiheit des Versuchsdesigns³. In jüngster Zeit haben endolysosomale Patch-Clamp-Techniken eine Schlüsselrolle in der Arzneimittelentwicklungsforschung gespielt. Bei neurodegenerativen Erkrankungen hat diese Technik beispielsweise dazu beigetragen, neue Medikamente zu identifizieren, die auf endolysosomale Ionenkanäle abzielen, die mit Alzheimer- und Parkinson-Krankheiten in Verbindung gebracht werden ^7,8. Forscher können diese Technik auch nutzen, um die Rolle endolysosomaler Ionenkanäle in Tumorzellen zu untersuchen⁹ und so das Wachstum und die Proliferation von Tumoren zu kontrollieren. In Bezug auf Stoffwechselerkrankungen zeigen endolysosomale Patch-Clamp-Studien Verbindungen auf, die endolysosomale Ionenkanäle regulieren, und bieten neue Behandlungsansätze für Diabetes und Fettleibigkeit. Die endolysosomale Patch-Clamp-Technik hilft beim Verständnis der endolysosomalen Dysfunktion und bei der Suche nach potenziellen Therapien⁶, wodurch unser Verständnis der Funktionen der endolysosomalen Ionenkanal erheblich verbessert und die Entdeckung neuer Wirkstoffziele gefördert wird.

1. Einrichtung des Instruments

1. Hardware
   HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie einen Standard-Elektrophysiologie-Rig-Aufbau.
   1. Schirmen Sie das Setup mit einem Tisch und einem Faradayschen Käfig vor äußeren Einflüssen ab.
   2. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop mit einem Mikromanipulator, um die Mikroelektrode stabil zu positionieren.
   3. Richten Sie einen Verstärker ein, um die erfassten Signale zu sammeln und zu verstärken.
   4. Verwenden Sie einen Digitalisierer, um die analogen Signale in digitale Signale umzuwandeln.
   5. Verwenden Sie Datenerfassungs- und Analysesoftware, um experimentelle Protokolle einzurichten und aussagekräftige, analysierbare Ergebnisse aus den gesammelten Daten zu extrahieren.
2. Elektroden
   1. Verwenden Sie zwei Elektroden: eine Badeelektrode und eine Pipettenelektrode.
      HINWEIS: Platin- und Silberchlorid haben die besten Polarisationseigenschaften. Silberchlorid-Elektroden bestehen aus Silberdraht oder Pellets, die chloridiert wurden und somit eine AgCl-Schicht auf der Außenfläche des Drahtes oder Pellets aufweisen (Abbildung 2).
3. Vorbereitung der Pipette
   1. Ziehen
      1. Setzen Sie das Kapillarrohr in den Abzieher ein.
         HINWEIS: Die unten für die Pipettenherstellung verwendeten Parameter sind gerätespezifisch. Das Instrument, das wir in diesem Artikel verwendet haben, wird in der Materialtabelle erwähnt.
      2. Unter experimentellen Bedingungen (Raumtemperatur 22 °C, durchgeformter Heizfaden, Borosilikatglas mit Glühfaden), die den Heizfaden nicht durchbrennen, führen Sie einen RAMP-Test am Abzieher durch, um den zum Schmelzen der Glaskapillare erforderlichen Heizwert (HEAT) zu bestimmen.
      3. Entwerfen Sie ein neues Zugprogramm mit sechs separaten Zugzyklen unter Verwendung der Parameter HEAT, Geschwindigkeit (VEL) und Zeit (TIME) (Tabelle 1).
         HINWEIS: HEAT bezieht sich auf den Parameter, der den Glühfaden der Heizung erhitzt, so dass der Glasfaden schmelzen kann. Die Geschwindigkeit gibt die Geschwindigkeit an, mit der der Abzieher das Filament in beide Richtungen zieht. Die Zeit stellt die Dauer des Intervalls zwischen den einzelnen Zyklen dar.
      4. Drücken Sie die grüne Pull-Taste auf der Tastatur.
      5. Lösen Sie den Klemmknopf und entfernen Sie die Pipetten aus dem Abzieher.
      6. Untersuchen Sie die Pipettenspitzen unter dem Okular der Mikroschmiede, um den Spitzendurchmesser, die Schärfe und die Geometrie zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass der Spitzendurchmesser 0,5 bis 0,9 μm beträgt.
         HINWEIS: Wenn das Filament häufiger verwendet wird, ändert sich der Wärmewert, der zum Schmelzen der Glaskapillare erforderlich ist.
      7. Wenn die Spitzengröße nicht den Erwartungen entspricht, passen Sie die Parameter HEAT und VEL an. Höhere Temperaturen und höhere Geschwindigkeiten führen zu feineren, längeren Spitzen und umgekehrt. Stellen Sie die HITZE in Schritten von 5 Grad und die Geschwindigkeit in Schritten von 3 Grad ein.
   2. Polieren
      1. Legen Sie die gezogenen Patch-Pipetten in den microforge-Halter.
      2. Prüfen Sie die Pipettenspitzen mit einer 35-fachen Objektivlinse (kombiniert mit einem 15-fachen Okular, was zu einer 525-fachen Vergrößerung führt).
      3. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Patch-Pipetten in die Nähe des Filaments zu bringen.
      4. Stellen Sie den Temperaturregler auf 80.
      5. Schalten Sie die Heizung mit dem Fußschalter ein und legen Sie einen kurzen Wärmeimpuls (1 - 2 s) an, um den Poliervorgang durch das microforge-Okular zu überwachen.
      6. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Pipetten poliert sind.
      7. Legen Sie die fertigen Pipetten in eine versiegelte Schachtel, um das Eindringen von Staub zu verhindern.
         HINWEIS: Ziel ist es, die Spitze schnell zu schmelzen, damit das Glas die endgültige Spitzengeometrie neu formiert, ohne sie zu scharf zu machen. Dadurch wird verhindert, dass die Pipette in die Vesikelmembran eindringt, gegen die sie gedrückt wird, und die Dichtungsbildung wird effektiv gefördert. Nach der letzten Politur sollte der innere Weg der Pipettenspitze sehr schmal, gerade und linear sein.
         Die besten Aufnahmepipetten haben in der Regel einen Widerstand von 5 - 8 MΩ nach dem Feuerpolieren. Der Öffnungsdurchmesser der Spitze sollte 2 μm betragen. Eine perfekt polierte Patch-Pipette ist für eine erfolgreiche Gigaseal-Bildung unerlässlich, da dies eine der Schlüsseltechniken ist, die für den Erfolg des Verfahrens entscheidend sind.

2. Vorbereitung der Probe

1. Zellkultur (am Beispiel HEK293)
   1. Kultivieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Standard-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂.
   2. Kultivieren Sie die HEK293-Zellen in glukosearmem DMEM, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin.
   3. Legen Sie Poly-L-Lysin-beschichtete 12-mm-Deckgläser in eine 24-Well-Platte.
2. Vergrößerung der Organellen
   1. 1 μM Vacuolin-1 zu HEK293-Zellen in der 24-Well-Platte (aus Schritt 2.1) geben und über Nacht bei 37 ΰC mit 5 % CO₂ inkubieren, bis sich vergrößerte Vesikel zu bilden beginnen.
      HINWEIS: Die Größe der vergrößerten Endolysosomen kann je nach Werkzeug, Verbindung, Inkubationszeit und Zelltyp 1-10 μm erreichen (Abbildung 3 und Tabelle 2).
3. Vorbereitung der Lösung
   HINWEIS: Die Standardlösungszubereitung zielt darauf ab, die Ionenkonzentrationen in der Zelle und den Organellen zu simulieren. Die Standardlösungen für die Messung von Ionenkanälen an Lysosomen sind beispielsweise wie folgt:
   1. Zubereitung der Badlösung (in mM): 140 K-Methansulfonat (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0,39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,2 ein. Stellen Sie die Osmolarität mit Glukose auf 300 mosm/L ein.
   2. Pipettenlösung (in mM) vorbereiten: 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. Stellen Sie den pH-Wert mit MSA auf 4,6 ein. Stellen Sie die Osmolarität mit Glukose auf 310 mosm/L ein.
      HINWEIS: Die Lösung durch einen 0,2-μm-Filter passieren, 45 mL Aliquots in konischen 50 mL Röhrchen zubereiten und bis zu 2-4 Wochen bei 4 °C lagern.

3. Isolierung von Organellen

1. Entfernen Sie ein Deckglas mit behandelten Zellen (siehe Abschnitt 2) von der 24-Well-Platte, geben Sie es in die Mikroskopkammer und fügen Sie 1 ml Badlösung hinzu.
   HINWEIS: Zellen dürfen nicht für >1 h in der Badlösung gelagert werden, wenn Ganzendolysosomale Patch-Clamp-Experimente durchgeführt werden, bei denen Endolysosomen isoliert, versiegelt und aufgezeichnet werden. Nach 1 h schrumpfen die vergrößerten Endolysosomen, haften an der Pipette und lassen sich nur noch schwer isolieren.
2. Verwenden Sie eine selbstgemachte Kunststoff-Füllnadel, um die Isolationspipette mit Pipettenlösung zu füllen, und installieren Sie die Pipette am vorderen Ende der Patch-Clamp-Anordnung.
3. Stellen Sie den diagonalen Bewegungswinkel des Mikromanipulators auf nahe 30° (Werkseinstellung) ein.
4. Unter dem Mikroskop (40x Objektiv und 10x Okular) untersuchen Sie die Zellen auf ausreichend vergrößerte Endosomen oder Lysosomen, die sich in der Nähe des Zellmembranrandes zur Isolierung befinden. Bewegen Sie die Isolationspipette in die Nähe der ausgewählten Zelle.
5. Senken Sie die Isolationspipette mit dem Mikromanipulator ab, bis sie den Rand der Plasmamembran berührt (Abbildung 4). Bewegen Sie die Isolationspipette schnell horizontal, um ein kleines Stück der Plasmamembran abzuschneiden.
6. Drücken Sie mit derselben Pipette von der gegenüberliegenden Seite auf die Zelle, um das Endosom/die Lysosomen in einem Abstand von ~2 μm von der Zelle herauszudrücken.
   HINWEIS: Wenn sich auf der Organelle eine restliche Zellmembran befindet, kann dies die Bildung eines Gigaseals verhindern.
7. Untersuchen Sie das isolierte Endolysosom unter dem Mikroskop.

4. Gigaseal-Bildung

1. Füllen Sie eine frisch polierte Patch-Pipette mit der passenden Pipettenlösung und installieren Sie die Pipette am vorderen Ende des Verstärkers.
2. Üben Sie einen Überdruck von 20 - 50 mbar auf die Pipette aus (oder verwenden Sie 0,03-0,05 mL aus einer 1-ml-Spritze zur Druckkontrolle) und halten Sie diesen Druck aufrecht (verriegeln Sie das Ventil).
   HINWEIS: 1 mbar (Millibar) = 0,001 bar = 0,1 kPa (Kilopascal) = 1 hPa (Hektopascal) = 1.000 dyn/cm2.
3. Wenn Sie die Pipettenspitze in die Badlösung in der Mitte des Sichtfelds bewegen, vergewissern Sie sich, dass der Druck hoch genug ist, um die Flüssigkeit in die Badlösung fließen zu sehen.
4. Legen Sie wiederholte Stromimpulse (+5 mV; 5 ms) an, um den Pipettenwiderstand, den Dichtungswiderstand und den Serienwiderstand zu bestimmen. Überwachen Sie die Größe der Pipettenspitze, die Dichtungsbildung und die Etablierung der gesamten endolysosomalen Konfiguration.
5. Bewegen Sie die Pipette schnell nahe an die Oberseite des Zielvesikels. Bringen Sie die Pipette in die Nähe des Vesikels, bis sich das Vesikel aufgrund des Flüssigkeitsflusses aus der Pipette bewegt oder rollt (Abbildung 5).
6. Stellen Sie die Offset-Spannung der Pipette auf 0 mV ein. Lassen Sie sofort den Überdruck ab. Im Idealfall wird das Vesikel zur Pipette gezogen und verbindet sich mit der Membran, wodurch innerhalb von 1 s ein Gigaseal (1-20 GΩ) entsteht.Achten Sie auf eine Abnahme der Stromamplitude auf <10 pA , die durch den Spannungsimpuls von 5 mV hervorgerufen wird, was auf eine erfolgreiche Gigaseal-Bildung hinweist.
   HINWEIS: Ein stabiler Überdruck ist für die Bildung von Gigasiegeln unerlässlich. Manchmal können Undichtigkeiten in den Schläuchen die Bildung von Gigasealen verhindern. Es wird empfohlen, ein Manometer zu verwenden, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind. Wenn ein Leck festgestellt wird, befestigen Sie den Schlauch wieder oder tragen Sie eine kleine Menge Vaseline auf die Nähte auf, um die Abdichtung zu verbessern.

5. Strommessung

1. Bruch der Membran
   HINWEIS: Abhängig von den experimentellen Anforderungen kann der Elektroden-Membran-Kontakt in vier Modi eingeteilt werden: Zellgebundener Modus, Ganzzellmodus, Inside-Out-Modus und Outside-Out-Modus (Abbildung 6).
   1. Für die Aufzeichnung ganzer Vesikel wird ein Hochspannungs-Kurzpuls (ZAP-Puls) von 200 μs oder 500 μs verwendet, um die Membran an der Kontaktstelle zwischen der Pipette und der Organelle zu durchbrechen. Stellen Sie die Spannung von -500 mV bis -1.200 mV ein und verringern Sie sie jedes Mal um 100 mV , bis die Membran unterbrochen wird.
   2. Ziehen Sie für den Inside-Out-Modus (Einkanal-Aufnahme) nach dem Formen des Gigaseals die Pipette von der Organelle weg, reißen Sie ein kleines Stück der Membran ab und legen Sie die Seite frei, die ursprünglich dem Vesikellumen zugewandt war.
   3. Für den Outside-Out-Modus ziehen Sie die Pipette nach der Bildung des Gigaseal und dem Übergang in den gesamten Vesikelmodus von der Organelle weg und reißen ein kleines Stück der Membran ab, während Sie eine kleine vesikuläre Struktur beibehalten.
2. Aktuelle Aufzeichnung
   1. Zeichnen Sie den Strom über die endolysosomale Membran auf, während die Eingangsspannung in endolysosomalen Voltage-Clamp-Patch-Clamp-Experimenten variiert.
      1. Steuern Sie diese Spannungen durch Spannungsstufen oder Spannungsrampen; Verwenden Sie einen breiten Bereich von Eingangsspannungen (z. B. -100 mV bis +100 mV) in endolysosomalen Voltage-Clamp-Experimenten.

Im Folgenden werden die Stromformen beschrieben, die bei endolysosomalen Patch-Clamp-Experimenten beobachtet wurden. Wenn die aktuelle Form nicht den Erwartungen entspricht, kann dies an einem schlechten Kontakt oder einer Leckage liegen. Ein schlechter Kontakt kann auftreten, wenn die Referenzelektrode nicht vollständig mit der Badlösung in Kontakt kommt oder wenn die Pipettenelektrode kurz vor dem Bruch steht. Eine Leckage kann auftreten, wenn zwischen der Kammer und dem Deckglas ein...

Elektrophysiologische Versuchsaufbauten haben vier Hauptanforderungen an das Labor: i) Umgebung: Methoden, um die Probe gesund zu halten; ii) Optik: Methoden zur Visualisierung der Probe; iii) Mechanik: Methoden zur stabilen Positionierung der Mikroelektrode; und iv) Elektronik: Methoden zur Verstärkung und Aufzeichnung des Signals.

Für die erfolgreiche Durchführung endolysosomaler Patch-Clamp-Experimente sind mehrere wichtige Schritte entscheidend. Erstens...

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

National Science and Technology Council, Taiwan (MOST 110-2320-B-002-022), National Taiwan University (NTU-112L7818) und die National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX112-11119SC).