הכנת ספריית ATAC-Seq של נויטרופילים שמקורם במח עצם עכברים

כתב יד זה מתאר פרוטוקול להכנת ספריית ATAC-seq של נויטרופילים ממח עצם עכבר, במטרה להבטיח כדאיות אופטימלית של נויטרופילים ואיכות ספרייה גבוהה. הוא מציע הוראות שלב אחר שלב על הכנת BMC, מיון אימונומגנטי ובניית ספרייה, ומשמש כמדריך רב ערך, במיוחד עבור מצטרפים חדשים לחקר נויטרופילים.

בדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף (ATAC-seq) היא טכניקה רבת עוצמה בעלת תפוקה גבוהה להערכת נגישות כרומטין והבנת ויסות אפיגנומי. נויטרופילים, כסוג לויקוציטים חיוני בתגובות חיסוניות, עוברים שינויים ארכיטקטוניים משמעותיים של כרומטין במהלך התמיינות והפעלה, המשפיעים באופן משמעותי על ביטוי הגנים הדרושים לתפקודם. ATAC-seq היה חיוני בחשיפת גורמי שעתוק מרכזיים בהבשלת נויטרופילים, חשיפת חתימות אפיגנומיות ספציפיות לפתוגן וזיהוי מטרות טיפוליות למחלות אוטואימוניות. עם זאת, הרגישות של נויטרופילים לסביבה החיצונית מסבכת את הפקת נתוני ATAC-seq באיכות גבוהה. כאן, אנו מציעים פרוטוקול ניתן להרחבה להכנת ספריות ATAC-seq מניטרופילים שמקורם במח עצם מכרסמים, הכולל הפרדה אימונומגנטית משופרת כדי להבטיח כדאיות תאים אופטימלית וספריות באיכות גבוהה. המרכיבים החיוניים המשפיעים על איכות הספרייה ועקרונות האופטימיזציה להרחבה מתודולוגית נדונים בפירוט. פרוטוקול זה יתמוך בחוקרים המוכנים לחקור את ארכיטקטורת הכרומטין ותכנות מחדש אפיגנומי של נויטרופילים, ולקדם מחקרים באימונולוגיה בסיסית וקלינית.

נויטרופילים הם אחד מסוגי התאים החיסוניים הנפוצים והחיוניים ביותר בבעלי חוליות, ומהווים 50%-70% מהלויקוציטים האנושיים¹. נויטרופילים ממלאים תפקיד מרכזי באיתור וחיסול מיקרואורגניזמים במארחים. במהלך אלח דם, נויטרופילים בוגרים הם בין המגיבים הראשונים². הם מתגייסים במהירות לאתרי זיהום באמצעות כימוטקסיס³, שם הם נלחמים בפתוגנים על ידי בליעת מיקרואורגניזמים (פגוציטוזיס), ייצור מיני חמצן תגובתיים תלויי NADPH אוקסידאז (התפרצויות נשימה), הפרשת גרגירים (דה-גרנולציה) ויצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) שתופסות והורגות חיידקים חוץ-תאיים ברגע שהם מגיעים לאתר הדלקת⁴. נויטרופילים לא בשלים מגויסים במהירות גם ממח העצם למחזור הדם ההיקפי על ידי כימוקינים ^5,6. נויטרופילים אלה הנמשכים לאתר הזיהומי משחררים גם ציטוקינים, המעורבים במספר תהליכים פיזיולוגיים, כגון המטופואיזה, אנגיוגנזה וריפוי פצעים ^7,8. חולים הסובלים ממחלות מולדות או נרכשות הגורמות לירידה בספירת הנויטרופילים רגישים יותר לזיהומים ^9,10. עם זאת, הפעלת נויטרופילים היא חרב פיפיות. הפעלה מוגזמת ושחרור ציטוקינים עלולים לגרום לנזק לרקמות ולאיברים, מה שמוביל לתפקוד לקוי של איברים מרובים אם זיהומים אינם נשלטים באופן מיידי^11,12. בנוסף, נויטרופילים תורמים גם למחלות דלקתיות ואוטואימוניות שונות ויכולים להשפיע על התקדמות הסרטן וגרורות^13,14. זה מדגיש את הצורך לחקור את ויסות פעילות הנויטרופילים כדי לאזן תגובה חיסונית יעילה ולמנוע נזק למארח.

בנויטרופילים, ארכיטקטורת הכרומטין עוברת שינויים מובהקים ודינמיים בבידול, בנדידה ובהפעלה שלהם, ומפעילה תפקידי רגולציה מרכזיים לאורך תוחלת החיים התאית. מסע זה, מהגרעין הגדול, העגול והעשיר באוכרומטין של מיאלובלסטים לגרעין שקוע יותר במיאלוציטים ומטאמילוציטים, ולאחר מכן לתאים בפס בצורת C או S ובעלי אונות גבוהות עם כרומטין צפוף בנויטרופילים פולימורפו-גרעיניים^15,16, הוא עדות למורכבות הביולוגיה של הנויטרופילים. תצורת הכרומטין המיוחדת מבטיחה ביטוי סלקטיבי של גנים החיוניים לתפקוד נויטרופילים, כגון אלה המעורבים בייצור גרגירים ותגובות שעתוק מהירות הנחוצות לחיסול יעיל של פתוגנים¹⁷. כאשר נויטרופילים מגויסים לאתרים דלקתיים באמצעות כימוטקסיס, הנדידה הטרנסאנדותללית מפעילה לחץ על קומפלקס הקישור המורכב של נוקלאוסקלטון/שלד ציטו (LINC), מה שגורם לעיצוב מחדש של כרומטין ופוטנציאל הפעלה נוסף¹⁸. באלח דם, נויטרופילים מופעלים מציגים "תזוזה גרעינית-שמאלה", עם מורפולוגיה לא תקינה של כרומטין, כגון גרעינים דו-כיווניים או ללא אונות ועיבוי כרומטין רופף משמעותית¹⁹. התוצאה היא נגישות מוגברת בתוך אזורי גנים הקשורים לתגובה דלקתית, ובכך גורמת לביטוי משמעותי של גנים אלה. אם זיהומים אינם נשלטים כראוי, יש צורך בציטרולינציה של היסטון ופירוק כרומטין לאחר מכן כדי ליצור NETs^20,21. לכן, הבנת ארכיטקטורת כרומטין נויטרופילים חיונית לקידום הביולוגיה של הנויטרופילים ולפיתוח טיפולים למחלות דלקתיות ואוטואימוניות, ומציעה תקווה לטיפול עתידי במחלות.

נגישות כרומטין משמשת כמדד לארכיטקטורת כרומטין ברמה האפיגנומית. הוא מציין כיצד אזורים גנומיים מותרים פיזית למשפרים, מקדמים, מבודדים וגורמים קושרי כרומטין וכיצד אלמנטים אלה משפיעים על ביטוי גנים²². בדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף (ATAC-seq) היא טכניקה בשימוש נרחב להערכת נגישות כרומטין על פני הגנום²³. הוא אינו דורש ידע מוקדם באלמנטים רגולטוריים, מה שהופך אותו לכלי רב עוצמה למחקר אפיגנטי. שיטה זו כוללת בידוד גרעינים של דגימות, פיצול DNA גנומי על ידי טרנספוזאז Tn5, והוספת פריימרים לריצוף להכנת ספרייה, ריצוף וניתוח נתונים²³. ATAC-seq היה חיוני בחקר מיפוי נוקלאוזומים, ניתוח קשירת גורמי שעתוק, מנגנוני ויסות בסוגי תאים או מחלות שונות, זיהוי משפר חדש, גילוי סמנים ביולוגיים וכו'^22,23. לעתים קרובות הוא משולב עם טכניקות אחרות, כגון ריצוף RNA, לניתוח מקיף של ביטוי גנים.

ATAC-seq קידם את הידע שלנו בביולוגיה של נויטרופילים על ידי חשיפת מנגנונים אפיגנטיים מדויקים בבריאות וחולי. הוא חשף מספר גורמי שעתוק מרכזיים (כלומר, RUNX1, KLF6, PU.1 וכו') בהתבגרות נויטרופילים ותגובות אפקטור^24,25, חשף חתימות ספציפיות לפתוגן עם פוטנציאל סמן ביולוגי באלח דם²⁶, הבהיר את המנגנונים האפיגנומיים של הזיכרון החיסוני המולד¹², וזיהה מטרות טיפוליות בלוקמיה מיאלואידית חריפה בילדים (AML)²⁷. עם זאת, כמרכיב תאי בולט במעקב חיסוני, נויטרופילים מפגינים רגישות גבוהה לסביבה החיצונית שלהם ולכן מהווים אתגר להפקת נתוני ATAC-seq באיכות גבוהה. בנסיבות פיזיולוגיות, זמן מחצית החיים החציוני של נויטרופילים אנושיים מדווח על 3.8 ימים, בעוד שזמן מחצית החיים הממוצע של נויטרופילים עכברים הוא 12.5 שעות. ראוי לציין שמחצית החיים שלהם קצרה משמעותית כאשר הם נלמדים במבחנה ^28,29. במהלך פעולה חוץ גופית של נויטרופילים מבודדים, חשיפה למיקרואורגניזמים או דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMPs), כמו גם הליכים ניסיוניים מיותרים ופעולות קשות, עלולה לגרום להפעלה חריגה של נויטרופילים ולירידה בכדאיות התאים עקב אפופטוזיס או NETosis. התאים המתים מאכלסים בדרך כלל כמויות משמעותיות של DNA לא כרומטיני רגיש מאוד ל-Tn5, וכתוצאה מכך מגבירים את רעש הרקע של ATAC-seq²³.

כאן, אנו מציעים פרוטוקול ניתן להרחבה להכנת ספריות ATAC-seq המותאמות לנויטרופילים שמקורם בדגימות מח עצם של מכרסמים. איור 1 מציג סקירה גרפית של הפרוטוקול, הכוללת את ההפרדה האימונומגנטית של נויטרופילים ממח העצם, ואחריה ATAC-seq. המיון האימונומגנטי המשופר מבטיח את הכדאיות האופטימלית של נויטרופילים לפני חילוץ הגרעין לספריית ATAC-seq, ובכך מבטיח את האיכות הגבוהה של הספריות ומקל על שילוב הערכות נויטרופילים נוספות בתכנית. יישום פרוטוקול זה יסייע לחוקרים בהבנת תכונות ארכיטקטורת הכרומטין ומנגנוני התכנות מחדש האפיגנומיים של נויטרופילים כאשר הם נחשפים לאתגרים מיקרו-סביבתיים שונים. צפויים להיות לכך יישומים נרחבים במחקרי אימונולוגיה בסיסיים וקליניים.

כל הנהלים בבעלי חיים המוצגים להלן עמדו בהנחיות ובתקנות הלאומיות לאתיקה ולרווחת בעלי חיים, שאושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית קפיטל, בייג'ינג, סין (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. הכנת תרחיפי תאי מח עצם (BMC).

1. עכברי C57BL/6J זכרים נבחרים בגילאי 6-8 שבועות במשקל 19-21 גרם. המתת חסד של העכברים באמצעות תא CO₂ , ואחריו נקע צוואר הרחם לאחר שהרפלקס העמוק נעלם. חטאו אותם בתרסיס אתנול 70% על מחצלת חיתוך.
2. השתמש במספריים ובמלקחיים קטנים כדי להפריד בזהירות את עצם הירך ממפרק הירך והשוקה, להסיר את העור המחובר ואת שריר השלד ולשטוף את עצם הירך במי מלח קרים עם פוספט (PBS) בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ.
3. חתכו את האפיפיזות של עצם הירך, הכניסו בעדינות מחט 28 גרם המחוברת למזרק של 2 מ"ל לחלל המח, ושטפו את מח העצם עם PBS קר המכיל 2% סרום בקר עוברי (FBS).
4. חזור על השלב הקודם עד שהנוזל האדום הכהה הסמוק הופך לשקוף. בדרך כלל נדרשות שלוש שטיפה.
   הערה: הימנע מהכנסת המחט עמוק מדי לחלל מח העצם כדי להבטיח רכישת תאים אופטימלית.
5. השתמש במסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לסנן את תרחיף התא לתוך צינור מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי (FACS) (5 מ"ל).
6. ליזה את האריתרוציטים ב-BMCs עם מאגר ליזה אריתרוציטים מסחרי ללא פוליפורמלדהיד.
   1. צנטריפוגה את הצינור ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס, הסר בזהירות את ה-supernatant, והשאיר כ-100 מיקרוליטר נוזל בתחתית, והקש בעדינות על הצינור כדי לשחרר את הגלולה.
   2. הוסף 2 מ"ל של מאגר ליזה, מדולל ממאגר ליזה אריתרוציטים (פי 10), וערבב על ידי הפיכת הצינור שלוש פעמים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב-500 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא על ידי הקשה עדינה.
   3. שטפו את התאים פעמיים עם מדיום RPMI 1640 המכיל 10% FBS והשעו אותם בנפח של 2 מ"ל.
      הערה: כאשר מתמודדים עם גושי תאים לא מפוזרים, מומלץ להשתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לבחור אותם במקום לסנן את מתלי התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. שיטה זו יכולה להפחית את אובדן התאים.
7. חשב את הכדאיות התאית ואת המספר הכולל של תאים חיים לדגימה עם צביעה כחולה טריפאן.

2. תיוג אימונומגנטי של נויטרופילים עם חרוזים מגנטיים נגד Ly6G

1. השעו מחדש את תאי מח העצם (~2 x 10⁷ תאים חיים לעכבר) ב-2 מ"ל של מדיום RPMI 1640 המכיל 10% FBS וצנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
   הערה: בהתחשב בדרישה המוגבלת של 1 x 10⁵ תאים עבור ATAC-seq, ניתן להקצות את הנויטרופילים העודפים לניתוחים אפיגנומיים נוספים (למשל, ChIP-seq ו-Hi-C) או הערכות תפקוד חיסוני (למשל, ייצור ציטוקינים, פגוציטוזיס ו-NETs) באמצעות נויטרופילים המתקבלים מאותו עכבר.
2. שאפו את רוב הסופרנטנט, והשאירו אחריהם כ-100 מיקרוליטר, והקישו בעדינות על הצינור כדי לשחרר את הגלולה.
3. הוסף 30 מיקרוליטר של חרוזי Ly6G וערבב עם ה-BMC על ידי הקשה עדינה.
   הערה: יש לערבב חרוזים מגנטיים למשך 10 שניות לפחות לפני השימוש. לאחר הוספת החרוזים ל-BMC, מומלץ להימנע ממערבולת.
4. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
5. הוסף 2 מ"ל PBS כדי להשעות מחדש את החרוזים והתאים, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
6. שאפו את רוב הסופרנטנט, והשאירו אחריהם כ-100 מיקרוליטר, והקישו בעדינות על הצינור כדי לשחרר את הגלולה. הוסף PBS נוסף לנפח סופי של 1 מ"ל.
   הערה: כאשר מתמודדים עם גושי תאים לא מפוזרים, מומלץ להשתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לבחור אותם במקום לסנן את מתלי התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. שיטה זו יכולה להפחית את אובדן התאים.

3. הפרדת נויטרופילים עם מיון תאים אימונומגנטיים

1. טפל מראש בעמודת MS עם PBS.
   1. מקם את עמודת MS בתוך השדה המגנטי של מפריד מיון תאים מופעל מגנטי (MACS) תואם. מקם צינור לא תפוס של 5 מ"ל מתחת לנוזל הנפלט מעמודת MS.
   2. שוטפים את העמוד עם 500 מיקרוליטר PBS. חזור על שלב זה לאחר הזרימה המלאה של PBS לעמודה MS.
      הערה: יש לאפשר ל-PBS לזרום בהדרגה, טיפה אחר טיפה, לתוך צינור מיון התאים המופעל על ידי פלואורסצנטי (FACS) בנפח 5 מ"ל דרך עמודת MS. ודא שלא ייכנס אוויר לעמוד, מכיוון שבועות אוויר עלולות לחסום את העמוד.
2. החל את מתלה ה-BMC המסומן מגנטית על עמודת MS על ידי הוספת 500 מיקרוליטר בכל פעם, מילוי מחדש מיד לאחר שמאגר העמודה ריק.
   הערה: ודא שמתלי התאים נטולי מסת תא. במידת הצורך, מקם צינור FACS חדש של 5 מ"ל מתחת לעמודת הטרשת הנפוצה כדי לאסוף את התאים הלא מסומנים (למשל, מונוציטים ולימפוציטים) לפני שלב זה.
   הערה: שימו לב לקצב זרימת הטיפות. קצב זרימה איטי יכול להצביע על כך שעמודת המיון חסומה.
3. שטפו את עמודת MS על ידי הוספת 500 מיקרוליטר PBS בכל פעם שהמאגר ריק, וחזרו על תהליך זה פעמיים.
   הערה: הוספה מוקדמת של PBS עלולה לעכב את כניסתם של תאים מסוימים לעמודת המיון, ועלולה לפגוע בטוהר מיון התאים.
4. אסוף את הנויטרופילים המסומנים מגנטית.
   1. לאחר שמאגר העמודים מתרוקן, הסר את העמוד מהשדה המגנטי ומקם אותו בזהירות על צינור של 5 מ"ל.
      הערה: לפני הסרת העמודה, ודא שאין בתוכו שאריות נוזל כדי למנוע אובדן נויטרופילים עקב פריקת טיפות במהלך התהליך. ניתן היה להסיר את השאריות בעמודה באמצעות פיפטה.
   2. הוצא 2 מ"ל PBS על העמודה, ולאחר מכן דחף מיד ובחוזקה את הבוכנה לתוך העמודה כדי להוציא את הנויטרופילים המסומנים מגנטית.
      הערה: כדי לרכוש מספיק נויטרופילים, הקפידו על נפח פליטה נאות והישארו קצרים בעת דחיפת הבוכנה לתוך העמודה.
5. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים המבודדים. זהה את טוהר הנויטרופילים המבודדים על ידי לקיחת 100 מיקרוליטר מתרחיף התאים שלאחר המיון וניתוחם עם ציטומטריית זרימה.

4. מיצוי גרעין

1. צנטריפוגה את 50,000 התרחיפים החד-תאיים המכילים את הנויטרופילים ב-500 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בשפופרת של 0.2 מ"ל, ואז השליכו את הסופרנטנט.
2. השעו מחדש את הנויטרופילים ב-50 מיקרוליטר של מאגר ליזיס מקורר מראש (עיין בטבלה 1), ערבבו בעדינות את התמיסה באמצעות פיפטה, ודגרו על קרח למשך 10 דקות.
   הערה: אם נפח הדגימה נמוך מ-5 מיקרוליטר, מותר להוסיף את מאגר הליזיס ישירות. ריכוז תרחיף התאים אינו עולה על 1 x 10⁷ תאים / מ"ל.
3. צנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ואז השליכו את הסופרנטנט ואספו את הגרעין. מקם את הצינור על קרח לפני תחילת ההליכים הבאים.
   הערה: כדי למזער את אובדן הדגימה, ציין את הצד של דופן הצינור שבו מצטברים כדורים ושואב בעדינות את הנוזל מהצד הנגדי בעת הסרת הסופרנטנט.

5. תיוג קשור נוקלאוזום עם טרנספוזאז

1. הכן את תערובת תגובת התיוג המכילה טרנספוזאז Tn5 בצינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בהתאם להנחיות של ערכת ההכנה של ספריית ה-DNA (עיין בטבלה 2) וחמם מראש את חרוזי טיהור האמפליקון בקירור ב-25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
2. השעו מחדש את גרעין הנויטרופילים עם 50 מיקרוליטר של תערובת תגובת תיוג וערבבו בעדינות עם פיפטה, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 שניות באמצעות צנטריפוגה ידנית (~2600 x גרם).
3. דגרו את צינור התגובה במכשיר PCR בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
4. הוסף 100 מיקרוליטר של חרוזי טיהור אמפליקון מערבולת מראש לליזאט, ולאחר מכן ערבב היטב את החרוזים המגנטיים בתמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
   הערה: חרוזים מגנטיים הם דביקים ויכולים להתחבר בקלות לקצות הפיפטה, לכן הקפידו לשאוב את הנפח הנכון ולהוציא אותם לאט מהקצות בעת העברת החרוזים.
5. דגרו את צינור התגובה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 שניות עם צנטריפוגה ידנית (~2600 × גרם).
6. טהר את שבר ה- DNA שנקטע על ידי הנחת צינור התגובה על מתלה מגנטי עד שהתמיסה תתבהר (כ -5 דקות). לאחר מכן, הסירו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים המגנטיים.
7. שטפו את החרוז המגנטי עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי שהוכן בכל פעם, תוך שמירה על צינור התגובה על המדף המגנטי למשך 30 שניות. הימנע מהפרעה לחרוזים בעת הוספת אתנול. חזור על ההליך המתואר בשלב 5.7.
8. צנטריפוגה את צינור התגובה עם צנטריפוגה כף יד (כ -2600 × גרם), שאפו את האתנול עם קצות פיפטה של 10 מיקרוליטר, ואז יבשו את החרוזים המגנטיים למשך 3-5 דקות תוך כדי פתיחת המכסה.
   הערה: משך הייבוש של חרוזים מגנטיים עשוי להשתנות באזורים שונים עקב שינויים ברמות הלחות. יש לייבש את החרוזים רק עד שהם מאבדים את הברק שלהם. ייבוש יתר עלול לסבך את תהליך הפליטה, בעוד שייבוש לא מספיק עלול לגרום לנוכחות שאריות אלכוהול, ולהשפיע על הניסויים הבאים. בנוסף, מיקום המתלה המגנטי אופקית תורם יותר לייבוש אחיד של החרוזים המגנטיים.
9. לאחר הסרת צינור התגובה מהמתלה המגנטי, הוסף 26 מיקרוליטר של ddH₂O כדי לכסות את החרוזים המגנטיים, פיפטינג למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
   הערה: האריכו את משך הדגירה כראוי אם החרוזים המגנטיים מיובשים יתר על המידה.
10. צנטריפוגה קצרה את צינור התגובה עם צנטריפוגה כף יד (כ -2600 × גרם) והפרד את החרוזים המגנטיים באמצעות מתלה מגנטי עד שהתמיסה מתבהרת (כ -5 דקות).
11. העבירו בזהירות את ה-24 מיקרוליטר לצינור ה-PCR החדש.

6. בניית ספרייה לריצוף מהדור הבא (NGS)

1. הכן את תערובת תגובת ה-PCR בצינור מעוקר תוך שימוש בשברי DNA מטוהרים ופריימרים המכילים מתאמי ריצוף (עיין בטבלה 3).
2. בצע את תגובת ה-PCR בהתאם להליכים המומלצים (עיין בטבלה 4), בדרך כלל דורש כשעה.
   הערה: הניסוי עשוי להיפסק זמנית לאחר הליך זה, וניתן לאחסן את מוצרי ה-PCR בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או לפחות שבועיים.
3. הוסף 27.5 מיקרוליטר של חרוזי טיהור אמפליקון עם מערבולת מראש ל-50 מיקרוליטר של מוצרי PCR, ולאחר מכן ערבב היטב את החרוזים המגנטיים בתמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
   הערה: היחס השגוי בין חרוזים מגנטיים למוצרי PCR עלול לגרום לאי התאמות באורכי השברים הממוינים. השתמש ב-ddH₂O כדי למלא את הנפח המאודה של מוצר ה-PCR ל-50 מיקרוליטר. הקפד לשאוב את הנפח הנכון של חרוזים מגנטיים ולהוציא אותם לאט מקצות הפיפטה כדי למזער את החרוזים שעלולים להיות מחוברים.
4. דגרו את צינור התגובה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 שניות בעזרת צנטריפוגה ידנית (כ-2600 x גרם).
5. טהר את ה-DNA של הספרייה על ידי הנחת צינור התגובה על מתלה מגנטי עד שהתמיסה תתבהר (כ-5 דקות). לאחר מכן, העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור PCR מעוקר חדש והשליכו את החרוזים המגנטיים.
6. הוסף 50 מיקרוליטר של חרוזי טיהור אמפליקונים מוכנים מראש לסופרנטנט, ולאחר מכן ערבב היטב את החרוזים המגנטיים בתמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
7. דגרו את צינור התגובה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 שניות בעזרת צנטריפוגה ידנית (כ-2600 x גרם).
8. הנח את צינור התגובה על מתלה מגנטי עד שהתמיסה תתבהר (כ-5 דקות), ולאחר מכן הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים המגנטיים.
9. שטפו את החרוז המגנטי פעמיים עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי שהוכן בכל פעם, ושמרו את צינור התגובה על המדף המגנטי למשך 30 שניות. הימנע מהפרעה לחרוזים בעת הוספת אתנול.
10. יבש את החרוזים המגנטיים למשך 5 דקות תוך כדי פתיחת המכסה.
11. לאחר הסרת צינור התגובה מהמתלה המגנטי, הוסף 22 מיקרוליטר של ddH₂O כדי לכסות את החרוזים המגנטיים, צנרת למעלה ולמטה במשך 10 פעמים כדי להבטיח ערבוב יסודי. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
12. צנטריפוגה קצרה של צינור התגובה עם צנטריפוגה כף יד (כ -2600 × גרם) והפרד את החרוזים המגנטיים באמצעות מתלה מגנטי עד שהתמיסה מתבהרת (כ -5 דקות).
13. העבירו בזהירות את ה-20 מיקרוליטר לצינור PCR מעוקר חדש ואחסנו אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי להשיג ספרייה עם התפלגות אורך מרוכזת יותר, שקול להשתמש בערכת שחזור ג'ל כדי למיין את המוצר המוגבר. לחלופין, אם אין דרישות ספציפיות לטווח התפלגות האורך, ניתן לטהר את המוצר המוגבר ישירות באמצעות ערכת טיהור חרוזים מגנטיים או עמודים ללא מיון אורך.

7. בקרת איכות ורצף ספרייה

1. השתמש בפלטפורמות מנתח מקטעי DNA כדי להעריך את התפלגות האורך של ה-DNA בספרייה.
2. השתמש בפלטפורמות NGS כדי לבצע ריצוף תפוקה גבוהה בספריות שעברו את בדיקת האיכות.

הפרוטוקול המתואר שימש לבידוד נויטרופילים ממח העצם של עכברי C57BL/6 ולהשוות את השונות שלהם בהתאמה בנגישות הכרומטין לפני ואחרי גירוי ליפופוליסכריד (LPS) באמצעות ATAC-seq. בדרך כלל, ניתן לקצור 2 x 10⁷ BMCs משתי עצם הירך של עכבר C57BL/6 בן 6-8 שבועות, ולאחר מכן ניתן לבודד 2-5 x 10⁶ נויט?...

כתב יד זה מדווח על פרוטוקול ניסיוני להכנת ספריות ATAC-seq המותאמות לנויטרופילים שמקורם בדגימות מח עצם של מכרסמים. בשל היותם של נויטרופילים רגישים מאוד ומופעלים בקלות, מאמצי האופטימיזציה נתנו עדיפות לשמירה על הכדאיות של נויטרופילים מבודדים. טיפול לא נכון עלול להוביל ל-NETosis ?...

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית המו"פ של ועדת החינוך העירונית של בייג'ינג (KZ202010025041) והמכונים הסיניים למחקר רפואי בבייג'ינג (מענק מס. CX24PY29).