רישום זרמי K⁺ מיישרים פנימה בתאי שריר חלק של העורקים הבסיסיים המבודדים הטריים בטכניקת Patch Clamp

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לבידוד תאי שריר חלק מהעורק הבסיסי של החולדה ורישום זרמי תעלת אשלגן מיישרים פנימה בתאים אלה באמצעות טכניקת מהדק תיקון של תא שלם. הוא מציע גישה חדשה לחוקרים החוקרים את העורק הבסיסי ותעלות היונים.

מחלת כלי דם במוח היא מצב שכיח בקרב קשישים, כאשר שכיחותה עולה בהתמדה. העורק הבסיסי הוא כלי מוחי קריטי המספק את הפונס, המוח הקטן, אזורי המוח האחוריים והאוזן הפנימית. פעילות תעלת אשלגן (K⁺) ממלאת תפקיד משמעותי בקביעת טונוס כלי הדם על ידי ויסות פוטנציאל קרום התא. הפעלה של תעלות K⁺ (Kir) מיישרות פנימה, כמו תעלות K⁺ אחרות, מובילה להיפרפולריזציה והרחבת כלי דם של קרום התא. במחקר זה, תאי שריר חלק מבודדים טריים מהעורק הבסיסי שימשו לרישום זרמי קיר באמצעות טכניקת מהדק תיקון של תא שלם. נחקרו ההשפעות של 100 מיקרומול/ליטר BaCl₂, מעכב תעלות קיר, ו-10 מיקרומול/ליטר נתרן ניטרופרוסיד (SNP), מרחיב כלי דם ניטרו, על זרמי ערוץ קיר. התוצאות הראו כי BaCl₂ עיכב זרמי תעלות קיר בתאי שריר חלק בעורק הבסיסי, בעוד ש-SNP שיפר את הזרמים הללו. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף להכנת תאי שריר חלק עורקי מבודדים טריים ורישום זרמי ערוץ קיר באמצעות טכניקת מהדק התיקון, ומציע משאב רב ערך לחוקרים המבקשים לשלוט בשיטה זו.

מחלות כלי דם במוח הן מצב שכיח בקרב האוכלוסייה המבוגרת. עם שיפורים ברמת החיים, עלייה בתוחלת החיים והזדקנות האוכלוסייה, שכיחות מחלות כלי דם במוח עולה בהתמדה¹. העורק הבסיסי, כלי לא מזווג שנוצר על ידי איחוי עורקי החוליות הדו-צדדיים, עובר מתחת לפונים בתוך הגולגולת ומתחלק לשני עורקי מוח אחוריים. הוא מספק את הפונים, המוח הקטן, האזורים האחוריים של המוח והאוזן הפנימית. אספקת דם לא מספקת לעורק הבסיסי עלולה להוביל לסחרחורת אפיזודית, המלווה לעתים קרובות בבחילות והקאות. חולים עשויים לחוות גם תסמינים כגון טינטון, אובדן שמיעה ובעיות קשורות אחרות. תסמינים אלו קשורים לעתים קרובות למצבים כמו ספונדילוזיס צוואר הרחם, טרשת עורקים מוחית ולחץ דם לא תקין. מחלות כלי דם במוח, שכיחות במיוחד בקרב אנשים בגיל העמידה וקשישים, קשורות לעתים קרובות למצבים בסיסיים אלה ^2,3,4.

עורקי התנגדות ממלאים תפקיד חיוני בתפקוד הלב וכלי הדם ובשמירה על הומאוסטזיס בגוף. כאתר העיקרי של עמידות כלי הדם, הם מווסתים את לחץ הדם ותפוקת הלב, ומבטיחים זרימת דם מספקת כדי לעמוד בדרישות המטבוליות והפיזיולוגיות של רקמות ואיברים⁵. העורק הבסיסי, המסווג כעורק התנגדות, מווסת בעיקר את זרימת הדם לגזע המוח⁶. תאי שריר חלק, היוצרים את דפנות עורקי ההתנגדות, הם מתווכים מרכזיים של התנגדות כלי הדם באמצעות ויסות התכווצות במצב יציב או מתח כלי דם. תאים אלה מכילים תעלות יונים רבות, כולל תעלות K⁺, תעלות Ca²⁺ ותעלות Cl^, שהן קריטיות לאפנון טונוס כלי הדם ^5,7.

תעלות K⁺ הן קריטיות לביסוס פוטנציאל הממברנה ולוויסות טונוס ההתכווצות של תאי שריר חלק עורקי⁸. ישנם ארבעה סוגים של תעלות K⁺ בשריר החלק העורקי: K⁺ תלוי מתח (Kᴠ), K⁺ תלוי Ca²⁺ (K_Ca), K⁺ תלוי ATP (K_ATP) ומיישר פנימה K⁺ (Kir) ערוצי ^9,10,11. ערוצי קיר מסווגים לשבעה תת-סוגים, כאשר Kir2.x הם ערוצי קיר קלאסיים. מבין אלה, תת-המשפחות Kir2.x הן הרלוונטיות ביותר בכלי הדם. זרמי קיר מציגים יישור פנימה במתחים שליליים, מה שמעיד על זרימה נטו של K⁺ לתוך התא, ואילו במתחים חיוביים, יש זרימת זרם K⁺ נטו^{מינימלית} עד ללא 5. במערכת הלב וכלי הדם, תעלות קיר חיוניות לייצוב פוטנציאל הממברנה. הפעלתם גורמת להיפרפולריזציה של קרום התא והרחבת כלי דם 12,13,14.

ניסויי Patch-clamp על תאי שריר חלק מבודדים טריים נערכו בעורקים שונים, כולל עורקים כליליים, מוחיים, כליות ומזנטרי^15,16. בעוד ששיטות מסוימות משתמשות באותו סוג של קולגנאז לבידוד תאים, ההליכים המדויקים משתנים. מעט מחקרים סיכמו באופן מקיף את השיטות לבידוד תאי שריר חלק בכלי הדם. לכן, מחקר זה מתמקד בבידוד טרי של תאי שריר חלק בכלי הדם הראשוניים מהעורק הבסיסי של החולדה וברישום זרמי תעלת קיר בתאים אלה באמצעות טכניקת מהדק תיקון של תא שלם, המספק פרוטוקול מפורט ומלא לחוקרים בתחומים קשורים.

פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי ועדת האתיקה לרווחת בעלי חיים במעבדה לרפואה סינית מסורתית של אוניברסיטת צ'נגדו (רשומה מס' 2024035). במחקר זה נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley (SD), במשקל 260-300 גרם ובגילאי 8-10 שבועות. החיות סופקו עם מים ומזון (מזון לבעלי חיים ניסיוניים עם SPF) אד ליביטום. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. דיסקציה של עורק בסיסי של חולדה

1. הכנת פתרון
   1. הכן פתרונות כמתואר בטבלה 1.
2. להרדים את החולדה בשאיפה של 2% איזופלורן. אשר הרדמה עמוקה באמצעות צביטה בבוהן. במידת הצורך, יש לתת חומרי הרדמה נוספים. המשך מיד לפתוח את הגולגולת ולחשוף את המוח על שולחן הניתוחים הנייד.
3. העבירו במהירות את המוח לצלחת פטרי המכילה PSS רווי ב-95% O₂ ו-5% CO₂ ב-4 מעלות צלזיוס. ודא שלתמיסה יש pH של 7.40.
4. מקם את המוח עם הגחון כלפי מעלה בצלחת פטרי ואבטח אותו עם מחטים. תחת מיקרוסקופ אור, אתרו את העורק הבסיסי והסירו בזהירות את הרקמה שמסביב באמצעות פינצטה ומספריים שעברו חיטוי (ראו איור 1A).
5. הכנס חוט באורך 2 ס"מ בקוטר 25 מיקרומטר לעורק הבסיסי המבודד. שפשפו בעדינות את הקיר הפנימי עם החוט כדי להסיר ביעילות את האנדותל של כלי הדם.
   הערה: העורק הבסיסי בחולדות ממוקם בתוך החריץ הבסיסי של גזע המוח בבסיס המוח ונוצר על ידי מפגש עורקי החוליה השמאלית והימנית². במהלך תהליך הבידוד, טפל בעורק בזהירות כדי למנוע מתיחה או דחיסה מוגזמת שעלולה לגרום לנזק.

2. בידוד תאי שריר חלק

1. מחממים מראש 1 מ"ל של תמיסת הפרדת תאים, 1 מ"ל של הידרוליזט אנזימטי I ו-1 מ"ל של הידרוליזט אנזימטי II עד 37 מעלות צלזיוס במבחנות 1, 2 ו-3, בהתאמה (ראה איור 1B).
2. העבר את העורק הבסיסי המבודד למבחנה 2. הזרקה רציפה של תערובת של 95% O₂ ו-5% CO₂ לתוך הצינורית, ושמירה על טיפול אנזימטי למשך 30 דקות (ראה איור 1C).
3. העבירו את העורק הבסיסי ממבחנה 2 למבחנה 3. המשיכו להזריק 95% O₂ ו-5%_CO2 לתוך הצינורית, והמשיכו בטיפול אנזימטי למשך 5 דקות (ראו איור 1D).
4. הוסף 1 מ"ל של תמיסת הפרדת תאים של 37 מעלות צלזיוס ממבחנה 1 לתוך מבחנה 3. יש להמשיך להזריק 95% O₂ ו-5% CO₂ תוך שמירה על טיפול אנזימטי למשך 3 דקות. שלש את הכנת העורק הבסיסי כדי לשחרר תאים (ראה איור 1E).
5. הוסף תמיסת הפרדה של 4 °C למבחנה 3 כדי לסיים את התהליך האנזימטי (ראה איור 1F). צנטריפוגה את התערובת בחום של 59 × גרם למשך 6 דקות. השליכו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה, הוסיפו שוב תמיסת הפרדה של 4 מעלות צלזיוס (ראו איור 1G), וחזרו על הצנטריפוגה פעמיים כדי להסיר שאריות אנזימים.
6. הסר את חומר העל באמצעות פיפטה, ואחסן 1 מ"ל מתלה התא בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6-8 שעות.
7. קח 100 מיקרוליטר מתרחיף התא והנח אותו באמבטיה (ראה איור 1H). הוסיפו 1 מ"ל של נוזל חוץ-תאי לאמבטיה ואפשרו לתאים להתיישב במשך 40 דקות כדי להיצמד לתחתית (ראו איור 2).
   הערה: עבור תאים בקבוצת הטיפול (למשל, BaCl₂ או נתרן ניטרופרוסיד), יש לדגור מראש עם החומרים המתאימים בטמפרטורת החדר (22-26 מעלות צלזיוס) למשך 40 דקות במהלך תקופת ההצמדה.

3. הקלטת זרם קיר באמצעות מהדק תיקון תא שלם

1. ייצור מיקרופיפטות
   1. הפעל את חולץ המיקרופיפטה (עיין בטבלת החומרים).
   2. הנח צינור זכוכית (קוטר חיצוני: 1.5 מ"מ, קוטר פנימי: 1.10 מ"מ, אורך: 10 ס"מ) במושך. בחר תוכנית 1, לחץ על Enter וגש לתוכנית 1. בצע בדיקת רמפה על ידי לחיצה על רמפה בלוח הבקרה כדי למדוד את ערך החום של צינור הזכוכית.
      הערה: ערוך את תוכנית 1 עם הפרמטרים הבאים: חום: רמפה, משיכה: 0, מהירות: 25, השהיה: 1, לחץ: 500, מצב: השהיה, חום בטוח מופעל. יש לבצע את בדיקת הרמפה בעת החלפת חוטים או סוגי פיפטות זכוכית. מיקרופיפטות צריכות להיות בקוטר קצה של ~1-2 מיקרומטר ואורך חרוט של כ-5 מ"מ. קוטר קצה קטן יותר וחרוטים ארוכים יותר מביאים להתנגדות גבוהה יותר לפיפטה.
   3. הכנס צינור זכוכית חדש ובחר תוכנית 1. לחץ על Enter כדי לייצר את המיקרופיפטה.
2. הקלטת זרם קיר
   1. הפעל את התקני החומרה ברצף: ממיר דיגיטלי לאנלוגי, מגבר אותות, מיקרומניפולטור, מיקרוסקופ, מצלמה ומחשב.
   2. הפעל את התוכנה בסדר הבא: מצלמה, אות ampחיים ותוכנת רכישת נתונים.
      הערה: אם מיקרוסקופ אינו מצויד במצלמה, רק תוכנת המכשיר זקוקה להפעלה. ודא שהתוכנה נפתחת לאחר אתחול החומרה כדי לאפשר פונקציונליות נאותה.
   3. בתוכנה לרכישת נתונים, בחר File > Set Data File Names כדי ליצור נתיב אחסון נתונים.
   4. ערוך את הפרוטוקול להקלטת זרמי קיר באופן הבא:
      1. ממשק צורת גל: תקופה A ו-D: סוג = שלב; רמה ראשונה = -60 mV; רמת דלתא = 0 mV; משך ראשון = 100 אלפיות השנייה; משך דלתא = 0 אלפיות השנייה. תקופה ב': סוג = צעד; רמה ראשונה = -160 mV; רמת דלתא = 0 mV; משך ראשון = 1 אלפיות השנייה; משך דלתא = 0 אלפיות השנייה. תקופה C: סוג = רמפה; רמה ראשונה = 40 mV; רמת דלתא = 20 mV; משך ראשון = 500 אלפיות השנייה; משך דלתא = 0 אלפיות השנייה.
      2. ממשק מצב/קצב: עיכוב ניסיון = 0 שניות; ריצות = 1; סוויפ = 1; משך הסריקה = 0.8 שניות.
      3. ממשק יציאות: ערוץ #0; רמת החזקה = −60 mV. שמור ותן לפרוטוקול את השם "פרוטוקול קיר".
         הערה: הגדרת הפרוטוקול מותאמת להקלטות נוכחיות ספציפיות וניתן לעשות בה שימוש חוזר לאחר השמירה. ודא שממשק הפלט תואם את החיווט של המכשיר (למשל, ערוץ #0).
   5. הפעל את פונקציית בדיקת הממברנה בתפריט כלים של תוכנת רכישת הנתונים.
   6. מקם את התא למדידה במרכז תצוגת המצלמה של המיקרוסקופ.
   7. טבלו את קצה חוט הייחוס בתמיסת האמבטיה. מלאו 20% מהמיקרופיפטה (המיוצרת בשלב 3.1) בתמיסה התוך תאית ואבטחו אותה על מחזיק אלקטרודות ההקלטה.
      1. הפעל לחץ חיובי באמצעות מזרק, העבר את קצה הפיפטה לתוך תמיסת האמבטיה, והתאם את היסט הפיפטה באות ampתוכנת liifier כדי להגדיר את קו הבסיס הנוכחי ל-0 pA (ראה איור 3A).
         הערה: השתמש בחוטי ייחוס Ag/AgCl. התנגדות הפיפטה צריכה להיות 4-6 MΩ.
   8. לחץ בעדינות את הפיפטה על קרום התא. שימו לב לעלייה בהתנגדות האיטום (Rt) ל-MΩ 1 לפחות (איור 3B). הסר לחץ חיובי והפעל לחץ שלילי כדי ליצור התנגדות גבוהה עם Rt ≥ 1 GΩ (איור 3C).
      1. הגדר את מתח ההחזקה ל- mV 60- ופצה על קיבוליות האלקטרודה באמצעות Cp Fast ו- Cp Slow (איור 3D).
         הערה: אם Rt נשאר מעל 1 GΩ, המשך לשלב הבא; אחרת, החלף את התא או הפיפטה וחזור על שלבים 3.2.6-3.2.8.
   9. הפעילו לחץ שלילי קצר כדי לקרוע את קרום התא, וליצור תצורה של תא שלם (איור 3E). בחר תא שלם בתוכנת מגבר האות, לחץ על אוטומטי עבור קיזוז קיבוליות הממברנה (איור 3F), טען את פרוטוקול Kir והתחל בהקלטת נתונים. חזור על שלבים 3.2.6-3.2.9 עבור תאים מטופלים.
      הערה: אם התנגדות הסדרה (Ra) היא >30 MΩ, בחר תא חדש. אם 30 MΩ > Ra > 10 MΩ, החל פיצוי התנגדות סדרתי לפני ההקלטה. פרוטוקול זה דורש Ra < 10 MΩ.
3. ניתוח נתונים
   1. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים וטען את הנתונים המוקלטים. השתמש בסמנים כדי לנתח עקבות זרם ולייצא נתונים עבור התוויית עקומת IV.
   2. צור אות צורת גל גירוי על ידי בחירה באפשרות ערוך > צור אות צורת גל גירוי ואשר.
   3. ייצא את המעקב אחר פרוטוקול Kir על-ידי בחירה באפשרות ערוך > מעקבי העברה, ציון אזור המעקב והאות המלאים (A0 #0) והעתקת נתונים להמשך ניתוח.
   4. ייצא מעקבי זרם של Kir מייצג על-ידי בחירה באפשרות ערוך > מעקבי העברה, ציון אזור המעקב והאות המלאים (IN 0) והעתקת נתונים כדי ליצור עלילות מעקב נוכחיות.
      הערה: נרמל את הנתונים הנוכחיים באמצעות צפיפות זרם (pA/pF) להשוואה מדויקת בין תאים בגדלים שונים. ודא שקיבול הממברנה (ס"מ) נרשם במהלך הניסוי¹⁷.

בידוד תאי שריר חלק עורקי
החלק הראשון של ההליך מפרט את תהליך בידוד תאי השריר החלק מהעורק הבסיסי המוחי של החולדה. תהליך זה מתואר באיור 1. ההליך כולל שלבי עיכול אנזימטיים והפרדת תאים לשחרור תאי שריר חלק מהעורק.

תמונות מייצגות של...

רישום תאים שלמים באמצעות תאים מבודדים טריים מתוארך לתחילת שנות ה-80 של המאה^{ה-20 18}, והרישום של זרמי תעלה מתאי שריר חלק בסיסי של מכרסמים הפך לנהוג באופן נרחב בשנות ה-90¹⁹. עם ההתקדמות הטכנולוגית, החוקרים מתמקדים יותר ויותר בתוצאות שהושגו באמצעות טכנול...

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית הכישרונות המיוחדים של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית עבור "תוכנית קידום מחקר של חוקרי שינגלין וכישרונות דיסציפלינה" (33002324) ופרויקט מחקר ופיתוח מרכזי להצגת כישרונות מדעיים וטכנולוגיים ברמה גבוהה בעיר לוליאנג (2022RC28).