Registro de las corrientes de K⁺ rectificadoras hacia adentro en células musculares lisas de la arteria basilar recién aisladas mediante la técnica de patch clamp

Este protocolo describe un método rápido y eficiente para aislar las células musculares lisas de la arteria basilar de rata y registrar las corrientes de los canales de potasio rectificadoras hacia adentro en estas células utilizando la técnica de pinzamiento de parche de célula completa. Ofrece un enfoque novedoso para los investigadores que estudian la arteria basilar y los canales iónicos.

La enfermedad cerebrovascular es una afección prevalente entre las personas mayores, con una incidencia en constante aumento. La arteria basilar es un vaso cerebral crítico que irriga la protuberancia, el cerebelo, las regiones posteriores del cerebro y el oído interno. La actividad de los canales de potasio (K⁺) juega un papel importante en la determinación del tono vascular mediante la regulación del potencial de membrana celular. La activación de los canales de K⁺ rectificadores hacia adentro (Kir), al igual que otros canales de K⁺ , conduce a la hiperpolarización y vasodilatación de la membrana celular. En este estudio, se utilizaron células de músculo liso recién aisladas de la arteria basilar para registrar las corrientes de Kir mediante la técnica de pinzamiento de parche de célula completa. Se investigaron los efectos de 100 μmol/L de BaCl₂, un inhibidor del canal Kir, y 10 μmol/L de nitroprusiato sódico (SNP), un nitrovasodilatador, sobre las corrientes del canal Kir. Los resultados demostraron que BaCl₂ inhibió las corrientes del canal Kir en las células del músculo liso de la arteria basilar, mientras que el SNP mejoró estas corrientes. Este protocolo proporciona una guía completa para la preparación de células de músculo liso arterial recién aisladas y el registro de las corrientes del canal Kir utilizando la técnica de pinza de parche, lo que ofrece un recurso valioso para los investigadores que buscan dominar este método.

La enfermedad cerebrovascular es una afección prevalente en la población anciana. Con las mejoras en los niveles de vida, el aumento de la esperanza de vida y el envejecimiento de la población, la incidencia de enfermedades cerebrovasculares está aumentando constantemente¹. La arteria basilar, un vaso no apareado formado por la fusión de las arterias vertebrales bilaterales, corre por debajo de la protuberancia dentro del cráneo y se divide en dos arterias cerebrales posteriores. Irriga la protuberancia, el cerebelo, las regiones posteriores del cerebro y el oído interno. Un suministro insuficiente de sangre a la arteria basilar puede provocar vértigo episódico, a menudo acompañado de náuseas y vómitos. Los pacientes también pueden experimentar síntomas como tinnitus, pérdida de audición y otros problemas relacionados. Estos síntomas se asocian frecuentemente con afecciones como la espondilosis cervical, la aterosclerosis cerebral y la presión arterial anormal. La enfermedad cerebrovascular, particularmente prevalente entre las personas de mediana edad y ancianos, a menudo está relacionada con estas condiciones subyacentes ^2,3,4.

Las arterias de resistencia desempeñan un papel vital en la función cardiovascular y en el mantenimiento de la homeostasis corporal. Como sitio primario de resistencia vascular, regulan la presión arterial y el gasto cardíaco, asegurando un flujo sanguíneo suficiente para satisfacer las demandas metabólicas y fisiológicas de los tejidos y órganos⁵. La arteria basilar, clasificada como una arteria de resistencia, regula principalmente el flujo sanguíneo al tronco encefálico⁶. Las células musculares lisas, que forman las paredes de las arterias de resistencia, son mediadores clave de la resistencia vascular a través de la regulación de la contracción en estado estacionario o la tensión vascular. Estas células albergan numerosos canales iónicos, incluidos los canales K⁺, los canales Ca²⁺ y los canales Cl^-, que son críticos para la modulación del tono vascular ^5,7.

Los canales de K⁺ son críticos para establecer el potencial de membrana y regular el tono contráctil^{de las células} del músculo liso arterial. Hay cuatro tipos de canales de K⁺ en el músculo liso arterial: K⁺ dependiente del voltaje (Kᴠ), K⁺ dependiente de Ca²⁺ (K_Ca), K⁺ dependiente de ATP (K_ATP) y canales rectificadores internos K⁺ (Kir) ^9,10,11. Los canales Kir se clasifican en siete subtipos, siendo Kir2.x los canales Kir clásicos. Entre estas, las subfamilias Kir2.x son las más relevantes en la vasculatura. Las corrientes Kir exhiben una rectificación hacia adentro a voltajes negativos, lo que indica una afluencia neta de K⁺ en la celda, mientras que a voltajes positivos, hay un flujo de corriente Neta K^{+ mínimo o} nulo 5. En el sistema cardiovascular, los canales Kir son esenciales para estabilizar el potencial de membrana. Su activación induce hiperpolarización y vasodilatación de la membrana celular 12,13,14.

Se han llevado a cabo experimentos de patch-clamp en células de músculo liso recién aisladas en varias arterias, incluyendo las arterias coronarias, cerebrales, renales y mesentéricas^15,16. Si bien algunos métodos utilizan el mismo tipo de colagenasa para el aislamiento celular, los procedimientos precisos varían. Pocos estudios han resumido exhaustivamente los métodos para aislar las células del músculo liso vascular. Por lo tanto, este estudio se centra en el aislamiento fresco de células primarias de músculo liso vascular de la arteria basilar de rata y el registro de las corrientes del canal Kir en estas células utilizando la técnica de pinzamiento de parche de célula completa, proporcionando un protocolo detallado y completo para los investigadores en campos relacionados.

El protocolo animal fue aprobado por el Comité de Ética de Bienestar Animal del Laboratorio de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Registro No. 2024035). En este estudio se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley (SD), con un peso de 260-300 g y una edad de 8-10 semanas. A los animales se les proporcionó agua y alimento (alimento experimental SPF) ad libitum. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Disección de la arteria basilar de rata

1. Preparación de la solución
   1. Prepare las soluciones como se describe en la Tabla 1.
2. Anestesiar a la rata por inhalación de isoflurano al 2%. Confirme la anestesia profunda con un pellizco en el dedo del pie. Si es necesario, administre anestésicos adicionales. Proceda inmediatamente a abrir el cráneo y exponer el cerebro en la mesa de operaciones portátil.
3. Transfiera rápidamente el cerebro a una placa de Petri que contenga PSS saturada con 95% de_O2 y 5% de CO₂ a 4 °C. Asegúrate de que la solución tenga un pH de 7,40.
4. Coloque el cerebro ventralmente hacia arriba en una placa de Petri y asegúrelo con agujas. Bajo un microscopio óptico, localice la arteria basilar y extraiga cuidadosamente el tejido circundante con pinzas y tijeras esterilizadas en autoclave (véase la figura 1A).
5. Inserte un alambre de 2 cm de largo con un diámetro de 25 μm en la arteria basilar aislada. Frote suavemente la pared interna con el alambre para eliminar eficazmente el endotelio vascular.
   NOTA: La arteria basilar en ratas está situada dentro de los surcos basales del tronco encefálico en la base del encéfalo y está formada por la confluencia de las arterias vertebrales izquierda y derecha². Durante el proceso de aislamiento, manipule la arteria con cuidado para evitar un estiramiento o compresión excesivos que podrían provocar daños.

2. Aislamiento de las células del músculo liso

1. Precaliente 1 mL de solución de separación celular, 1 mL de hidrolizado enzimático I y 1 mL de hidrolizado enzimático II a 37 °C en los tubos de ensayo 1, 2 y 3, respectivamente (ver Figura 1B).
2. Transfiera la arteria basilar aislada al tubo de ensayo 2. Inyecte continuamente una mezcla de 95% de_O2 y 5% de CO₂ en el tubo, y mantenga el tratamiento enzimático durante 30 min (ver Figura 1C).
3. Transfiera la arteria basilar del tubo de ensayo 2 al tubo de ensayo 3. Continúe inyectando 95% de_O2 y 5% de CO₂ en el tubo, y mantenga el tratamiento enzimático durante 5 min (ver Figura 1D).
4. Añada 1 mL de solución de separación de células a 37 °C del tubo de ensayo 1 en el tubo de ensayo 3. Continuar inyectando 95% de_O2 y 5% de CO₂ mientras se mantiene el tratamiento enzimático durante 3 min. Triturar la preparación de la arteria basilar para liberar células (véase la figura 1E).
5. Agregue una solución de separación de 4 °C al tubo de ensayo 3 para terminar el proceso enzimático (ver Figura 1F). Centrifugar la mezcla a 59 × g durante 6 min. Deseche el sobrenadante con una pipeta, vuelva a añadir una solución de separación a 4 °C (véase la figura 1G) y repita la centrifugación dos veces para eliminar las enzimas residuales.
6. Retire el sobrenadante con una pipeta y almacene 1 ml de la suspensión celular a 4 °C durante un máximo de 6-8 h.
7. Tome 100 μL de la suspensión celular y colóquela en el baño (ver Figura 1H). Agregue 1 mL de líquido extracelular al baño y deje que las células se asienten durante 40 min para que se adhieran al fondo (ver Figura 2).
   NOTA: Para las células del grupo de tratamiento (por ejemplo, BaCl₂ o nitroprusiato de sodio), preincubar con las sustancias respectivas a temperatura ambiente (22-26 °C) durante 40 minutos durante el período de fijación.

3. Registro de la corriente Kir usando una abrazadera de parche de celda completa

1. Fabricación de micropipetas
   1. Encienda el extractor de micropipetas (consulte la Tabla de materiales).
   2. Coloque un tubo de vidrio (diámetro exterior: 1,5 mm, diámetro interior: 1,10 mm, longitud: 10 cm) en el extractor. Seleccione Programa 1, haga clic en Entrar y acceda al Programa 1. Realice una prueba de rampa haciendo clic en Rampa en el panel de control para medir el valor calorífico del tubo de vidrio.
      NOTA: Edite el Programa 1 con los siguientes parámetros: Calor: Rampa, Tirón: 0, Velocidad: 25, Retardo: 1, Presión: 500, Modo: Retardo, Calor seguro habilitado. La prueba de rampa debe realizarse al cambiar los tipos de filamentos o pipetas de vidrio. Las micropipetas deben tener un diámetro de punta de ~1-2 μm y una longitud de cono de aproximadamente 5 mm. Los diámetros de punta más pequeños y los conos más largos dan como resultado una mayor resistencia de la pipeta.
   3. Inserte un nuevo tubo de vidrio y seleccione Programa 1. Haga clic en Enter para fabricar la micropipeta.
2. Grabación de Kir Current
   1. Encienda los dispositivos de hardware secuencialmente: convertidor de digital a analógico, amplificador de señal, micromanipulador, microscopio, cámara y computadora.
   2. Inicie el software en el siguiente orden: cámara, amplificador de señal y software de adquisición de datos.
      NOTA: Si un microscopio no está equipado con una cámara, solo es necesario activar el software del instrumento. Asegúrese de que el software se abra después de la inicialización del hardware para permitir la funcionalidad adecuada.
   3. En el software de adquisición de datos, seleccione Archivo > Establecer nombres de archivos de datos para establecer una ruta de almacenamiento de datos.
   4. Edite el protocolo para registrar las corrientes Kir de la siguiente manera:
      1. Interfaz de forma de onda: Época A y D: Tipo = paso; Primer nivel = −60 mV; Nivel delta = 0 mV; Primera duración = 100 ms; Duración delta = 0 ms. Época B: Tipo = paso; Primer nivel = −160 mV; Nivel delta = 0 mV; Primera duración = 1 ms; Duración delta = 0 ms. Época C: Tipo = rampa; Primer nivel = 40 mV; Nivel delta = 20 mV; Primera duración = 500 ms; Duración delta = 0 ms.
      2. Interfaz de modo/velocidad: Retardo de prueba = 0 s; Carreras = 1; Barridos = 1; Duración del barrido = 0,8 s.
      3. Interfaz de salidas: Canal #0; Nivel de retención = −60 mV. Guarde y asigne un nombre al protocolo como "Protocolo Kir".
         NOTA: La configuración del protocolo se adapta a grabaciones actuales específicas y se puede reutilizar después de guardar. Asegúrese de que la interfaz de salida coincida con el cableado del instrumento (por ejemplo, canal #0).
   5. Habilite la función Prueba de membrana en el menú Herramientas del software de adquisición de datos.
   6. Coloque la célula para la medición en el centro de la vista de la cámara del microscopio.
   7. Sumerja la punta del alambre de referencia en la solución del baño. Llene el 20% de la micropipeta (fabricada en el paso 3.1) con la solución intracelular y asegúrela en el soporte del electrodo de registro.
      1. Aplique presión positiva con una jeringa, mueva la punta de la pipeta a la solución de baño y ajuste el desplazamiento de la pipeta en el software del amplificador de señal para establecer la línea de base actual en 0 pA (consulte la Figura 3A).
         NOTA: Utilice cables de referencia Ag/AgCl. La resistencia de la pipeta debe ser de 4-6 MΩ.
   8. Presione suavemente la pipeta contra la membrana celular. Observe un aumento en la resistencia del sello (Rt) a al menos 1 MΩ (Figura 3B). Elimine la presión positiva y aplique presión negativa para establecer una resistencia alta con Rt ≥ 1 GΩ (Figura 3C).
      1. Ajuste el voltaje de retención a -60 mV y compense la capacitancia del electrodo usando Cp rápido y Cp lento (Figura 3D).
         NOTA: Si Rt permanece por encima de 1 GΩ, continúe con el siguiente paso; De lo contrario, sustituya la célula o la pipeta y repita los pasos 3.2.6-3.2.8.
   9. Aplique una breve presión negativa para romper la membrana celular, formando una configuración de célula completa (Figura 3E). Seleccione Whole Cell en el software del amplificador de señal, haga clic en Auto para la compensación de capacitancia de membrana (Figura 3F), cargue el protocolo Kir y comience el registro de datos. Repita los pasos 3.2.6-3.2.9 para las células tratadas.
      NOTA: Si la resistencia en serie (Ra) es de >30 MΩ, seleccione una nueva celda. Si 30 MΩ > Ra > 10 MΩ, aplique una compensación de resistencia en serie antes de grabar. Este protocolo requiere Ra < 10 MΩ.
3. Análisis de datos
   1. Abra el software de análisis de datos y cargue los datos registrados. Utilice los cursores para analizar las trazas actuales y exportar datos para el trazado de curvas I-V.
   2. Cree una señal de forma de onda de estímulo seleccionando Editar > Crear señal de forma de onda de estímulo y confirme.
   3. Exporte el seguimiento del protocolo Kir seleccionando Editar > transferir seguimientos, especificando la región de seguimiento completa y la señal (A0 #0) y copiando los datos para su posterior análisis.
   4. Exporte trazas representativas de la corriente de Kir seleccionando Editar > transferir trazas, especificando la región de traza completa y la señal (IN 0) y copiando los datos para generar trazados de trazas actuales.
      NOTA: Normalice los datos actuales utilizando la densidad de corriente (pA/pF) para una comparación precisa entre celdas de diferentes tamaños. Asegúrese de que la capacitancia de la membrana (Cm) se registre durante el experimento¹⁷.

Aislamiento de células del músculo liso arterial
La primera sección del procedimiento detalla el proceso de aislar las células musculares lisas de la arteria basilar cerebral de la rata. Este proceso se ilustra en la Figura 1. El procedimiento implica pasos de digestión enzimática y separación celular para liberar las células musculares lisas de la arteria.

Imágenes representativas de células ...

El registro de células completas utilizando células recién aisladas se remonta a principios de la década de 1980¹⁸, y el registro de las corrientes de canal de las células del músculo liso basilar de roedores se practicó ampliamente en la década de 1990¹⁹. Con los avances tecnológicos, los investigadores se centran cada vez más en los resultados obtenidos a través de estas tecnologías. Sin embargo, la atención prestada a la act...

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este trabajo contó con el apoyo del Programa Especial de Talentos de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu para el "Plan de Promoción de la Investigación de Talentos de Xinglin Scholars and Discipline" (33002324) y el Proyecto Clave de Investigación y Desarrollo para la Introducción de Talentos Científicos y Tecnológicos de Alto Nivel en la Ciudad de Luliang (2022RC28).