Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אורגנואידים תלת-ממדיים בכבד שמקורם ב-iPSC מהווים כלי פוטנציאלי להבנת פעולת הורמון בלוטת התריס על התפתחות הכבד.

Abstract

השגת תאי כבד יציבים בתרבית מהווה אתגר משמעותי למחקרי כבד. בהתחשב בכך, מתוארת שיטה אופטימלית המשתמשת בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs) ליצירת תרביות תלת מימד של אורגנואידים בכבד אנושי (HHOs). השימוש ב-HHOs מציע גישה רבת ערך להבנת התפתחות הכבד, חשיפת מחלות כבד, ביצוע מחקרים בתפוקה גבוהה לפיתוח תרופות וחקר הפוטנציאל להשתלת כבד. במחקר הקודם, באמצעות אימונופלואורסצנציה וטכניקות RT-PCR כמותיות, נוטר ההתקדמות, וזיהה את נוכחותן של אוכלוסיות תאים שונות, כגון הפטובלסטים ושני סוגי התאים שמקורם בהפטובלסטים: כולנגיוציטים או תאים דמויי הפטוציטים, בשלבי התפתחות שונים. דוח זה מציג פרוטוקול תלת מימד פשוט החל מ-hiPSC ועד לרכישת HHOs המשקפים את שלבי התפתחות העובר האנושי. הפרוטוקול, המשתרע על פני 46-50 יום, כולל מספר שלבים: (i) ניהול קפדני של תרבית hiPSC ליצירת HHOs, (ii) התחלת התמיינות תאים בדו-ממד והמעבר לאחר מכן לתלת-ממד, ו-(iii) אסטרטגיית דיסוציאציה אופטימלית לפירוק HHOs לתאים בודדים לריצוף RNA של תא בודד. כהמחשה ליישומים הרחבים של גישה זו, הפרוטוקול הנוכחי יושם בעבר כדי לחשוף את תפקידו של איתות הורמון בלוטת התריס בהתפתחות תאי כבד.

Introduction

הכבד מבצע פונקציות מטבוליות מגוונות, כגון ויסות הזמינות של מצעי אנרגיה שמישים כמו גופי גלוקוז וקטון, כמו גם ניקוי רעלים מתרכובות קסנוביוטיות. בשנים האחרונות חלה עלייה משמעותית בשכיחות מחלות כבד, המיוחסות בעיקר לדלקת כבד לא אלכוהולית (NASH), שאם לא מטפלים בה, עלולה להתקדם לשחמת או לסרטן1. לכן, חובה להבין את התפקודים המטבוליים של הכבד והמחלות הקשורות אליו כדי להקל על פיתוח טיפולים יעילים 2,3.

הופעתן של תרבויות תלת מימדיות (תלת מימד) הובילה ליצירת מודל האורגנואידים, המייצג גישה פורצת דרך וחדשנית לטיפול בפונקציונליות ובמורכבות של התפתחות איברים4. אורגנואידים מוגדרים כאגרגטים תלת מימדיים המאורגנים בעצמם של תאים מובחנים המחקים את הפונקציות והציטו-ארכיטקטורה של האיבר המתאים5.

במהלך העשורים האחרונים, מספר עצום של פרוטוקולים של אורגנואידים בכבד אנושי (HHO) זכו לעניין נרחב, החל משימוש בתאים מגוונים שמקורם ב-iPSC אנושי6 או רק תאים דמויי הפטוציטים7 ועד לשילוב של מגוון מיקרו-סביבות מורכבות של גורמי גדילה או מעכבים והתמיינות תאי אב בשכבהאחת 7 או 3D8. גישות אלה מתאימות למספר רב של מטרות פוטנציאליות, החל מסריקת תרופות בתפוקה גבוהה9 ועד להשגת תובנות נוספות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס מחלות כבד10.

כאן, מבוצע פרוטוקול שלב אחר שלב של התמיינות HHO המבוסס על הרמזים הכימיים שהוזכרו11 , עם וריאציות מותאמות מתודולוגית. פרוטוקול זה מתחיל בטיפול וטיפוח מתאימים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSC), המפרט טכניקות למניפולציה של ג'ל מטריצה חוץ-תאית, מעבר תאים והתמיינות ל-HHOs. התהליך מתחיל בגירוי ההתמיינות של hiPSCs לאנדודרם סופי (DE)12 ולאחר מכן חיקוי ההשפעות in vivo של FGF ו-BMP כדי לקדם את התפתחותם של תאים חד-שכבתיים אחוריים (PFG)13. הארכיטקטורה התלת מימדית מושגת ביום 10 כאשר תאי ה-PFG מתמיינים לשלב כבד לא בוגר שיהפוך להפטובלסטים, תא המבשר העוברי של כולנגיוציטים והפטוציטים2. לבסוף, המבנים התלת-ממדיים מפורקים לתאים בודדים למחקרי ריצוף RNA. כדוגמה לתחולת פרוטוקול זה, הודגם כיצד מודל HHO זה מתאים לחקר פעולת הורמון בלוטת התריס וסוג 2 של דיודינאז (D2) על התפתחות הפטוציטים וכולנגיוציטים14.

Protocol

1. ניהול hiPSC

הערה: hiPSCs (קו תאים CS03iCTR-n3) נרכשו מסחרית. הניהול הנכון של ציפוי ג'ל המטריצה החוץ-תאית ומדיום ה-hiPSC הוא המפתח לחיבור ה-hiPSCs לצלחות ולהזנתם. כאן תוארו הנפחים הדרושים לצלחת אחת בת 6 בארות. ה-hiPSCs הנותרים מלוח 6 הבארות, שלא יתמיינו לאורגנואידים, עשויים להיות מאוחסנים בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

  1. חלוקת ג'ל מטריצה חוץ-תאית ומדיום hiPSC
    1. יש להפשיר כראוי את הבקבוק של ג'ל המטריצה החוץ-תאית, על ידי הנחתו במיכל עם קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: לפני הצעת מחיר, בדוק את אישור הניתוח כדי לאמת את הנפח עבור גורם הדילול. זה מייצג את ריכוז החלבון של ג'ל המטריצה החוץ-תאית; לכן, זה משתנה ממגרש אחד למשנהו.
    2. מחלקים ג'ל מטריצה חוץ-תאית למינונים מתאימים בהתאם לגורם הדילול (4x, 2x ו-1x) באמצעות צינורות מקוררים מראש ומסומנים. הוסף גורם דילול פי 4 של ג'ל מטריקס חוץ-תאי ל-25 מ"ל של DMEM/F12 קר כדי לצפות ארבע צלחות של 6 בארות. אטמו מיד את המכסים בסרט איטום מעבדה והקפיאו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הימנע מחשיפה ממושכת לאוויר ויצירת בועות במחירים.
    3. יש להפשיר 100 מ"ל של מדיום תוסף hiPSC בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הוסף אותו ל-400 מ"ל של מדיום בסיסי hiPSC. לאחר הומוגניזציה עם פיפטה סרולוגית של 50 מ"ל, מכניסים את מדיום ה-hiPSC לצינורות של 40 מ"ל ומקפיאים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. ציפוי צלחת לתרבית hiPSC
    1. ספר ותייג את לוחות 6 הבארות. שמור ג'ל מטריקס חוץ-תאי אחד בקרבת מקום, טבול בקרח יבש.
    2. לציפוי צלחת אחת של 6 בארות, יש לדלל ג'ל מטריצה חוץ-תאית אחת (1x) ל-6.25 מ"ל של DMEM/F12 קר (2x ל-12.5 מ"ל ו-4x ל-25 מ"ל של DMEM/F12).
    3. פיפטה נפח קטן של DMEM/F12 (~500 מיקרוליטר) לתוך צינור הג'ל החוץ-תאי. סובב למעלה ולמטה כדי להפשיר ולהומוגניזציה של ג'ל המטריצה החוץ-תאי עם DMEM/F12 קר, למנוע יצירת בועות, ולהחזיר אותו לשאר הצינור הקר המכיל DMEM/F12 באמצעות פיפטה סרולוגית לערבוב מלא.
    4. הטמע 1 מ"ל של ג'ל מטריקס חוץ-תאי ב-DMEM/F12 לבאר אחת לציפוי צלחת 6 הבארות (6 מ"ל לכל הצלחת). מחלקים את 1 מ"ל באופן שווה על פני השטח על ידי הזזת הצלחת מבלי לנער אותה עד לכיסוי מלא.
    5. יש להניח בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת לפני השימוש. אם צלחת 6 הבארות אינה בשימוש מלא, אטום אותה בסרט איטום מעבדה ואחסן אותה במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן צלחת מצופה למשך שבוע במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. הפשרה ותרבות של hiPSC
    1. חשב מראש את נפח מדיום ה-hiPSC והחם ב-RT יחד עם הצלחת המצופה 6 בארות שעה לפני השימוש (2 מ"ל לבאר).
      הערה: במקרה של מנות קרות או קפואות, טבלו אותן באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס או באמבט מים 15 דקות לפני השימוש.
    2. פיצול 1 מ"ל של hiPSCs בנוזל N2 מקריוביאל ל-3 בארות של צלחת של 6 בארות (יחס של 1:3). לצלחת שלמה של 6 בארות, השתמש ב-2 קריוביאלים. כאן, הפרוטוקול מתאר את ההפשרה והתרבות של hiPSCs מקריוביאל אחד. חזור על התהליך עבור 2 קריוביאלים.
    3. הכניסו את הקריוביאל המכיל כ-1 מ"ל של hiPSCs קפואים על ידי החזקתו דרך הפקק והחלקתו דרך המים השטחיים, כאשר תחתית הבקבוקון טובלת באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה.
    4. לאחר ההפשרה, יש לרסס את הקריוביאל באתנול ופיפטה את ה-1 מ"ל של hiPSCs. יש להוציא לאט בשפופרת חרוטית ריקה של 15 מ"ל. יש להוסיף 5 מ"ל של hiPSC בינוני חם טיפה אחר טיפה תוך ניעור עדין של הצינורית.
    5. צנטריפוגה את הצינור ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. הסר בעדינות את הסופרנטנט על ידי שאיבה עם פיפטת זכוכית המחוברת לוואקום מבלי לשבש את הגלולה, ולהשאיר מדיום שיורי כלשהו. השעו בזהירות את הגלולה ב-6 מ"ל בינוני ולאחר מכן הוסיפו 2 מ"ל לבאר ב-3 בארות של צלחת 6 הבארות.
      הערה: השאירו אגרגטים קטנים של hiPSCs לצמיחה נכונה.
    6. כופפו את צלחת 6 הבארות ושאבו את ג'ל המטריצה החוץ-תאי מהצלחת שצופה בעבר מבלי לגעת בקצה לתחתית הבאר.
    7. העבירו 2 מ"ל של המדיום עם hiPSCs לכל באר. נער בעדינות את הצלחת קדימה, אחורה ומצד לצד כדי לפזר באופן שווה את אגרגטים hiPSC על הצלחת.
    8. הנח את צלחת 6 הבארות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-95% לחות. החלף את המדיום מדי יום (2 מ"ל לבאר), ובדוק את הצמיחה המתקדמת.
    9. מעבר hiPSCs כאשר נרכש מפגש גדילה של 80% (לאחר 4-5 ימים; ראה איור 1A). המאפיינים של hiPSCs בריאים ומתרבים כוללים גבולות ברורים ואריזה הדוקה של גרעינים גדולים במרכז הצטברות התאים הגדלים.
  4. מעבר של hiPSC
    1. ברגע שה-hiPSCs מגיעים למפגש של 80%, מה שמצביע על כ-1.2 x 106 תאים לבאר, יש לעבור לצלחת חדשה של 6 בארות. פיצול ביחס של 1:3 (מ-1 באר ל-3), או התאם את היחס (1:4; 1:6) בהתאם לדרישות הניסוי.
    2. לפני המעבר, הכינו את הטמעת ג'ל המטריצה החוץ-תאית הנדרשת למספר המתאים של צלחות 6 בארות, כמתואר בשלב 1.2.
    3. מוציאים את הסופרנטנט מכל באר ומוסיפים 2 מ"ל PBS לבאר. שאפו את ה-PBS, ואחריו הוסיפו 1 מ"ל של מדיום ניתוק hiPSC לבאר למשך דקה אחת. לאחר מכן הסר את 1 מ"ל של מדיום ניתוק hiPSC.
    4. מניחים את צלחת 6 הבארות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. יש להוסיף 1 מ"ל של מדיום hiPSC לבאר. נתק ואסוף על ידי פיפטינג של 1 מ"ל של מדיום hiPSC עם תאים לתוך צינור 15 מ"ל.
    5. צנטריפוגה את הצינור ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. כדי לצלחת את התאים לצלחת של 6 בארות, חזור על שלבים 1.3.5-1.3.7. הנח את צלחת 6 הבארות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-95% לחות. עבור לשלב 1.5. להקפיא hiPSC במידת הצורך.
  5. הקפאת hiPSC (אופציונלי)
    הערה: מספר ה-hiPSCs הנדרש לקידום ל-HOs עלול לגרום לשאריות בארות שניתן לאחסן לטווח ארוך. אם יהיה צורך להרחיב את המעבר לאחסון קריוביאלי, ניתן לשמור על ה-hiPSCs לתקופות ממושכות.
    1. הפשירו את הנפח הנדרש של מדיום שימור בהקפאה (1 מ"ל לבאר תאים) לקרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. סמן קריו-צינורות עם מספר המעברים, התאריך וקו התא. נתק תאים עם מדיום ניתוק hiPSC כמו בשלב 1.4. בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. שאפו את הסופרנטנט במלואו, והשאירו בזהירות את כדור התא ללא הפרעה. השעו בזהירות את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום שימור קר (לכל באר) על ידי השארת אגרגטים hiPSC.
      הערה: אם הבארות נמצאות בצפיפות נמוכה, פחות מ-50% קונפלואנט, ניתן להשתמש ב-1 מ"ל של מדיום שימור בהקפאה לכל 2 בארות.
    3. העבר 1 מ"ל של מדיום שימור בהקפאה עם ה-hiPSCs לתוך צינור הקריו. ערבב בעדינות את צינור הקריוטיוב כדי להומוגניזציה של תכולת התא.
      הערה: אם מכינים צינורות נוספים לשימור בהקפאה, השאירו את הצינורות שהוכנו כבר בקרח.
    4. הנח את הצינורות במיכל ההקפאה בקצב מבוקר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. העבירו את הצינורות למיכל החנקן הנוזלי לאחר 24 שעות.

2. התמיינות שלב אחר שלב מ-hiPSC לאורגנואידים בכבד

הערה: ההרכבה מחדש של הריאגנטים בוצעה ובוצעה בהתאם להנחיות היצרן.

  1. בידול דו-ממדי מ-hiPSC ל-DE (יום 0-יום 4 (D-0 עד D-4); איור 1B)
    1. לאחר 3 מעברים, אם התאים בריאים וגדלים היטב ומהר, המשך להתמיינות של hiPSC. מצפים צלחת של 6 בארות כמתואר בשלב 1.2. כדי להבדיל בין hiPSC ל-DE, השתמש בערכת DE על ידי ביצוע הוראות היצרן.
    2. לפני תחילת ההתמיינות, תרבית hiPSCs ביחס מעבר של 2:1 (מ-6 בארות כדי להשיג 3 כדי להתחיל את ההתמיינות) למשך 24 שעות כדי להשיג את ריכוז התאים בבאר המצוינת בהוראות DE.
    3. בצע בידול לפי פרוטוקול היצרן עם השינויים הבאים.
      1. להעלות את הריכוז של Y-27632 שנוסף ל-hiPSC מ-10 מיקרומטר ל-50 מיקרומטר (יום לפני תחילת ההתמיינות).
      2. הגדל 1.5 מ"ל לבאר של מגיב הדיסוציאציה וגם את נפח ה-DMEM/F12 לאותה כמות לבאר כמו מגיב הדיסוציאציה. הוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 (מתוך 1.5) לכל באר, ועוד 0.5 מ"ל שהצטבר לתוך צינור של 15 או 50 מ"ל.
  2. התמיינות של תאי DE לתאי PFG (D-4 עד D-10; איור 1ג)
    1. הכן מדיום PFG (DMEM/F12 מתקדם כמדיום בסיסי, 1x תוסף גלוטמקס, 1x תוסף B27, 20 ננוגרם/מ"ל BMP4, 10 ננוגרם/מ"ל FGF2) להתמיינות תאי DE ימים לפני האינדוקציה ל-PFG ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: B27 מכיל T3 כחלק מהרכבו. במקרה של מחקרי הורמון בלוטת התריס (TH), מכאן והלאה, יש להחליף את B27 ב-B2615 תוצרת בית שאינו מכיל TH.
    2. מחממים את מדיום ה-PFG (2 מ"ל לבאר) ו-DMEM/F12 מתקדם ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות או RT למשך שעה. התכופפו מעל הצלחת ושאבו את מדיום ה- DE מהבארות בעזרת פיפטה מזכוכית המחוברת לוואקום (או ידנית עם פיפטה P1000) מבלי לשרוט את התאים.
    3. הוסף 2 מ"ל DMEM/F12 מתקדם חם לבאר ולאחר מכן שאב אותו. הוסף 2 מ"ל מדיום PFG חם לבאר בצלחת 6 הבארות. החלף את המדיום מדי יום במשך 6 הימים הבאים.
  3. אינדוקציה מתאי PFG דו-ממדיים לאורגנואידים תלת-ממדיים לא בשלים בכבד (IHOs; D-10 עד D-18)
    הערה: כמעט 30,000-35,000 תאים נדרשים ב-30 מיקרוליטר שנוספו לכל באר של צלחת ULA של 96 בארות. יחס המעבר הוא 2:1, מ-2 בארות (צלחת 6 בארות) עם שכבה אחת של תאי PFG מובחנים; הוא יספק צלחת חיבור אולטרה-נמוכה (ULA) מלאה של 96 בארות (איור 1D).
    1. לפני התחלת האורגנואידים התלת-ממדיים או בימים מוקדמים יותר, הכינו מראש את מדיום ה-IHO (DMEM/F12 מתקדם כמדיום בסיסי, תוסף N2 1x, 1x B27, 50 ננומטר A83-01, 30 מיקרומטר דקסמתזון, 5 מיקרומטר CHIR99021, 500 ננומטר חומצה ולפרואית, 50 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי אנושי (EGF), 20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילת הפטוציטים אנושי (HGF), 40 ננוגרם/מ"ל משונן-1, 300 ננוגרם/מ"ל N-6,20-O-dibutyryladenosine 30,50-cyclic 35 מונופוספט מלח נתרן (dbCAMP), 10 מיקרומטר ניקוטינאמיד) ולאחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. סמן לוחית חיבור נמוכה במיוחד (ULA) עם 96 בארות. לניתוק תאי ה-PFG יש להשתמש באנזים דיסוציאציה של התאים בהתאם להוראות היצרן.
    3. יש לחמם את אנזים הדיסוציאציה, DMEM/F12 מתקדם ו-PBS ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. שאפו והשליכו את מדיום ה- PFG של הבארות. הוסף 2 מ"ל PBS לבאר ואז שאב אותו.
    4. הוסף 1.5 מ"ל של אנזים דיסוציאציה של תאים לבאר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות כדי לנתק את התאים מהבאר. מבלי להסיר את אנזים הדיסוציאציה של התאים, הוסף 1 מ"ל של DMEM מתקדם. אוספים את כל התאים ומוסיפים אותם לצינור של 50 מ"ל.
    5. ספרו את מספר התאים למ"ל בעזרת מונה תאים או המוציטומטר. צנטריפוגה ב -150 x גרם למשך 8 דקות.
    6. לגלולה, הוסף את הנפח המתאים (3 מ"ל של מדיום IHO עבור צלחת ULA שלמה של 96 בארות) וג'ל מטריצה חוץ-תאי 1x כדי להתאים למספר התאים הסופי הדרוש (30,000-35,000 תאים).
    7. הנח את צלחת 96 הבארות בחממה המוגדרת עד 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-95% לחות. לאחר 24 שעות (D-11), התאים יתקבצו מחדש בצורה מעגלית; הוסף 50 מיקרוליטר לבאר של מדיום ה-IHO.
    8. למחרת (D-12), הגדילו ל-100 מיקרוליטר של מדיום IHO לבאר. ב-D14, הסר ~100-120 מיקרוליטר מכל באר עם פיפטת הזכוכית המחוברת לוואקום או עם פיפטה בזה אחר זה. הקפד לא לשאוב את האורגנואידים. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום IHO ב-D-14 ו-D-16.
      הערה: לאחר D-16, עקב אי הכנסתו לתנועה, מופיעה צמיחה מוגזמת שנעלמת לאחר D18.
  4. אורגנואידים הפטובלסטים (HBOs, D-18 עד D-26)
    הערה: בשלב זה, IHOs מלוח ULA של 96 בארות יועברו לצלחת ULA של 6 בארות. עבור 96 IHOs מהשלב הקודם, הוצבו 10 אורגנואידים לכל באר, המייצגים בסך הכל 1 ו-1/2 לוחות ULA של 6 בארות כדי להמשיך בהתבגרות (איור 1E).
    1. כפי שנעשה בשלבי הבידול הקודמים, הכינו את מדיום הבידול של HBO בימים הקודמים.
      1. קוקטייל הריאגנטים המשמש להתמיינות ל-HBO מתואר בשלב 2.3. הסר חומצה ולפרואית ושלב בקוקטייל את הביוכימיקלים הבאים: BMP7, BMP4 ו-FGF7. ההרכב הסופי הוא DMEM/F12 מתקדם כמדיום בסיסי, תוסף N2 1x, 1x B27, 50 ננומטר A83-01, 30 מיקרומטר דקסמתזון, 5 מיקרומטר CHIR99021, 500 ננומטר חומצה ולפרואית, 50 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי אנושי (EGF), 20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילת הפטוציטים אנושי (HGF), 40 ננוגרם/מ"ל משונן-1, 300 ננוגרם/מ"ל N-6,20-O-דיבוטירילדנוזין 30,50-מחזורי 35 מלח נתרן מונופוספט (dbCAMP), 10 מיקרומטר ניקוטינאמיד, 25 ננוגרם/מ"ל FGF7, 50 ננוגרם/מ"ל BMP4, 20 ננוגרם/מ"ל BMP7.
    2. חם בעבר HBO בינוני (3 מ"ל לבאר) ומתקדם DMEM/F12 (3 מ"ל לבאר) ב-37 מעלות צלזיוס. הוסף 3 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם חם לכל באר.
    3. מחלקים 10 אורגנואידים IHO לבאר מצלחת 96 הבארות עם קצה קדח ברוחב 200 מ"ל. הסר את ה-DMEM/F12 המתקדם על ידי כיפוף מעל הצלחת ויניקתה עם פיפטת הזכוכית המחוברת לוואקום (או באופן ידני עם P1000).
    4. הוסף 3 מ"ל של מדיום HBO חם לבאר. הפעל והנח את צלחות ה-ULA בעלות 6 הבארות על שייקר רב פלטפורמות ב-65 סל"ד בתוך החממה המוגדרת ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-95% לחות. לאחר 4 ימים (D-22) ו-6 ימים (D-24), החלף את מדיום HBO (3 מ"ל לבאר).
  5. התבגרות לאורגנואידים בכבד (HO) דרך 2 שלבים שונים (D-26 עד D-46)
    הערה: זהו תהליך ההתבגרות האחרון המתרחש בשתי תקופות של בידול עקב התוכן וסוג הריאגנטים במדיום.
    1. הכינו מראש את הראשון של מדיום HO (HO1) ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את Jagged1 והפחת את ריכוז CHIR99021 בהשוואה למדיום HBO. ההרכב הסופי הוא: DMEM/F12 מתקדם כמדיום בסיסי, תוסף N2 1x, 1x B27, 500 ננומטר A83-01, 30 מיקרומטר דקסמתזון, 2 מיקרומטר CHIR99021, 50 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי אנושי (EGF), 20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילת הפטוציטים אנושי (HGF), 300 ננוגרם/מ"ל N-6,20-O-דיבוטירילדנוזין 30,50-מחזורי 35 מלח נתרן מונופוספט (dbCAMP), 10 מיקרומטר ניקוטינאמיד, 25 ננוגרם/מ"ל FGF7, 20 ננוגרם/מ"ל BMP4, 20 ננוגרם/מ"ל BMP7.
    2. יש לחמם את מדיום DMEM/F12 ו-HO1 המתקדם ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. באותה צלחת ULA בעלת 6 בארות, שאפו בזהירות את מדיום ה- HBO הקודם על ידי כיפוף מעל הצלחת והנחת קצה פיפטת הזכוכית המחוברת לוואקום כנגד הקיר (או ידנית עם פיפטה P1000).
    3. הוסף 3 מ"ל DMEM/F12 מתקדם חם לבאר ושאף אותו. יש להוסיף 3 מ"ל של מדיום HO1 חם לכל באר. החלף את מדיום HO1 כל 3 ימים (D-29, D-32, D-35, D-38) יחד עם איסוף הדגימות.
    4. ב-D 38, שנה את קוקטייל הריאגנטים לתקופה השנייה של HO (HO2) על ידי הסרת CHIR99021, BMP4, dbcAMP ו-FGF7 והחלפתם ב-FGF19 ו-DAPT. הרכב המדיום הסופי הוא DMEM/F12 מתקדם כמדיום בסיסי, תוסף N2 1x, 1x B27, 500 ננומטר A83-01, 30 מיקרומטר דקסמתזון, 50 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי אנושי (EGF), 20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילת הפטוציטים אנושי (HGF), 10 מיקרומטר ניקוטינאמיד, 20 ננוגרם/מ"ל BMP7, 25 ננוגרם/מ"ל FGF19, 5 מיקרומטר DAPT.
    5. יש לחמם את מדיום DMEM/F12 ו-HO2 המתקדם ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. המשך עם אותה צלחת ULA בעלת 6 בארות, ושאף בזהירות את מדיום ה- HO1 הקודם. הוסף 3 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם לכל באר והסר אותו.
    6. יש להוסיף 3 מ"ל של מדיום HO2 חם לבאר. החלף את מדיום HO2 כל 4 ימים (D-42, D-46, D-50, ...) וקח דגימות באותם ימים שבהם המדיום מוחלף.

3. דיסוציאציה של תא בודד

הערה: שלב זה הוא קריטי לטכניקת ריצוף RNA של תא בודד. מספר האורגנואידים עשוי להשתנות בהתאם לגודל, וככל שיום הדיסוציאציה מבוגר יותר, כך כמות התאים באורגנואידים גדולה יותר. בימים קדומים יותר, מספר האורגנואידים המנותקים גדל, וזמני הדיסוציאציה הצטמצמו בכמויות שוות. דיסוציאציה בוצעה עם 10 אורגנואידים ב-D-14 ו-D-17, 8 אורגנואידים ב-D-23 ו-D-26, ו-6 אורגנואידים ב-D-30 ו-D-45. הנהלים עבור אשכול אחד של אורגנואידים מפורטים (איור 1F).

  1. הכנת ריאגנטים
    1. הכן את Advanced-DMEM עם ריכוז סופי של 7.5% אלבומין בקר שבר V (BSA) וסנן לאחר הומוגניזציה.
    2. הכן 1 מ"ל של מדיום אנזים הדיסוציאציה עם 1 מ"ל טריפסין 0.5% - EDTA (10x) כמדיום בסיסי, 50 מיקרומטר Y-27632, מעכב 40 U/μL RNase ו-1 U/μL DNase I.
    3. הכן את מדיום האינאקטיבציה של טריפסין עם 2 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם + 7.5% BSA כמדיום בסיסי, 50 מיקרומטר Y-27632, מעכב 40 U/μL RNase ו-1 U/μL DNase I.
    4. יש לחמם את המדיה ואת PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחילים.
  2. דיסוציאציה של HHOs
    1. נקו את מקום העבודה והכלים עם מנקה RNase. אוספים את מספר האורגנואידים לפי יום ההתמיינות בצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל עם קצה פתוח לרווחה.
    2. שטפו עם PBS 2x-3x. הוסף 1 מ"ל של מדיום אנזים דיסוציאציה לתוך צינור 15 מ"ל עם אורגנואידים שנאספו ושמור על 37 מעלות צלזיוס בנדנדה ב-30 סל"ד למשך 5 דקות.
      זהירות: היזהר לא להפיל את הצינור מהנדנדה.
    3. לאחר 5 דקות, ראשית, בדוק את המכסה עבור כל האורגנואידים שנותרו, ולאחר מכן שבש מכנית את האורגנואידים עם P1000 על ידי סיבוב למעלה ולמטה פי 10 לכל אורגנואיד (60 פעמים בסך הכל). חזור על אותו שיבוש עם P200. בדוק את מכסה הצינור למקרה שהאורגנואידים נתקעים עליו.
    4. הנח שוב את צינור 15 מ"ל על הנדנדה לתוך החממה למשך 5 דקות נוספות. חזור על התהליך של נקודה 4, התחל בסיבוב למעלה ולמטה P200 והמשך עם פיפטה סרולוגית של 1 מ"ל המחוברת לקצה P10.
    5. הנח שוב את צינור 15 מ"ל על הנדנדה לתוך החממה למשך 5 הדקות האחרונות. במקרה של חוסר דיסוציאציה, השאירו אותו למשך 5 דקות נוספות וחזרו על שיבוש ידני.
    6. הוסף 1 מ"ל של מדיום אינאקטיבציה של טריפסין והומוגניזציה שלו. הניחו צינור פוליפרופילן חדש של 15 מ"ל עם מסננת תאים של 40 מיקרומטר מעל. סנן את 2 מ"ל (תאים עם מדיום אנזים הדיסוציאציה ומדיום האינאקטיבציה של טריפסין) דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור 15 מ"ל.
    7. הוסף עוד 1 מ"ל של מדיום אינאקטיבציה של טריפסין כדי לשחזר את כל התאים שנותרו ממסננת התאים של 40 מיקרומטר.
    8. קח 5 מיקרוליטר של מדיום חד-תאי מעורבב עם 5 מיקרוליטר של תמיסת צבע כדי לספור את מספר התאים המנותקים כדי להמשיך בקיבוע שלהם. ספרו את התאים לאחר צנטריפוגה והשעיה מחדש עם המגיב הראשון של ערכת הקיבוע ובצעו סינון תאים באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרומטר.

תוצאות

כל שלב בפרוטוקול זה של התמיינות הדרגתית מ-hiPSC ל-HHOs הוגדר על ידי שימוש במדידות כמותיות על ידי qPCR ואימונופלואורסצנציה של סמנים ידועים ספציפיים לשלב מהביבליוגרפיה (איור 2). צעד אחר צעד של שתי הטכניקות והתוצאות שהושגו הקשורות לבידול הנכון ל-HOs תוארוב...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מציע פרטים מתודולוגיים שונים על אופן הטיפול ב-hiPSCs ובתרביות האורגנואידים התלת-ממדיות הבאות. זה כולל את שני השלבים הקריטיים העיקריים: (1) ניתוק התרביות הדו-ממדיות ולאחר מכן התפתחותן לאורגנואידים תלת-ממדיים בכבד לאחר 10 ימים, כמו גם (2) דיסוציאציה עדינה של מב?...

Disclosures

אנטוניו סי ביאנקו הוא יועץ ל-Abbvie, Acella, Aligos, Synthonics. למחברים האחרים אין גילויים רלוונטיים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148; ACB).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6462All procedures
1000 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6470All procedures
15 mL Polypropilene Conical TubeFalcon (Corning)352097Dissociation Hepatic Organoids
200 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6465All procedures
3,3',5-Triiodo-L-thyronineSigmaT2877-100Hepatic Organoid differentiation
40 μm Cell Strainer Corning431750Dissociation Hepatic Organoids
50 mL tube Falcon (Corning)352070All procedures
6 well-plate Nunc Cell-Culture Treated MultidishesThermo fisher scientific140675hiPSC maintenance
A83-01 R&D Systems2939/10Hepatic Organoid differentiation
Advanced DMEM/F12Gibco12634010Hepatic Organoid differentiation
ART Wide Bore Filtered Pipette TipsART2069GPKAll procedures
B27 supplement Gibco17504044Hepatic Organoid differentiation
BMP7 R&D Systems354-BP-010/CFHepatic Organoid differentiation
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Gibco15260037Dissociation Hepatic Organoids
BSA, Fraction V, Fatty Acid Free for Tissue CultureGoldBioA-421-100Dissociation Hepatic Organoids
CHIR99021R&D Systems4423/10Hepatic Organoid differentiation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low AttachmentCorning3474Hepatic Organoid differentiation
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Corning3471Hepatic Organoid differentiation
CS03iCTR-n3 human induced Pluripotent Stem Cell lineCedar-sinaihiPSC maintenance
DAPTR&D Systems2634/10Hepatic Organoid differentiation
dbCAMPMillipore SigmaD0627-100MGHepatic Organoid differentiation
DexamethasoneR&D Systems1126/100Hepatic Organoid differentiation
DMEM/F12Gibco11320033hiPSC maintenance
DNAse I, RNase-free, HCThermo Fisher scientificEN0523Dissociation Hepatic Organoids
Falcon 10 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, SterileCorning357551All procedures
Falcon 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, SterileCorning357543All procedures
Falcon 50 mL Serological pipet, Polystyrene, 1.0 Increments, Individually Packed, SterileCorning357550All procedures
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)Stemcell Technologies100-0485Hepatic Organoid differentiation
Glutamax supplementGibco35050061Hepatic Organoid differentiation
L-ThyroxineSigmaT1775-1GHepatic Organoid differentiation
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free, 5 mLCorning354277Extracellular matrix gel
mFreSRStemcell Technologies5855hiPSC cryopreservation medium
mTeSR 5x Supplement Stemcell Technologies100-0276hiPSC medium
mTeSR Plus Stemcell Technologies100-0276hiPSC medium
Multi Platform Shaker Fisherbrand (Thermo Fisher technologies)88861021Hepatic Organoid differentiation
N2 supplement Gibco17502048Hepatic Organoid differentiation
Nicotinamide R&D Systems4106/50Hepatic Organoid differentiation
PBS, pH 7.4Gibco10010023hiPSC maintenance
Recombinant human BMP4  R&D Systems314-BP-010/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human EGFR&D Systems236-EG-200Hepatic Organoid differentiation
Recombinant human FGF basic/FGF2/bFGFR&D Systems233-FB-010/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human FGF19R&D Systems959-FG-025/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human HGFR&D Systems294-HG-005/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant Human Jagged-1 Fc Chimera R&D Systems1277-JG-050Hepatic Organoid differentiation
Recombinant human KGF/FGF7R&D Systems251-KG-010/CFHepatic Organoid differentiation
ReLeSRStemcell Technologies100-0483hiPSC detaching medium
RNAse Inhibitor Ambion, cloned, 40 U/μLInvitrogenAM2682Dissociation Hepatic Organoids
RNase ZapInvitrogenAM9780Dissociation Hepatic Organoids
Sorvall  Legend XT/XF Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75004539All procedures
STEMdiff Definitive Endoderm KitStemcell Technologies5110Hepatic Organoid differentiation
Trypan Blue solution (0.4%) Gibco15250061Dye solution
TrypLE Express EnzymeGibco12604013Cell Dissociation enzyme
Trypsin 0.5% - EDTA (10X) Gibco15400054Dissociation Hepatic Organoids
Valproic acid, sodium saltR&D Systems2815/100Hepatic Organoid differentiation
Vari-Mix Platform Rocker Thermo Fisher scientificM79735QDissociation Hepatic Organoids
Y-27632 dihydrochlorideR&D Systems1254Hepatic Organoid differentiation

References

  1. Peiseler, M., et al. Immune mechanisms linking metabolic injury to inflammation and fibrosis in fatty liver disease - novel insights into cellular communication circuits. J Hepatol. 77 (4), 1136-1160 (2022).
  2. Gordillo, M., Evans, T., Gouon-Evans, V. Orchestrating liver development. Development. 142 (12), 2094-2108 (2015).
  3. Lemaigre, F. P. Mechanisms of liver development: concepts for understanding liver disorders and design of novel therapies. Gastroenterology. 137 (1), 62-79 (2009).
  4. He, C., et al. Liver organoids, novel and promising modalities for exploring and repairing liver injury. Stem Cell Rev Rep. 19 (2), 345-357 (2023).
  5. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  6. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  8. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. J Hepatol. 70 (6), 1145-1158 (2019).
  9. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846.e10 (2021).
  10. Ouchi, R., et al. Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. Cell Metab. 30 (2), 374-384.e6 (2019).
  11. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486.e12 (2020).
  12. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  13. Ang, L. T., et al. A roadmap for human liver differentiation from pluripotent stem cells. Cell Rep. 22 (8), 2190-2205 (2018).
  14. Hidalgo-Álvarez, J., Salas-Lucia, F., Vera Cruz, D., Fonseca, T. L., Bianco, A. C. Localized T3 production modifies the transcriptome and promotes the hepatocyte-like lineage in iPSC-derived hepatic organoids. JCI Insight. 8 (23), e173780 (2023).
  15. . B27 Supplement Available from: https://www.weizmann.ac.il/molgen/hanna/sites/molgen.hanna/files/users/user52/HANNA-LAB-B22-B27-PROTOCOL-V3.pdf (2016)
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  17. Zhu, X., Sun, J. CircHIPK3 regulates melanoma cell behaviors by binding with miR-215-5p to upregulate YY1. Mol Cell Probes. 53, 101644 (2020).
  18. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
  19. Walesky, C., Apte, U. Role of hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) in cell proliferation and cancer. Gene Expr. 16 (3), 101-108 (2015).
  20. Fonseca, T. L., et al. Hepatic inactivation of the type 2 deiodinase confers resistance to alcoholic liver steatosis. Alcohol Clin Exp Res. 43 (7), 1376-1383 (2019).
  21. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
  22. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Commun Biol. 4 (1), 1387 (2021).
  23. Arceneaux, D., et al. A contamination focused approach for optimizing the single-cell RNA-seq experiment. iScience. 26 (7), 107242 (2023).
  24. Matsumoto, K., Nakamura, T. Hepatocyte growth factor: molecular structure and implications for a central role in liver regeneration. J Gastroenterol Hepatol. 6 (5), 509-519 (1991).
  25. Kimura, M., Moteki, H., Ogihara, M. Role of hepatocyte growth regulators in liver regeneration. Cells. 12 (2), 208 (2023).
  26. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Luo, J. HGF-, EGF-, and dexamethasone-induced gene expression patterns during formation of tissue in hepatic organoid cultures. Gene Expr. 11 (2), 55-75 (2003).
  27. Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel). 10 (2), 131 (2023).
  28. Baxter, M., et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes. J Hepatol. 62 (3), 581-589 (2015).
  29. Blohm, M. E., Vesterling-Hörner, D., Calaminus, G., Göbel, U. Alpha 1-fetoprotein (AFP) reference values in infants up to 2 years of age. Pediatr Hematol Oncol. 15 (2), 135-142 (1998).
  30. Liu, Q., Zeng, A., Liu, Z., Wu, C., Song, L. Liver organoids: From fabrication to application in liver diseases. Front Physiol. 13, 956244 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

IPSCHiPSCsRT PCRRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved