טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

טכנולוגיית MAPS פותחה כדי לבחון את היעד של RNA רגולטורי ספציפי ב vivo. sRNA של עניין מתויג עם APTAMER MS2 המאפשר טיהור משותף של שותפי RNA שלה וזיהוי שלהם על ידי רצף RNA. פרוטוקול שונה זה מתאים במיוחד לחיידקים גראם חיוביים.

למרות RNAs רגולטוריים קטנים (sRNAs) נפוצים בקרב התחום החיידקי של החיים, הפונקציות של רבים מהם נשארים מאופיינים בצורה גרועה בעיקר בשל הקושי לזהות את מטרות mRNA שלהם. כאן, תיארנו פרוטוקול שונה של טיהור MS2-Affinity יחד עם טכנולוגיית רצף RNA (MAPS), במטרה לחשוף את כל שותפי ה- RNA של sRNA ספציפי ב- vivo. באופן כללי, APTAMER MS2 הוא התמזגו הקיצוניות 5 'של sRNA של עניין. מבנה זה בא לידי ביטוי לאחר מכן vivo, המאפשר MS2-sRNA לקיים אינטראקציה עם השותפים הסלולריים שלה. לאחר קצירת חיידקים, התאים הם lysed מכנית. התמצית הגולמית נטענת לתוך עמוד כרומטוגרפיה המבוסס על אמילוס, שהיה מצופה בעבר בחלבון MS2 המותך לחלבון הכריכה המלטוזי. פעולה זו מאפשרת לכידה ספציפית של MS2-sRNA ו- RNAs אינטראקציה. לאחר התרוממות רוח, RNAs מטוהרים מזוהים על ידי רצף RNA בעל תפוקה גבוהה וניתוח ביואינפורמטי עוקב. הפרוטוקול הבא יושם בפתוגן האנושי גראם חיובי סטפילוקוקוס aureus והוא, באופן עקרוני, transposable לכל חיידקים גראם חיובי. לסיכום, טכנולוגיית MAPS מהווה שיטה יעילה לחקור לעומק את הרשת הרגולטורית של sRNA מסוים, ומציעה תמונת מצב של כל היעד שלה. עם זאת, חשוב לזכור כי מטרות putative שזוהו על ידי MAPS עדיין צריך להיות מאומת על ידי גישות ניסיוניות משלימות.

מאות, אולי אפילו אלפי RNAs רגולטוריים קטנים (sRNAs) זוהו ברוב הגנומים החיידקיים, אך הפונקציות של רובם המכריע נותרו לא אופייניות. בסך הכל, sRNAs הם מולקולות קצרות ללא קידוד, ממלא תפקידים מרכזיים בפיזיולוגיה חיידקית והסתגלות לסביבות^{משתנות 1,2,3}. אכן, מקרומולקולות אלה נמצאות במרכזן של רשתות רגולטוריות מורכבות רבות, המשפיעות על מסלולים מטבוליים, תגובות מתח אך גם ארסיות ועמידות לאנטיביוטיקה. מבחינה הגיונית, הסינתזה שלהם מופעלת על ידי גירויים סביבתיים ספציפיים (למשל, רעב לחומרים מזינים, לחצים חמצוניים או קרום). רוב sRNAs לווסת mRNAs יעד מרובים ברמה שלאחר שעתוק באמצעות זיווג בסיס קצר ולא רציף. הם בדרך כלל למנוע ייזום תרגום על ידי מתחרה עם ריבוזומים עבור אזורי ייזום תרגום⁴. היווצרות של sRNA:mRNA דופלקסים גם לעתים קרובות תוצאות השפלה פעילה של mRNA היעד על ידי גיוס של RNases ספציפיים.

האפיון של יעד sRNA (כלומר, כל הסט של RNAs היעד שלה) מאפשר זיהוי של המסלולים המטבוליים שבהם הוא מתערב ואת האות הפוטנציאלי שהוא עונה. כתוצאה מכך, הפונקציות של sRNA מסוים בדרך כלל ניתן להסיק מן היעד שלה. לשם^כךפותחו מספר כלי חיזוי סיליקו כגון IntaRNA ו- CopraRNA 5^,6,7. הם מסתמכים בעיקר על השלמות רצף, זיווג אנרגיה ונגישות של אתר האינטראקציה הפוטנציאלי כדי לקבוע שותפי sRNA putative. עם זאת, אלגוריתמי חיזוי אינם משלבים את כל הגורמים המשפיעים על זיווג בסיס ב vivo כגון מעורבות של מלווים RNA⁸ לטובת אינטראקציות תת אופטימליות או ביטוי משותף של שני בני הזוג. בשל המגבלות הטבועות בהם, שיעור החיזוי החיובי הכוזב נותר גבוה. רוב הגישות הניסיוניות בקנה מידה גדול מבוססות על טיהור משותף של זוגות sRNA:mRNA אינטראקציה עם חלבון מחייב RNA מתויג (RBP)^6,9. לדוגמה, שיטת האינטראקציה RNA על ידי קשירה ורצף (RIL-seq) זיהתה דופלקסים RNA מטוהרים במשותף עם מלווים RNA כגון Hfq ו ProQ ב Escherichia coli^10,11. טכנולוגיה דומה הנקראת UV-Crosslinking, קשירה ורצף של כלאיים (CLASH) הוחלה על RNase E- ו- Hfq הקשורים sRNAs ב E. coli^12,13. למרות התפקידים המתוארים היטב של Hfq ו- ProQ ברגולציה בתיווך sRNA בחיידקים מרובים^8,14,15, רגולציה מבוססת sRNA נראה RNA מלווה עצמאי בכמה אורגניזמים כמו S. aureus^16,17,18. גם אם הטיהור של דופלקסים RNA בשיתוף עם RNases הוא ריאלי כפי שהוכח על ידי ווטרס ועמיתים לעבודה¹³, זה נשאר מסובך כמו RNases לעורר השפלה מהירה שלהם. לפיכך, טיהור MS2-Affinity בשילוב עם רצף RNA (MAPS)^{גישה 19,20} מהווה חלופה מוצקה אורגניזמים כאלה.

שלא כמו שיטות שהוזכרו לעיל, MAPS משתמש sRNA ספציפי כפיתיון כדי ללכוד את כל RNAs אינטראקציה ולכן אינו מסתמך על מעורבות של RBP. התהליך כולו מתואר באיור 1. בקצרה, sRNA מתויג ב 5 'עם MS2 RNA aptamer כי הוא מוכר במיוחד על ידי חלבון מעיל MS2. חלבון זה הוא התמזגו עם חלבון מחייב מלטוז (MBP) להיות משותק על שף amylose. לכן, MS2-sRNA ושותפיו RNA נשמרים בעמודה כרומטוגרפיה זיקה. לאחר התרוממות רוח עם RNAs מלטוזיים ומטוהרים מזוהים באמצעות רצף RNA בעל תפוקה גבוהה ואחריו ניתוח ביואינפורמטי (איור 2). טכנולוגיית MAPS מציירת בסופו של דבר מפה של כל האינטראקציות הפוטנציאליות המתרחשות ב- vivo.

טכנולוגיית MAPS יושמה במקור בחיידק הגרם-שלילי הלא פתוגניים E. coli²¹. למרבה הפלא, MAPS סייעה לזהות שבר שמקורו ב-tRNA במיוחד באינטראקציה עם RyhB ו-RybB sRNAs ולמנוע רעש שעתוק של sRNA כדי לווסת מטרות mRNA בתנאים שאינם מעוררים. לאחר מכן, MAPS הוחל בהצלחה על SRNAs אחרים E. coli כמו DsrA²², RprA²³, CyaR²³ ו GcvB²⁴ (טבלה 1). בנוסף לאישור מטרות ידועות בעבר, MAPS הרחיבה את היעד של sRNAs ידועים אלה. לאחרונה, MAPS בוצע סלמונלה Typhimurium וחשף כי SRNA SraL נקשר rho mRNA, קידוד עבור גורם סיום שעתוק²⁵. באמצעות זיווג זה, SraL מגן rho mRNA מפני סיום שעתוק מוקדם מופעלות על ידי רו עצמה. מעניין, טכנולוגיה זו אינה מוגבלת sRNAs והוא יכול להיות מיושם על כל סוג של RNAs הסלולר כפי שהודגם על ידי שימוש שבר נגזר tRNA²⁶ ואזור 5'-untranslated של mRNA²² (טבלה 1).

שיטת MAPS הותאמה גם לחיידק גרם חיובי פתוגניים S. aureus¹⁹. באופן ספציפי, פרוטוקול התמוגה שונה באופן נרחב כדי לשבור תאים ביעילות עקב דופן תאים עבה יותר מאשר חיידקים גראם שליליים ולשמור על שלמות RNA. פרוטוקול מותאם זה כבר חשף את האינטראקציה של RsaA²⁷, RsaI²⁸ ו RsaC²⁹. גישה זו נתנה תובנות על התפקיד המכריע של sRNAs אלה במנגנונים רגולטוריים של תכונות פני התא, ספיגת גלוקוז, ותגובות מתח חמצוני.

הפרוטוקול שפותח ומיושם ב- E. coli בשנת 2015 תואר לאחרונה בפירוט רב³⁰. כאן, אנו מספקים את פרוטוקול MAPS שונה, אשר מתאים במיוחד לחקר רשתות רגולטוריות sRNA בחיידקים גראם חיובי (קיר תא עבה) אם לא פתוגניים או פתוגניים (אמצעי זהירות).

1. מאגרים ומדיה

1. עבור ניסויי MAPS, הכן את המאגרים והמדיה הבאים:
   - מאגר A (150 mM KCl, 20 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ ו 1 mM DTT)
   - חוצץ E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 מ"מ מלטוז, 0.1% טריטון, 1 mM MgCl₂ ו 1 mM DTT)
   - מאגר טעינה RNA (0.025% קסילן ציאנול ו 0.025% כחול ברומופנול ב 8 M אוריאה)
   - עירוי לב המוח (BHI) בינוני (12.5 גרם של מוח עגל, 10 גרם של פפטון, 5 גרם של לב בקר, 5 גרם של NaCl, 2.5 גרם של_{Na 2}HPO₄ ו 2 גרם של גלוקוז עבור 1 L)
   - מרק ליסוגניים (LB) בינוני (10 גרם של פפטון, 5 גרם של תמצית שמרים ו 10 גרם של NaCl עבור 1 L)
2. עבור מבחני כתמים צפוניים, הכן את המאגרים הבאים:
   - פתרון חסימה (1x חומצה מלמית ו 1% חסימת מגיב)
   - פתרון הכלאה (50% formamide, 5x SSC, 7% SDS, 1% פתרון חסימה ו 0.2% N-לאוריל סרקוסין, 50 מ"מ נתרן פוספט). מחממים בתסיסה כדי להתמוסס.
   התראה: פעל בקפידה בהתאם לאמצעי הבטיחות הקשורים לכל מוצר.
   - 1 M נתרן פוספט (58 מ"מ נתרן פוספט דיבאסי ו 42 מ"מ נתרן פוספט מונובאסי)
   - מלח, מאגר נתרן ציטראט (SSC), רכז 20x (3 M NaCl ו 300 מ"מ טריסודיום ציטראט)

2. בעיות בטיחות

1. בצע את כל השלבים הכרוכים בחיידקים פתוגניים בני קיימא במעבדת בלימה ברמה 2.
   הערה: רק תמציות תאים ניתן לקחת בחוץ לאחר תמוגה (שלב 5).
2. תלבש חלוק מעבדה וכפפות.
3. ודא כי פרקי הידיים מכוסים.
4. נקו את ארון הבטיחות הביולוגי (מחלקה II) בתמיסת חיטוי.
5. יש להשליך פסולת מוצקה החשופה לחיידקים בפח הביו-רפואי המתאים.
6. לטפל בקבוקונים המכילים נוזלים מזוהמים עם תמיסת חיטוי. לאחר מכן, להשליך אותו בכיור.
7. יש לשטוף בזהירות את הידיים ופרקי כף היד בסבון ולהסיר את חלוק המעבדה לפני היציאה ממעבדת הבלימה ברמה 2.

3. בניית פלסמיד

הערה: למטרות שיבוט, חיוני לזהות תחילה את גבולות ה- sRNA האנדוגני. pCN51-P3 ו pCN51-P3-MS2 פלסמידים מתוארים תומסיני ואח '(2017)²⁷. מקדם P3 מאפשר ביטוי גבוה של sRNA באופן תלוי צפיפות התא (כלומר, כאשר חיידקים נכנסים לשלב הנייח של הצמיחה). SRNAs סטפילוקוקליים רבים מצטברים במהלך שלב צמיחה זה.

1. להגביר את רצף sRNA על ידי PCR באמצעות פולימראז DNA נאמנות גבוהה ומכונת PCR. פעל בקפידה בהתאם להוראות היצרן וקרא את Garibyan ו- Avashia (2013)³¹ לקבלת פרטים נוספים.
2. השתמש בתבניות הבאות כדי לעצב את פריימנים ספציפיים:
   
   ו-GGATCC GGATCC(N)-3' של 5'-CGC עבור פרייומרים קדימה והפוך, בהתאמה.
   הערה: אוליגונוקלאוטידים אלה מאפשרים להתיך את רצף MS2 (מודגש) לסוף 5 ' של sRNA של עניין. מספר Pst אתרי ההגבלה I ו- BamHI (מסומנים בקו תחתון) מתווספים בגפיים 5 ' ו -3 'של מבנה MS2-sRNA כדי לשכפל את האמפליקון לתוך pCN51-P3^{פלסמיד 27}. (N) מתאים לרצף הספציפי לגנים (15-20 נוקלאוטידים).
3. לעכל 1 מיקרוגרם של pCN51-P3 פלסמיד ו 1 מיקרוגרם של מוצר PCR MS2-sRNA עם 2 U של pstI ו 1 U של באםHI במאגר המתאים על פי המלצות היצרן.
4. דגירה 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס לטהר DNA באמצעות ערכת טיהור PCR (ראה טבלה של חומרים).
5. מערבבים את פלסמיד pCN51-P3 המתעכל (300 ng) ואמפליקון MS2-sRNA (יחס טוחן לווקטור:הכנס = 1:3) בצינור של 1.5 מ"ל. ראה Revie et al. (1988)³² כדי למקסם את יעילות הקשירה. הוסף 1 μL של מאגר ליגאז ו 10 U של T4 ליגאז בכל צינור. כוונן את עוצמת הקול ל- 10 μL עם מים דקים במיוחד.
6. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות.
7. הוסף 5 μL של תערובת קשירה ל 50 μL של DH5α קפוא כימית מוסמך E. coli תאים. קרא את Seidman et al. (2001)³³ כדי ללמוד עוד על טרנספורמציה פלסמיד ותאים בעלי יכולת כימית.
8. דגירה 30 דקות על קרח.
9. הלם חום (45 s ב 42 מעלות צלזיוס) צינור השינוי באמצעות בלוק חום או אמבט מים.
10. הוסף 900 μL של LB בינוני דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 30 דקות.
11. צלחת 100 μL של ההשעיה החיידקית על צלחת אגר LB בתוספת אמפילין (100 מיקרוגרם / μL).
    הערה: הווקטור pCN51-P3 מקודד גן עמידות לאמפצילין, המאפשר לבחור רק שיבוטי E. coli הנושאים את פלסמיד pCN51-P3-MS2-sRNA.
12. לחלץ את pCN51-P3-MS2-sRNA פלסמיד מתרבות חיידקית לילה (5 מ"ל) גדל בנוכחות אמפיקילין (100 מיקרוגרם / μL) באמצעות ערכת miniprep DNA פלסמיד (ראה טבלה של חומרים).
13. אמת את המבנה על-ידי רצף סנגר³⁴ באמצעות פריימר הבא, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
14. להפוך את pCN51-P3-MS2-sRNA פלסמיד לתוך DC10B כימית מוסמך E. coli תאים. חזור על שלבים 3.7 עד 3.11.
15. לחלץ את pCN51-P3-MS2-sRNA פלסמיד (ראה שלב 3.12) ולהפוך 1-5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לתוך HG001 ΔsRNA אלקטרו-כשיר S. aureus תאים באמצעות מנגנון electroporation. פעל בזהירות בהתאם להוראות היצרן. קרא גרוסר ריצ'רדסון (2016)³⁵ כדי ללמוד עוד על שיטות להכנת אלקטרו-כשיר S. aureus.
    התראה: שלב זה כרוך בטיפול בחיידקים פתוגניים (ראה שלב 2).
16. הוסף 900 μL של בינוני BHI ודגר ב 37 °C (69 °F) עבור 3 שעות.
17. צנטריפוגה 1 דקות ב 16,000 x g. השלך את הסופרנט.
18. Resuspend גלולה ב 100 μL של BHI צלחת ההשעיה חיידקי על לוחות אגר BHI בתוספת אריתרומיצין (10 מיקרוגרם / μL).
    הערה: וקטור pCN51-P3 גם מקודד גן התנגדות אריתרומיצין, המאפשר לבחור רק S. שיבוטים אוראוס נושאת את pCN51-P3-MS2-sRNA פלסמיד.

4. קצירת חיידקים

התראה: שלב זה כרוך בטיפול בחיידקים פתוגניים (ראה שלב 2).

1. לגדל מושבה אחת של זנים הנושאים או pCN51-P3-MS2-sRNA או pCN51-P3-MS2²⁷ פלסמידים ב 3 מ"ל של בינוני BHI בתוספת אריתרומיצין (10 מיקרוגרם / μL) בכפילויות.
2. לדלל כל תרבות לילה ב 50 מ"ל (≈1/100) של בינוני BHI טרי בתוספת אריתרומיצין (10 מיקרוגרם / μL) כדי להגיע OD_600nm של 0.05. השתמש 250 מ"ל צלוחי מעוקרים (5:1 צלף לבינוני יחס).
   הערה: יש להגדיר תנאים בינוניים ותנאי צמיחה בהתאם לתבנית הביטוי של ה- sRNA הנחקר.
3. לגדל תרבויות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 180 סל"ד עבור 6 שעות.
4. מעבירים כל תרבות לצינור צנטריפוגות של 50 מ"ל.
5. צנטריפוגה ב 2,900 x גרם במהלך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את הסופרנט.
6. שמור כדורי על קרח ישירות לבצע תמוגה תא מכני (שלב 5) או להקפיא ולאחסן כדורי ב -80 מעלות צלזיוס.

5. תמוגה תאית מכנית

התראה: השלבים הבאים חייבים להתבצע על קרח ומאגרים חייבים להיות ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש בכפפות ולנקוט בכל אמצעי הזהירות כדי להגן על דגימות מפני RNases.

1. גלולות resuspend (שלב 4.6) ב 5 מ"ל של חוצץ A.
2. מעבירים את התאים שעברו שימוש חוזר בצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל עם 3.5 גרם חרוזי סיליקה (0.1 מ"מ).
3. הכנס צינורות למכשיר תמוגה תא מכני (ראה טבלה של חומרים). הפעל מחזור של 40 s ב 4.0 m/s.
   הערה: אם מחזור אחד אינו מספיק כדי לשבור תאים, תן למכשיר להתקרר במשך 5 דקות תוך שמירה על דגימות על הקרח. לאחר מכן, חזור על מחזור נוסף של 40 שניות ב 4.0 m/s. היעילות של תמוגה התא ניתן לבדוק על ידי ציפוי supernatant על צלחת BHI-אגר.
4. צנטריפוגה ב 15,700 x גרם במשך 15 דקות. לשחזר את supernatant ולשמור אותו על קרח.

6. הכנת טורים

התראה: היזהר לא לאפשר את שף אמילוס להתייבש. במידת הצורך, אטמו את העמודה עם כובע קצה. הכינו את כל הפתרונות לפני תחילת טיהור הזיקה.

1. שים עמודת כרומטוגרפיה בארון תקשורת בעמודה (ראה טבלת חומרים).
2. הסר את קצה העמודה ושטוף את העמודה במים דקים במיוחד.
3. הוסף 300 μL של שרף אמילוס.
4. לשטוף את העמודה עם 10 מ"ל של חוצץ A.
5. לדלל 1,200 pmol של חלבון MBP-MS2 ב 6 מ"ל של חוצץ A ולטעון אותו לתוך העמודה.
6. לשטוף את העמודה עם 10 מ"ל של חוצץ A.

7. טיהור הזיקה ל-MS2 (איור 1)

1. טען את lysate התא לתוך העמודה.
   הערה: שמור 1 מ"ל של lysate התא (תמצית גולמית, CE) כדי לחלץ RNA הכולל (שלב 8) ולבצע כתם צפון (שלב 9) ו transcriptomic (שלב 10) ניתוח.
2. אסוף את שבר הזרימה (FT) בצינור איסוף נקי.
3. לשטוף את הטור 3 פעמים עם 10 מ"ל של חוצץ A. לאסוף את שבר לשטוף (W).
4. אלוט את העמודה עם 1 מ"ל של Buffer E ולאסוף את שבר elution (E) ב microtube 2 מ"ל.
5. שמור את כל השברים שנאספו על הקרח עד מיצוי RNA (שלב 8) או להקפיא אותם ב -20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

8. מיצוי RNA של שברים שנאספו (CE, FT, W ו- E)

1. השתמש 1 מ"ל של כל שבר (כולל FT ו- W) עבור מיצוי RNA.
2. הוסף 1 נפח של פנול. מערבבים במרץ.
   התראה: פנול הוא הפכפך וקורוזיבי, לשים לב ולעבוד בבטחה מתחת למכסה המנוע אדים.
3. צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
4. העבר את השלב העליון במיקרו-צינור נקי של 2 מ"ל.
5. הוסף נפח אחד של אלכוהול כלורופורם/איזואמיל (24:1) וחזור על שלבים 8.3 עד 8.4.
   התראה: עבוד בבטחה מתחת למכסה המנוע.
6. הוסף 2.5 כרכים של אתנול קר 100% ו 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט (NaOAc) pH 5,2.
7. לזרז לילה ב -20 מעלות צלזיוס.
   הערה: משקעים יכולים להתבצע גם באמבט אתנול / קרח יבש במהלך 20 דקות או ב -80 מעלות צלזיוס במהלך 2 שעות.
8. צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאט להסיר אתנול עם פיפטה תוך נזהר לא להפריע גלולה.
   התראה: גלולת RNA לא תמיד גלוי והוא לפעמים רופף בנוכחות אתנול.
9. הוסף 500 μL של 80% אתנול קר.
10. צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
11. השלך אתנול על ידי pipetting אותו לאט. יבש את גלולה באמצעות רכז ואקום, 5 דקות על מצב ריצה.
12. Resuspend את גלולה בנפח המתאים (15-50 μL) של מים אולטרה סגולים. להקפיא את גלולה ב -20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
13. להעריך את כמות ה-RNA (260 ננומטר) ואת האיכות (260/280 ו-260/230 יחסי אורך גל) באמצעות ספקטרופוטומטר/פלואורומטר (ראו טבלת חומרים). פעל בזהירות בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: 3-4 מיקרוגרם מתקבלים בדרך כלל בשבר elution (E). זה תלוי בעיקר בתנאים שנבדקו.

9. ניתוח של MS2-זיקה טיהור על ידי כתם צפון³⁶

1. לדלל 5 מיקרוגרם של RNA של CE, FT, שברי W ו 500 ng של שבר E ב 10 μL של מים אולטרה סגולים ומערבבים עם 10 μL של מאגר טעינת RNA.
2. דגירה 3 דקות ב 90 מעלות צלזיוס.
3. לטעון דגימות לתוך בארות של 1% ג'ל agarose בתוספת 20 מ"מ של guanidium thiocyanate ולהפעיל את הג'ל ב 100-150 V ב TBE 1x חיץ ב 4 מעלות צלזיוס. קרא את קונץ (2013)³⁷ לפרטים נוספים.
4. העבר RNAs על קרום nitrocellulose על ידי העברת ואקום במשך 1h או העברת נימי לילה.
   הערה: שיטת נימי יעילה יותר עבור RNAs גדולים.
5. RNAs מקושרים UV על הממברנה (120 mJ ב 254 ננומטר) באמצעות crosslinker אולטרה סגול.
6. הכנס את הממברנה לבקבוק הכלאה כשצד ה- RNA פונה כלפי מעלה.
7. הוסף 10-20 מ"ל של פתרון הכלאה שחומם מראש. דגירה 30 דקות ב 68 מעלות צלזיוס.
8. השלך את הפתרון והוסף 10-20 מ"ל של פתרון הכלאה טרי בתוספת 1 μL של בדיקה ספציפית sRNA. דגירה לילה ב 68 °C (68 °F).
   הערה: גשוש ה-RNA בעל התווית DIG מסונתז באמצעות ערכת תיוג DIG RNA והוראות היצרן הבאות. לחלופין, ניתן להשתמש בגשוש רדיו-פעמון.
9. לשטוף את הממברנה עם 10-20 מ"ל של פתרון לשטוף 1 (2x SSC ו 0.1% SDS) במשך 5 דקות ב 20 °C (69 °F). חזור פעם אחת.
10. לשטוף את הממברנה עם 10-20 מ"ל של פתרון לשטוף 2 (0.2x SSC ו 0.1% SDS) במשך 15 דקות ב 68 °C (68 °F). חזור פעם אחת.
11. דגירה עם 10-20 מ"ל של פתרון חסימה לפחות 30 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
12. השלך את הפתרון והוסף 10-20 מ"ל של פתרון החסימה בתוספת נוגדן אנטי דיגוקסיגנין פוליקלונלי (1/1000), מצומד phosphatase אלקליין. דגירה 30 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
13. לשטוף את הממברנה עם 10-20 מ"ל של פתרון לשטוף 3 (1x חומצה גברית ו 0.3% Tween 20) במשך 15 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. חזור פעם אחת.
14. דגירה הממברנה עם 10-20 מ"ל של פתרון הזיהוי (0.1 M טריס HCl ו 0.1 M NaCl pH 9.5) 5 דקות ב 20 °C (69 °F).
15. שים את הממברנה על סרט פלסטיק להשרות אותו עם המצע (ראה טבלה של חומרים). דגירה 5 דקות בחושך.
16. לאטום את הממברנה בסרט פלסטיק. שים את הממברנה בקלטת אוטורדיוגרפיה.
17. לחשוף את הממברנה לסרט אוטורדיוגרפיה בחדר החושך הייעודי.
    הערה: זמן התערוכה תלוי בחוזק האות, מכמה שניות לדקות.
18. לחשוף את הסרט החשוף במכשיר פיתוח אוטומטי.

10. הכנת הדגימות לריצוף RNA

הערה: שלב זה נוגע רק ל-RNAs שחולצו משברי E ו-CE.

1. הוסף לכל דגימה 10 μL של מאגר DNase 10x ו- DNase I (1 U / מיקרוגרם של RNAs שטופלו). מוסיפים מים לנפח סופי של 100 μL.
2. דגירה 1 שעה ב 37 °C (69 °F).
3. לחלץ ולטהר RNAs כפי שתואר קודם לכן (שלבים 8.2 עד 8.11).
4. Resuspend גלולת RNA ב 20 μL של מים אולטרה סגולים.
   הערה: ניתן לבדוק את נוכחותם של הדנ"א הנותר באמצעות PCR ופרימרים ספציפיים (למשל, גן 16S).
5. להעריך את כמות ואיכות ה-RNA באמצעות מערכת ניתוח אלקטרופורזה מבוססת מיקרופלואידיקה (ראה טבלת חומרים).
   הערה: 1 מיקרוגרם מתקבל בדרך כלל בשבר elution (E) לאחר טיפול DNase.
6. הסר RNAs ריבוזומלי עם ערכת דלדול rRNA חיידקי.
   הערה: RNAs גדולים ושופעים (כלומר, rRNAs) נוטים לקיים אינטראקציה לא ספציפית עם עמודת הזיקה. 500 ng של RNA שחולצו נדרשים לבצע שלב זה.
7. שוב להעריך את כמות ואיכות RNA באמצעות מערכת ניתוח אלקטרופורזה מבוססת microfluidics.
8. הכינו ספריות cDNA עם 10-20 ng של RNA ריבודפולד באמצעות ערכת הכנה לספריית cDNA וציות להוראות היצרן.
9. רצף הספריות שהושגו באמצעות כלי רצף (למשל, חד-פעמי, 150 bp; ראה טבלת חומרים).
   הערה: 5-10 מיליון קריאות לכל מדגם הן בדרך כלל מספיקות.

11. ניתוח נתונים של RNAseq (איור 2)

1. הורד את קבצי הרצף FastQ מפלטפורמת הרצף.
2. גישה למופע הגלקסיה של התחנה הביולוגית Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) ולהתחבר.
   הערה: ניתן למצוא בקלות כל אלגוריתם שהוזכר באמצעות סרגל החיפוש. מדריך למשתמש מסופק עבור כל כלי.
   התראה: הגירסה של הכלים הדרושים עשויה להיות שונה משרת Galaxy³⁸הציבורי .
3. לחץ על סמל קבל נתונים ולאחר מכן העלה קובץ מהמחשב . העלה קובץ רצף FastQ של כל דוגמאות בקרת MS2 ו- MS2 sRNA. העלה גם קובץ גנום הפניה FASTA וקובץ ביאור GFF.
4. הפעל דוחות איכות קריאה FastQC (גרסת גלקסי 0.69).
   הערה: כלי זה מספק הערכת איכות של רצפים גולמיים (למשל, ציון איכות, נוכחות של רצפי מתאמים).
5. הפעל את כלי חיתוך הקריאה הגמיש של Trimmomatic (גרסת Galaxy 0.36.6) כדי להסיר רצפי מתאמים וקריאות באיכות ירודה. ציין רצפי מתאמים המשמשים להכנת ספריה (לדוגמה, TruSeq 3, חד-פעמי). הוסף את הפעולות הבאות של Trimmomatic: הזזהWINDOW (מספר בסיסים =4; איכות ממוצעת =20) ו MINLEN (אורך מינימלי של קריאות = 20).
6. הפעל שוב דוחות איכות קריאה FastQC (גרסת גלקסי 0.69).
7. הפעל Bowtie2 - המפה קוראת נגד הגנום הפניה (גרסת גלקסי 2.3.2.2). השתמש בקובץ FASTA של חומר עזר לגנום מההיסטוריה כדי למפות קריאות עם הגדרות ברירת מחדל (מקומיות רגישות מאוד).
   הערה: ניתן לדמיין קובץ BAM שנוצר על-ידי הכלי Bowtie2 באמצעות מציג הגנומיקה האינטגרטיבית (IGV). יהיה צורך גם בקובץ BAI משויך.
8. לחלופין, הפעל את Flagstat האוסף נתונים סטטיסטיים עבור ערכת הנתונים של BAM (גרסה גלקסי 2.0).
9. הפעל ספירת htseq - ספירה (גרסת גלקסי 0.6.1) אשר מיישר קורא תכונות חופפות בקובץ ביאור GFF. השתמש במצב חיתוך (לא ריק).
10. אחסן בארכיון את כל קבצי הספירה הגולמית מניתוח ספירת htseq לקובץ Zip יחיד.
11. הפעל SARTools DESeq2 כדי להשוות נתונים (גרסת גלקסי 1.6.3.0). ספק את קובץ Zip המכיל קבצי ספירה גולמית ואת קובץ העיצוב, קובץ מופרד באמצעות טאב המתאר את הניסוי. פעל בקפידה בהתאם להוראות שסופקו כדי ליצור את קובץ העיצוב.

התוצאות הייצוגיות מקורן במחקר של יעד RsaC ב S. aureus²⁹. RsaC הוא SRNA לא קונבנציונלי באורך 1,116 nt. הקצה של 5' מכיל מספר אזורים חוזרים ונשנים בעוד הקצה 3 ' שלה (544 nt) הוא עצמאי מבחינה מבנית ומכיל את כל אתרי האינטראקציה החזויים עם מטרות mRNA שלה. הביטוי של sRNA זה הוא המושרה כאשר מנגן (Mn) הוא נדיר,...

פרוטוקול שונה עבור חיידקים גראם חיובי
הפרוטוקול הראשוני של MAPS פותח כדי לחקור אינטראקציה sRNA באורגניזם המודל E. coli^20,30. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שונה אשר מתאים לאפיון של רשתות רגולטוריות תלויות sRNA בפתוגן האנושי האופורטוניסטי S. aureus והוא בהח...

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי "סוכנות לאומית דה לה Recherche" (ANR, גרנט ANR-16-CE11-0007-01, ריבוסטף, ו ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, ליחסי ציבור). הוא פורסם גם במסגרת labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 ושל ANR-17-EURE-0023 (ליחסי ציבור), כמימון מהמדינה המנוהלת על ידי ANR כחלק מההשקעות בתוכנית העתידית. DL נתמכה על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מארי סקלודובסקי-קירי מס' 753137-SaRNAReg. העבודה במעבדת E. Massé נתמכה על ידי מענקי הפעלה של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), המועצה לחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC), והמכונים הלאומיים לבריאות NIH צוות גרנט R01 GM092830-06A1.