MS2亲和力纯化与革兰阳性细菌中的RNA测序相结合

MAPS 技术已开发出来，以仔细审查体内特定监管 RNA 的目标。感兴趣的 sRNA 标有 MS2 贴录器，通过 RNA 测序实现其 RNA 合作伙伴的共同纯化及其标识。此修改后的协议特别适合革兰氏阳性细菌。

虽然小的调节RNA（SRNA）在生命的细菌领域很普遍，但由于难以确定其mRNA目标，其中许多RNA的功能仍然很差。在这里，我们描述了MS2亲和力纯化与RNA测序（MAPS）技术的修改协议，旨在揭示特定sRNA在体内的所有RNA合作伙伴。从广义上讲，MS2 的贴合器与感兴趣的 sRNA 的 5' 四肢融合在一起。然后，此构造以体内表示，允许 MS2-sRNA 与其细胞伙伴进行交互。细菌收获后，细胞被机械地解化。粗提取物被加载到以前涂有MS2蛋白的淀粉样色谱柱中，该色谱柱与麦芽糖结合蛋白融合。这能够对 MS2-sRNA 进行特定捕获并交互 RNA。洗净后，通过高通量RNA测序和随后的生物信息分析确定共同纯化RNA。以下协议已在Gram阳性人类病原体 金黄色葡萄球菌 中实施，原则上可转为任何革兰氏阳性细菌。综上所述，MAPS 技术是深入探索特定 sRNA 监管网络的有效方法，可提供其整个目标图的快照。然而，必须记住，MAPS 确定的假定目标仍需要通过补充实验方法进行验证。

在大多数细菌基因组中，已经发现了数百种，甚至数千种小型调节RNA（SRNA），但其中绝大多数的功能仍然不寻常。总的来说，sRNA是短的非编码分子，在细菌生理学和适应波动环境^1，2，3中起着主要作用。事实上，这些大分子是众多复杂监管网络的中心，影响代谢途径、应激反应，但也影响毒性和抗生素耐药性。从逻辑上讲，它们的合成是由特定的环境刺激（例如营养饥饿、氧化或膜应力）触发的。大多数 sRNA 通过短和非连续基配对在转录后级别调节多个目标 mRNA。他们通常通过与核糖体竞争翻译启动区域⁴来阻止翻译的启动。sRNA:mRNA复式的形成也常常导致目标mRNA通过招募特定的RNA而主动退化。

sRNA 靶点（即其目标 RNA 的整组）的定性允许识别其干预的代谢通路及其回答的潜在信号。因此，特定 sRNA 的功能通常可以从其目标中推断出。为此，已经开发了几个西里科预测工具，如因塔纳和科普拉纳^5，6，7。它们特别依赖于序列互补性、配对能量和潜在交互站点的可访问性，以确定假定 sRNA 合作伙伴。但是，预测算法并不集成影响体内基础配对的所有因素，例如 RNA 陪护⁸的参与，这些因素有利于次优交互或双方的共同表达。由于其固有的局限性，预测工具的误报率仍然很高。大多数实验性的大规模方法是基于sRNA的共纯化:mRNA夫妇与标记RNA结合蛋白^{（RBP）6，9}相互作用。例如，通过利格化和测序（RIL-seq）方法识别出RNA复式与RNA伴郎（如大肠杆菌^10、11中的Hfq和ProQ）共同纯^化。一种类似的技术称为紫外线交叉链接，利化和混合测序（CLASH）被应用到大肠杆菌^12，13的RNA和Hfq相关sRNA。尽管Hfq和ProQ在多种细菌^8、14、15的sRNA介介调节中的作用十分突出，但在像S.Aureus^16、17、18这样的几个生物体中^，基于sRNA的调节似乎与RNA无关。即使像沃特斯和同事¹³所证明的那样，与RNA关联的RNA复式净化是可行的，但这种情况仍然很棘手，因为RNA会引发它们的快速退化。因此，MS2-亲和力纯化加上RNA测序（MAPS）方法^19，20构成了这种生物体的坚实替代品。

与上述方法不同，MAPS 使用特定的 sRNA 作为诱饵来捕获所有相互作用的RNA，因此不依赖于 RBP 的参与。整个过程在 图1中描述。简言之，sRNA 标记为 5' 与 MS2 RNA 贴机，该贴子由 MS2 涂层蛋白特别识别。这种蛋白质与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合，固定在淀粉酶树脂上。因此，MS2-sRNA 及其 RNA 合作伙伴保留在亲和力色谱列中。与麦芽糖分离后，使用高通量RNA测序进行联合纯化RNA识别，然后进行生物信息分析（图2）。MAPS 技术最终绘制了一张内部发生的所有潜在交互的交互映射图。

MAPS技术最初是在非致病性革兰阴性大肠杆菌²¹中实施的。值得注意的是，MAPS 帮助识别了一个 tRNA 衍生片段，该片段与 RyhB 和 Rybb sRNA 特别交互，并防止任何 sRNA 转录噪声在非诱导条件下调节 mRNA 目标。此后，MAPS 已成功应用于其他大肠杆菌sRNA，如 DsrA^{22、RprA23、CyaR23}和 GcvB^24（表 1）。除了确认以前已知的目标外，MAPS 还扩展了这些众所周知的 sRNA 的目标范围。最近，MAPS已经在沙门氏菌蒂菲穆里姆进行，并透露，SraL sRNA绑定到rho mRNA，编码转录终止因子^25。通过这种配对，SraL 保护rho mRNA 免受由 Rho 本身触发的过早转录终止。有趣的是，该技术不限于 sRNA，可以应用于任何类型的蜂窝RNA，例如使用 tRNA 衍生的片段²⁶和 mRNA²²的 5'未翻译区域 （表 1）。

MAPS方法也已适应致病性革兰阳性细菌S.金黄色葡萄球菌^19。具体来说，裂解协议已被广泛修改，以有效地打破细胞，由于比Gram阴性细菌更厚的细胞壁，并保持RNA完整性。这个经过调整的协议已经解开了RSA27、RsaI²⁸和RSAC29的相互作用。这种方法深入了解了这些 sRNA 在细胞表面特性、葡萄糖吸收和氧化应激反应的调控机制中的关键作用。

2015年在 大肠杆菌 中制定和实施的协议最近被详细描述了^30。在这里，我们提供修改后的 MAPS 协议，该协议特别适合研究革兰阳性（较厚的细胞壁）细菌中的 sRNA 监管网络，无论是非致病细菌还是致病菌（安全预防措施）。

1. 缓冲区和媒体

1. 对于 MAPS 实验，请准备以下缓冲区和媒体:
   - 缓冲区A（150毫克，20米三轮车-HCl pH 8，1毫米M毫克₂ 和1米DTT）
   - 缓冲E（250毫克，20米三轮车-HCl pH 8，12米麦芽糖，0.1%特里顿，1毫克₂ 和1毫克DTT）
   - RNA加载缓冲区（0.025%二甲苯氰醇和0.025%溴酚蓝色在8M尿素）
   - 脑心输液 （BHI） 介质 （12.5 g 小牛脑， 10 克肽， 5 克牛肉心脏， 5 克 NaCl， 2.5 克纳₂HPO₄ 和 2 克葡萄糖 1 L）
   - 莱索根尼·布罗斯（LB）介质（10克肽，5克酵母提取物和10克纳克1升）
2. 对于北方污点检测，准备以下缓冲区:
   - 阻塞溶液（1x 雄酸和 1% 阻塞试剂）
   - 混合溶液（50% 表酰胺、5 倍 SSC、7% SDS、1% 阻塞溶液和 0.2% N-劳丽尔沙可辛、50m 磷酸钠）。随着激动而发热溶解。
   注意:小心注意与每种产品相关的安全防范措施。
   - 1 M 磷酸钠（58m 磷酸钠二面体和 42m 磷酸钠单巴酸）
   - 盐酸钠柠檬酸钠（SSC）缓冲器，20倍浓缩物（3M纳克和300m柠檬酸三钠）

2. 安全问题

1. 在 2 级遏制实验室中执行涉及可行致病菌的所有步骤。
   注意:裂解后，只能在外部提取细胞提取物（第 5 步）。
2. 穿上实验室外套和手套。
3. 确保手腕被覆盖。
4. 用消毒液清洁生物安全柜（II类）。
5. 将暴露在细菌中的固体废物丢弃在适当的生物医学箱中。
6. 用消毒液处理含有受污染液体的烧瓶。然后，将其丢弃在水槽中。
7. 在离开 2 级密封实验室之前，用肥皂小心地洗手和手腕，并脱下实验室外套。

3. 普拉斯米德建筑

注意:为了克隆目的，首先确定内源性sRNA的边界至关重要。pCN51-P3 和 pCN51-P3-MS2 质粒在托马西尼等人（2017）²⁷中描述。P3 促进器允许以细胞密度依赖的方式（即当细菌进入静止生长阶段时）高表达 sRNA。许多葡萄球菌SRNA在这个生长阶段积累。

1. 使用高保真DNA聚合酶和PCR机，通过PCR放大sRNA序列。请仔细遵循制造商的说明，阅读加里比扬和阿瓦希亚 （2013）³¹ 了解更多详情。
2. 使用以下模板设计特定引物:
   
   和 5 '- CGCGGATCC（N） -3' 分别为转发和反向引金。
   注意:这些寡核苷酸能够将 MS2 序列（粗体）融合到感兴趣的 sRNA 的 5' 端。 普斯特I 和 BamHI 限制站点（下划线）在 MS2-sRNA 构造的 5' 和 3' 四肢添加，以克隆放大体到 pCN51-P3 质粒²⁷中。（N） 对应于基因特异性序列（15-20 核苷酸）。
3. 根据制造商的建议，在适当的缓冲区中，文摘 1μg pCN51-P3 质粒和 MS2-sRNA PCR 产品 1 μg，其中 2 U 的 PstI 和 1 U 的 BamHI。
4. 在 37 °C 下孵化 1 小时，使用 PCR 净化套件净化 DNA（参见 材料表）。
5. 将消化的 pCN51-P3 质粒 （300 ng） 和 MS2-sRNA 放大器（矢量的摩尔比:插入 = 1:3）混合在 1.5 mL 管中。见里维等人（1988年^）32， 以最大限度地提高连带效率。在每个管中加入 1 μL 的连气缓冲器和 10 U 的 T4 升。用超纯水将体积调整到 10 μL。
6. 在22°C孵育至少2小时。
7. 将 5μL 的粘合混合物添加到 50 μL 的冷冻 DH5® 化学能力 大肠杆菌 细胞中。阅读塞德曼等人（2001年^）33， 了解更多关于质粒转化和化学能力的细胞。
8. 在冰上孵化30分钟。
9. 使用热块或水浴的变换管（42 °C 处的 45°C）热冲击（45 s）。
10. 添加 900 μL 的 LB 介质，在 37 °C 孵化 30 分钟。
11. LB agar 板上的细菌悬浮板 100 μL 板，并辅以安培林 （100 μg/μL）。
    注:pCN51-P3载体编码了一个抗胆碱基因，该基因只能选择携带pCN51-P3-MS2-sRNA质粒 的大肠杆菌 克隆。
12. 使用质粒DNA迷你素套件（见 材料表）从在安非他明（100μg/μL）存在的情况下生长的隔夜细菌培养物（5 mL）中提取pCN51-P3-MS2-sRNA质粒。
13. 使用以下引号 5'-TCTC 加塔塔加格^{-3'对 34} 进行桑格测序来验证构造。
14. 将 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒转换为 DC10B 化学能力 大肠杆菌 细胞。重复步骤 3.7 到 3.11。
15. 提取 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒（参见步骤 3.12），使用电聚变装置将 1-5μg 的质粒DNA转化为 HG001 ΔsRNA电能的 S. aureus 细胞。请按照制造商的说明操作。阅读格罗瑟和理查森 （2016）³⁵ 了解更多关于准备电能 S. aureus 的方法。
    注意:这一步骤涉及处理致病菌（见第2步）。
16. 添加 900 μL 的 BHI 介质，在 37 °C 下孵化 3 小时。
17. 离心机 1 分钟，16，000 x g。丢弃超自然人。
18. 将颗粒重新喷入 100 μL 的 BHI 中，并将 BHI agar 板上的细菌悬浮板与红霉素 （10 μg/μL） 补充。
    注:pCN51-P3载体还编码了红霉素耐药基因，该基因仅能选择携带pCN51-P3-MS2-sRNA质粒的 金黄色葡萄球菌 克隆。

4. 细菌收获

注意:此步骤涉及处理致病菌（参见第 2 步）。

1. 在 3 mL 的 BHI 介质中生长一组携带 pCN51-P3-MS2-sRNA 或 pCN51-P3-MS2²⁷ 质粒的菌株，并在重复中补充红霉素 （10μg/μL）。
2. 将每个隔夜文化稀释在 50 mL（≈1/100）的新鲜 BHI 介质中，辅以红霉素 （10μg/μL），达到_{0.05 的 OD 600nm。} 使用 250 mL 灭菌烧瓶（5:1 烧瓶与中等比例）。
   注:应根据所研究的sRNA的表达模式设置中等和生长条件。
3. 在 37 °C 下生长文化，在 180 rpm 时以 6 小时的速度摇晃。
4. 将每个培养件转移到一个 50 mL 离心机管中。
5. 离心机在 2，900 x g 在 15 分钟内在 4 °C. 丢弃超自然人。
6. 将颗粒保持在冰上，直接执行机械细胞裂解（第 5 步）或在 -80 °C 下冻结和储存颗粒。

5. 机械细胞裂解

注意:以下步骤必须在冰上执行，缓冲器必须在 4 °C。 使用手套并采取所有预防措施，保护样品免受 RNases 的保护。

1. 在缓冲区 A 的 5 mL 中重新喷射颗粒（步骤 4.6）。
2. 将再悬浮的细胞转移到15mL离心管中，并带有3.5克二氧化硅珠（0.1毫米）。
3. 将管插入机械单元解仪器中（参见 材料表）。以 4.0 m/s 的速度运行 40s 的循环。
   注意:如果一个周期不足以破坏细胞，让设备冷却5分钟，同时将样品保持在冰上。然后，以 4.0 m/s 重复另一个 40s 周期。细胞裂解的效率可以通过在BHI-agar板上电镀超自然来测试。
4. 离心机在15，700 x 克 15分钟。恢复超自然，并保持在冰上。

6. 列准备

注意:小心不要让淀粉样树脂干燥。如有必要，请用末端盖密封列。在开始亲和力纯化之前，先准备所有解决方案。

1. 将色谱列放在柱架中（参见 材料表）。
2. 取出柱尖，用超纯净水清洗柱子。
3. 加入300微升淀粉样酶树脂。
4. 用 10 mL 的缓冲区 A 清洗柱。
5. 在缓冲区 A 的 6 mL 中稀释 MBP-MS2 蛋白质 1，200 pmol，并将其加载到列中。
6. 用 10 mL 的缓冲区 A 清洗柱。

7. MS2亲和力纯化 （图1）

1. 将细胞解体加载到列中。
   注意:保持细胞核糖精（原油提取物，CE）的1mL提取总RNA（步骤8），并执行北斑（步骤9）和转录（步骤10）分析。
2. 在干净的收集管中收集流过分数 （FT）。
3. 用 10 mL 的缓冲区 A 洗柱 3 次。
4. 用 1 mL 缓冲 E 将列进行，并在 2 mL 微管中收集 elution 分数（ E ）。
5. 将所有收集的分数保留在冰上，直到RNA提取（第 8 步）或将其冻结在 -20 °C 以供以后使用。

8. 收集分数的RNA提取（CE、FT、W 和 E）

1. 使用每个分数的 1 mL（包括 FT 和 W）进行 RNA 提取。
2. 添加1卷酚。大力混合。
   注意:酚是挥发性和腐蚀性的，注意并安全地在烟雾罩下工作。
3. 离心机在16，000 x g 10分钟在20°C。
4. 在干净的2mL微管中转移上一阶段。
5. 加入 1 卷氯仿/异酰醇 （24:1），重复步骤 8.3 至 8.4。
   注意:在烟雾罩下安全工作。
6. 加入 2.5 卷冷乙醇 100% 和 1/10 卷 3 M 醋酸钠 （NaOAc） pH 5，2。
7. 在 -20 °C 下过夜。
   注意:降水也可以在20分钟内在乙醇/干冰浴中进行，或在2小时内在-80°C。
8. 离心机在 16，000 x g 15 分钟在 4 °C。 用移液器慢慢去除乙醇，同时小心不要干扰颗粒。
   注意:RNA颗粒并不总是可见的，有时在乙醇的存在下是松散的。
9. 加入 500 μL 的 80% 冷乙醇。
10. 离心机在16，000 x g 5分钟在4°C。
11. 通过缓慢地输送乙醇来丢弃乙醇。使用真空浓缩器干燥颗粒，运行模式为 5 分钟。
12. 将颗粒以适当的体积（15-50 μL）的超纯水中补充。将颗粒冻结在-20°C，供以后使用。
13. 使用光谱仪/荧光计（参见 材料表）评估RNA数量（260纳米）和质量（260/280和260/230波长比）。请按照制造商的说明操作。
    注:3-4μg 一般在弹性分数 （E） 中获得。这主要取决于测试条件。

9. 分析MS2亲和力纯化由北方污点³⁶

1. 在 10 μL 的超纯水中稀释 5 μg 的 CE、FT、W 分数和 500 ng E 分数，并与 10 μL 的 RNA 加载缓冲器混合。
2. 在90°C孵育3分钟。
3. 将样品放入含有 1% agarose 凝胶的井中，辅以 20 mM 的紫青酸瓜尼丁，并在 4 °C 的 TBE 1x 缓冲器中以 100-150 V 运行凝胶。 阅读孔茨 （2013）³⁷ 了解更多详情。
4. 通过真空转移在硝基纤维素膜上转移RNA，进行1小时或毛细血管转移过夜。
   注意:毛细血管方法对大型RNA更有效。
5. 使用紫外线交叉链接器在膜上（120 mJ 在 254 nm 处）上进行紫外线交叉链接RNA。
6. 将膜插入混合瓶中，RNA 侧朝上。
7. 添加10-20 mL预热杂交解决方案。在 68 °C 孵化 30 分钟。
8. 丢弃溶液，加入 10-20 mL 的新鲜杂交溶液，辅以 sRNA 特异性探针的 1μL。在 68 °C 的夜间孵化。
   注:DIG 标签 RNA 探头使用 DIG RNA 标签套件合成，并遵循制造商的说明。或者，还可以使用带无线电标记的探头。
9. 用10-20 mL的洗涤溶液1（2倍SSC和0.1%SDS）清洗膜5分钟，在20°C。 重复一次。
10. 在 68 °C 时，用 10-20 mL 的洗涤溶液 2（0.2 倍 SSC 和 0.1% SDS）清洗膜 15 分钟。 重复一次。
11. 在20°C下，用10-20 mL的阻塞解决方案孵化至少30分钟。
12. 丢弃溶液，加入10-20 mL的阻塞溶液，辅以多克隆抗二恶英抗体（1/1000），与碱性磷酸结合。在20°C孵育30分钟。
13. 用10-20 mL的洗涤溶液3（1x雄酸和0.3%补间20）清洗膜15分钟，在20°C。 重复一次。
14. 在 20 °C 时，用 10-20 mL 的检测解决方案（0.1 M Tris HCl 和 0.1 M NaCl pH 9.5） 5 分钟孵化膜。
15. 将膜放在塑料薄膜上，用基板浸泡（见 材料表）。在黑暗中孵育5分钟。
16. 将膜密封在塑料薄膜中。将膜放入自传磁带中。
17. 在专用的黑暗房间将膜暴露在自辐射胶片中。
    注:阐述时间取决于信号强度，从几秒钟到几分钟。
18. 在自动开发设备中显示暴露的薄膜。

10. 为RNA测序准备样品

注:此步骤仅涉及从 E 和 CE 分数中提取的 RNA。

1. 添加到每个样本 10 μL 的 10 倍 DNase 缓冲器和 DNase I （1 U/μg 的处理RNA）。加入水，最终积100微l。
2. 在37°C孵化1小时。
3. 提取和净化 RNA，如前所述（步骤 8.2 至 8.11）。
4. 将RNA颗粒在20微升的超纯水中补充。
   注:剩余DNA的存在可以通过PCR和特定引物（例如16S基因）进行检查。
5. 使用基于微流体的电泳电泳分析系统评估RNA的数量和质量（见 材料表）。
   注:1μg 一般在 DNase 治疗后在洗脱分数 （E） 中获得。
6. 使用细菌 rRNA 耗竭套件去除核糖核
   注意:大而丰富的RNA（即rRNA）往往与亲和力列进行非具体交互。执行此步骤需要 500 ng 提取的 RNA。
7. 再次使用基于微流体的电泳电泳分析系统评估RNA的数量和质量。
8. 使用 cDNA 库准备套件并按照制造商的说明使用 10-20 ng 的核糖核素 RNA 编写 cDNA 库。
9. 使用测序仪器对获得的库进行排序（例如，单端，150 bp;参见 材料表）。
   注:每个样本的读数一般为 500 万至 1000 万次。

11. RNAseq 数据分析 （图 2）

1. 从测序平台下载 FastQ 排序文件。
2. 访问罗斯科夫生物站（https://galaxy.sb-roscoff.fr/）的银河实例并登录。
   注意:使用搜索栏可以轻松找到每个上述算法。为每个工具提供用户指南。
   注意:所需工具的版本可能不同于公共银河服务器^38。
3. 点击 获取数据 图标，然后 从您的计算机上传文件。上传每个 MS2 控制和 MS2-sRNA 样本的快速Q测序文件。还上传 FASTA 参考基因组文件和 GFF 注释文件。
4. 运行快速QC阅读质量报告（银河版本0.69）。
   注:此工具提供原始序列的质量评估（例如，质量评分、适配器序列的存在）。
5. 运行修剪灵活读取修剪工具（银河版本 0.36.6），以显著删除适配器序列和劣质读数。指示用于库准备的适配器序列（例如，TruSeq 3，单端）。添加以下修剪操作:滑动窗口（基地数量=4;平均质量=20）和迷你（最小读数长度=20）。
6. 再次运行 FastQC 读取质量报告（银河版本 0.69）。
7. 运行 Bowtie2 - 地图读取参考基因组（银河版本 2.3.2.2）。使用历史记录中的基因组参考 FASTA 文件以默认设置（非常敏感的本地设置）映射读取。
   注:Bowtie2 工具生成的 BAM 文件可以使用集成基因组学查看器 （IGV） 可视化。还需要关联 BAI 文件。
8. 可选地运行用于编制 BAM 数据集统计数据的"运行旗杆"（银河版本 2.0）。
9. 运行 htseq 计数 - 计数（银河版本 0.6.1），该版本对齐 GFF 注释文件中的读取重叠功能。使用交集（非空）模式。
10. 将htseq计数分析中的所有原始计数文件存档为单个Zip文件。
11. 运行 SARTools DESeq2 以比较数据（银河版本 1.6.3.0）。提供包含原始计数文件和设计文件的 Zip 文件，这是描述实验的选项卡划定文件。仔细遵循所提供的指示生成设计文件。

具有代表性的结果源于对金黄色葡萄球菌²⁹的RSAC靶点的研究。RsaC 是一种非常规的 1，116 nt 长 sRNA。其 5' 端包含多个重复区域，而其 3' 端 （544 nt） 在结构上是独立的，并包含与其 mRNA 目标的所有预测交互站点。当锰 （Mn） 稀缺时，就会诱导这种 sRNA 的表达，这通常在宿主免疫反应的背景下遇到。使用 MAPS 技术，我们识别了几个 mRNA 直接与 RsaC 相互作用，揭示了它在氧化?...

革兰氏阳性细菌的修改协议
MAPS的初始协议是为了研究大肠杆菌^20、30模型中的sRNA相互作用而开发^的。在这里，我们描述了一个修改后的协议，它适用于机会性人类病原体金黄色葡萄球菌中依赖sRNA的监管网络的特征，并且肯定可转化为其他Gram阳性细菌，病原学与否。

特别注意细胞裂解步骤。法国的印刷?...

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了"国家重建联盟"（ANR，授予ANR-16-CE11-0007-01，RIBOSTAPH，和ANR-18-CE12-0025-04，科诺科，公关）的支持。它还在实验室交易所 NetRNA ANR-10-LABX-0036 和 ANR-17-EURE-0023（对 PR）的框架下发布，作为未来项目投资的一部分，由 ANR 管理的国家提供资金。DL得到了欧盟Horizna 2020研究和创新计划的支持，该计划是根据玛丽·斯考多斯卡-库里赠款协议第753137-萨纳雷格号。E. Massé实验室的工作得到了加拿大卫生研究所（CIHR）、加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）和国家卫生研究院NIH团队赠款R01 GM092830-06A1的运营赠款的支持。