J’ai étudié l’impact de l’exposition aiguë aux œstrogènes sur le métabolisme central du carbone plaquettaire et les plaquettes au repos et activées par la thrombine. Nous tentons de déterminer si l’exposition aiguë aux œstrogènes sur les plaquettes contribue à l’augmentation du risque thrombotique induite par l’utilisation de contraceptifs oraux. La recherche sur la santé des femmes est largement sous-financée.
Ce projet s’inscrivait dans le cadre d’un appel plus vaste des NIH visant à combler les lacunes dans les connaissances sur la santé des femmes. Bien que les contraceptifs soient disponibles depuis plus de 50 ans, nous ne connaissons toujours pas le mécanisme exact qui entraîne un risque thrombotique plus élevé. Variabilité biologique.
Les techniques traditionnelles de culture cellulaire ne s’appliquent pas aux plaquettes, ce qui signifie que les plaquettes proviennent de donneurs de génotypes différents. Des échantillons de grande taille sont nécessaires, ce qui souligne la nécessité d’une procédure d’isolement plaquettaire reproductible. Les protocoles de lavage des plaquettes existants sont rédigés pour des experts dans le domaine de la biologie des plaquettes.
Il y a un certain nombre de défis uniques associés au travail sur les plaquettes que mon protocole met en évidence pour le chercheur novice sur les plaquettes. Pour commencer, préchauffez le bain-marie à 37 degrés Celsius et placez-y le tampon Tyrode modifié contenant du glucose. Combinez tout le sang prélevé sur tous les vacutainers dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres.
À l’aide d’une pointe de pipette coupée en biseau, prélevez un volume d’échantillon approprié pour effectuer un comptage cellulaire. Aspirez soigneusement avec une pipette de transfert à alésage étroit pour éliminer les bulles générées. Laissez ensuite reposer le sang dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes.
Pour éviter l’activation pendant la centrifugation, ajoutez de la prostaglandine I2 et de l’apyrase au sang total et retournez le tube une fois pour mélanger l’échantillon. Ensuite, centrifugez le sang entier à 250 G pendant 15 minutes sans pause à 37 degrés Celsius. Récupérez le PRP, qui apparaît comme la couche jaune supérieure au-dessus de la couche chamoisique et la couche de sang rouge dans un nouveau tube conique incliné de 50 millilitres le long de la paroi.
Laissez reposer le PRP pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, mélangez le PRP avec 500 nanomolaires de prostaglandine I2 et 0,02 unité par millilitre d’apyrase. Centrifugez le mélange à 1 000 G pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius sans accélération ni pause.
À l’aide d’une pipette de transfert en plastique de gros calibre, aspirez le surnageant pour le volume en vrac, puis utilisez une pipette d’un millilitre avec une pointe non coupée pour aspirer le liquide restant près de la pastille. Ajoutez ensuite de la prostaglandine I2 et du tampon Tyrode contenant de l’apyrase à la pastille, sur le côté du tube conique. À l’aide d’une pointe coupée en biseau et d’une pointe de pipette d’un millilitre, remettez doucement la pastille en suspension à plusieurs reprises.
Une fois la pastille remise en suspension, utilisez une pipette de transfert à large diamètre pour la transférer dans un nouveau tube conique, en laissant derrière elle les globules rouges ou les cellules visiblement agglomérées. Prélevez ensuite un échantillon pour la cytométrie en flux à l’aide d’une pointe de pipette coupée en biseau. Incuber le reste des plaquettes pendant une heure à 37 degrés Celsius pour permettre aux inhibiteurs de s’estomper.
Après l’incubation, mélangez délicatement l’échantillon à l’aide d’une pipette de gros calibre et aliquotez les échantillons pour la cytométrie en flux. La récupération moyenne des plaquettes du sang total était d’environ 52 %, la contamination des globules blancs restant inférieure à 0,1 % après le processus de lavage. L’exposition à la sélectine P était faible tout au long du processus de lavage, mais a augmenté de manière significative après le traitement à la thrombine.
Les niveaux de fibrinogène lié ont d’abord augmenté après le premier spin de 1 000 G, mais sont tombés en dessous de 5 % après le deuxième spin, augmentant à nouveau de manière significative après le traitement par thrombine. Les plaquettes ont été contrôlées avec succès pour la taille, les débardeurs et la positivité CD42a avant de mesurer les marqueurs d’activation. Le traitement à la thrombine a entraîné une augmentation significative de l’expression de la P-sélectine et du fibrinogène par rapport au contrôle.
Pour commencer, obtenez les plaquettes lavées à partir d’échantillons de sang humain. Après avoir pré-refroidi la microcentrifugeuse à zéro degré Celsius, récupérez la suspension plaquettaire dans une solution saline normale partiellement congelée dans un rapport de 1:6. Centrifugez le mélange à 16 000 G pendant 10 minutes à zéro degré Celsius.
Aspirez le surnageant dans un tube de microcentrifugation séparé. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de méthanol :eau pré-refroidi à moins 20 degrés Celsius à la pastille trempée et agitez vigoureusement pendant une minute. Congelez l’échantillon dans de l’azote liquide et décongelez-le à zéro degré Celsius.
Centrifugez à nouveau la suspension à 16 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis recueillez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Après avoir séché le surnageant pendant la nuit, remettez l’extrait sec en suspension dans 150 microlitres d’eau de qualité LC/MS et mélangez pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Vortex brièvement et transférez l’extrait dans un tube de microcentrifugation de 0,22 micromètre pour éliminer les débris cellulaires.
Centrifugez l’échantillon pendant cinq minutes à 16 000 G et quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, pipetez 50 microlitres d’eau supplémentaires sur le filtre et centrifugez à nouveau pendant cinq minutes à 16 000 G et quatre degrés Celsius. Enfin, prélevez le filtrat pour analyse.
La production de lactate était positive dans tous les échantillons de donneurs, tandis que le glucose et l’acétate étaient constamment consommés, la thrombine augmentant ces flux.
