Estudié el impacto de la exposición aguda a estrógenos en el metabolismo del carbono central de las plaquetas y las plaquetas activadas en reposo y trombina. Estamos tratando de determinar si la exposición aguda al estrógeno en las plaquetas contribuye al aumento del riesgo trombótico impartido por el uso de anticonceptivos orales. La investigación sobre la salud de la mujer está en gran medida infrafinanciada.
Este proyecto fue parte de un llamado más amplio de los NIH para abordar las brechas en el conocimiento sobre la salud de la mujer. A pesar de que los anticonceptivos están disponibles desde hace más de 50 años, todavía no conocemos el mecanismo exacto que resulta en un mayor riesgo trombótico. Variabilidad biológica.
Las técnicas tradicionales de cultivo celular no se aplican a las plaquetas, lo que significa que las plaquetas provienen de donantes con diferentes genotipos. Se necesitan muestras de gran tamaño, lo que enfatiza la necesidad de un procedimiento de aislamiento plaquetario repetible. Los protocolos de lavado de plaquetas existentes están escritos para expertos en el campo de la biología de las plaquetas.
Hay una serie de desafíos únicos asociados con el trabajo con plaquetas que mi protocolo destaca para el investigador novato de plaquetas. Para comenzar, precaliente el baño de agua a 37 grados centígrados y coloque en él el tampón Tyrode modificado que contiene glucosa. Combine la sangre entera recolectada de todos los vacutainers en un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros.
Con una punta de pipeta cortada en bisel, tome un volumen de muestra adecuado para realizar un recuento de células. Aspire cuidadosamente con una pipeta de transferencia de diámetro estrecho para eliminar las burbujas generadas. Luego deje reposar la sangre en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 25 minutos.
Para evitar la activación durante la centrifugación, agregue prostaglandina I2 y apirasa a la sangre total e invierta el tubo una vez para mezclar la muestra. A continuación, centrifugar toda la sangre a 250 g durante 15 minutos sin descanso a 37 grados centígrados. Recoja el PRP, que aparece como la capa amarilla superior sobre el pelaje leucocitario y la capa roja de sangre en un nuevo tubo cónico inclinado de 50 mililitros a lo largo de la pared.
Deje reposar el PRP durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, mezclar el PRP con 500 nanomolares de prostaglandina I2 y 0,02 unidades por mililitro de apirasa. Centrifugar la mezcla a 1.000 g durante 10 minutos a 37 grados centígrados sin aceleración y sin pausa.
Ahora, utilizando una pipeta de transferencia de plástico de diámetro ancho, aspire el sobrenadante para el volumen a granel y, a continuación, utilice una pipeta de un mililitro con una punta sin cortar para aspirar el líquido restante cerca del pellet. A continuación, añada prostaglandina I2 y tampón Tyrode que contiene apirasa al pellet, por el lateral del tubo cónico. Con una punta de corte en bisel y una punta de pipeta de un mililitro, vuelva a suspender suavemente el pellet varias veces.
Una vez que se haya resuspendido el pellet, utilice una pipeta de transferencia de diámetro ancho para transferirlo a un nuevo tubo cónico, dejando atrás los glóbulos rojos o las células visiblemente agrupadas. A continuación, tome una muestra para la citometría de flujo utilizando una punta de pipeta de corte biselado. Incubar el resto de las plaquetas durante una hora a 37 grados centígrados para permitir que los inhibidores desaparezcan.
Después de la incubación, mezcle suavemente la muestra con una pipeta de diámetro ancho y alícuota las muestras para la citometría de flujo. La recuperación media de plaquetas de la sangre total fue de alrededor del 52 %, con una contaminación de glóbulos blancos inferior al 0,1 % después del proceso de lavado. La exposición a la P-selectina fue baja durante todo el proceso de lavado, pero aumentó significativamente después del tratamiento con trombina.
Los niveles de fibrinógeno ligado inicialmente se dispararon después del primer giro de 1.000 G, pero cayeron por debajo del 5% después del segundo giro, aumentando nuevamente significativamente después del tratamiento con trombina. Las plaquetas se controlaron con éxito para determinar el tamaño, los singletes y la positividad de CD42a antes de medir los marcadores de activación. El tratamiento con trombina condujo a un aumento significativo en la expresión de P-selectina y fibrinógeno en comparación con el control.
Para empezar, obtenga las plaquetas lavadas de muestras de sangre humana. Después de preenfriar la microcentrífuga a cero grados centígrados, recoja la suspensión de plaquetas en solución salina normal parcialmente congelada en una proporción de 1:6. Centrifugar la mezcla a 16.000 g durante 10 minutos a cero grados centígrados.
Aspire el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga separado. A continuación, agregue 0,5 mililitros de metanol preenfriado: agua a menos 20 grados Celsius al pellet apagado y al vórtice vigorosamente durante un minuto. Congele la muestra en nitrógeno líquido y descongele a cero grados centígrados.
Centrifugar la suspensión nuevamente a 16.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga. Después de secar el sobrenadante durante la noche, vuelva a suspender el extracto seco en 150 microlitros de agua de grado LC/MS y mezcle durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Realice un vórtice breve y transfiera el extracto a un tubo de microcentrífuga de 0,22 micrómetros para eliminar los restos celulares.
Centrifugar la muestra durante cinco minutos a 16.000 g y cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, pipetee 50 microlitros adicionales de agua en el filtro y vuelva a centrifugar durante cinco minutos a 16.000 g y cuatro grados centígrados. Finalmente, recoja el filtrado para su análisis.
La producción de lactato fue positiva en todas las muestras de donantes, mientras que la glucosa y el acetato se consumieron de manera constante, y la trombina aumentó estos flujos.
