Nous nous engageons à étudier le mécanisme de fusion des membranes intracellulaires. Dans ce protocole, nous visons à réaliser la dynamique conformationnelle de la protéine de fusion membranaire du réticulum endoplasmique, l’atlastine, pendant son cycle d’hydrolyse GTP par smFRET. L’atlastine peut exister sous forme de monomère ou de dimère dans le cycle d’hydrolyse du GTP.
Dans les expériences sur une seule molécule, il est difficile de trouver des stratégies appropriées de marquage et d’immobilisation des protéines, et ce qui suit présente la dynamique conformationnelle de l’atlastine tout au long du cycle d’hydrolyse du GTP. Par rapport à la FRET en vrac, la smFRET peut surveiller avec précision les conformations des protéines sous différents états de charge nucléotidique, fournissant ainsi un aperçu direct du comportement des molécules modulatrices. Nous avons utilisé le smFRET pour résoudre complètement le cycle d’hydrolyse GTP de l’atlastine au cours de différentes stratégies de position.
Nous pensons que nos résultats favoriseront une plus grande dynamique conformationnelle dans l’étude des protéines d’hydrolyse GTP et fourniront de nouvelles interprétations de processus biologiques rares. Pour nettoyer la surface de la lamelle, utilisez une pince à épiler pour ramasser huit lamelles et placez-les dans un bocal de coloration. Ajoutez 50 millilitres d’acétone pour couvrir les lamelles et placez le pot de coloration dans un nettoyeur à ultrasons pendant 30 minutes.
Rincez les lamelles trois fois avec de l’eau bi-distillée et lavez-les au méthanol dans un nettoyeur à ultrasons. Ensuite, ajoutez la solution de piranha dans le pot de coloration et chauffez-le dans une bouilloire au bain-marie à 95 degrés Celsius pendant deux heures. Après avoir refroidi le bocal à température ambiante, rincez les lamelles six fois avec de l’eau bidistillée.
Ajoutez la solution de méthoxyde de sodium dans le bocal de coloration et placez-la dans le nettoyeur à ultrasons pendant 15 minutes. Après avoir rincé les lamelles à l’eau, ajoutez de l’eau bi-distillée dans le pot de coloration et placez-la dans le nettoyeur à ultrasons pendant 15 minutes. Fixez les lamelles dans le bocal de coloration et séchez-les avec de l’azote.
Transférez les lamelles séchées dans un autre bocal de coloration et faites cuire le bocal dans un four de séchage à 120 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, refroidissez le pot à température ambiante dans un dessiccateur. Ajoutez 47,5 millilitres de méthanol, 2,5 millilitres d’acide acétique et 0,5 millilitre de triéthoxysilane dans un bécher et mélangez uniformément.
Transférez le mélange dans le pot de coloration et incubez pendant 10 minutes. Rincez les lamelles trois fois avec de l’eau distillée deux fois dans le bocal de coloration et sonicez pendant cinq minutes. Après avoir rincé les lamelles à l’eau et les avoir séchées à l’azote comme indiqué, placez les lamelles dans une boîte de Pétri de 10 centimètres de diamètre.
Dissoudre le SVA-mPEG et le SVA-mPEG-Biotine dans la solution à haute teneur en sel dans un rapport de 1:100. Déposez le mélange préparé sur une lamelle et couvrez-le avec une autre lamelle. Incuber les lamelles avec une humidité appropriée pendant deux heures ou toute la nuit.
Après modification, séparez les lamelles, rincez-les à l’eau déminéralisée et séchez-les au lait avec de l’azote. Placez soigneusement la lamelle modifiée dans un tube de 50 millilitres. Après avoir purifié le domaine GTPase de l’atlastine, une protéine de type dynamine ou ATL exprimée dans les cellules E. coli de Rosetta, remplacez le tampon protéique par le tampon de biotinylation protéique à l’aide d’un filtre centrifuge de 10 kilodaltons.
Pour la biotinylation des protéines, mélangez 100 microlitres chacun d’ATP de 100 millimolaires, d’acétate de magnésium de 100 millimolaires et de D-biotine de 500 micromolaires, 10 microlitres de biotine ligase BirA de 100 micromolaires et 50 micromolaires de protéines pour obtenir un volume final d’un millilitre. Incuber le mélange pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, éliminez la D-biotine libre à l’aide d’un filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons.
Incuber 20 microlitres de protéines biotinylées avec 20 microlitres de streptavidine 15 micromolaires pendant 20 minutes sur glace. Détectez l’efficacité de la biotinylation des protéines à l’aide de SDS-PAGE. Dissoudre les fluorophores LD555 et LD655 dans le sulfoxyde de diméthyle jusqu’à une concentration finale de cinq millimolaires.
Pour préparer le tampon d’étiquetage, mélangez 25 millimolaires d’HEPES, 150 millimolaires de chlorure de potassium et cinq millimolaires de chlorure de magnésium. Remplacez le tampon protéique par le tampon d’étiquetage à l’aide d’un filtre centrifuge de 10 kilodaltons. Pour les tests smFRET intramoléculaires, mélanger ATL1cyto-TK avec LD555 et LD655 dans un rapport de 1:1,2:1,2 jusqu’à un volume final de 100 microlitres.
Incuber le mélange pendant cinq heures à quatre degrés Celsius. Pour les tests smFRET intermoléculaires, incuber ATL1cyto-K avec LD555 et ATL1cyto-K biotinylé avec LD655 pendant cinq heures à quatre degrés Celsius. Pour préparer la chambre d’immobilisation des protéines, collez soigneusement la lamelle modifiée et la lame de microscope avec du ruban adhésif double face personnalisé.
Installez les tuyaux et les embouts pour former une chambre microfluidique à six canaux. Pour les corrections de cartographie, ajoutez 10 microlitres de particules de polystyrène à 10 % sur une lame de microscope et couvrez-la d’une lamelle. Ensuite, à l’aide d’un microscope à fluorescence à réflexion interne totale, sélectionnez un champ de vision contenant des particules de polystyrène et capturez une vidéo en mode fond clair.
Utilisez un script personnalisé pour aligner l’emplacement central de la même particule de polystyrène dans les canaux donneur et accepteur. Enregistrez le fichier de mappage en tant que fichier TXT. Pour les expériences intermoléculaires smFRET, mélangez l’ATL1cyto-K marqué LD555 avec la biotine ATL1cyto-K marquée LD655 dans un rapport univoque avec une concentration finale d’un millimolaire de GTP-gamma-S.
Incuber le mélange sur de la glace pendant une heure pour dimériser les protéines. Mélangez l’ATL1cyto-T marqué LD555 avec la biotine ATL1cyto-K marquée LD655 dans un rapport de un à un avec un millimolaire de GTP-gamma-S pour les expériences smFRET intermoléculaires ATL1cyto-T et ATL1cyto-K. Incuber le mélange sur de la glace pendant une heure pour obtenir des protéines dimérisées.
Ensuite, pour les tests de smFRET intramoléculaires, incubez LD555 et LD655 marqués ATL1cyto-TK avec un millimolaire de GDP sur glace pendant une heure. Pour les expériences intermoléculaires, incubez 10 microgrammes par millilitre de streptavidine pendant 10 minutes pour immobiliser les protéines. Pour les tests intramoléculaires, ajoutez 10 microgrammes par millilitre d’anticorps anti-His biotinylé et incubez pendant 10 minutes pour immobiliser les protéines.
Après l’incubation, ajoutez le dimère ATL1 dilué à la protéine dans le canal et laissez-le s’immobiliser pendant 10 minutes. Rincez le canal deux fois avec un tampon d’incubation. Ajoutez de l’acide benzoïque et du PCD dans le canal à une concentration finale de 2,5 millimolaires.
Sélectionnez le laser de 532 nanomètres comme source de lumière d’excitation. Réglez la caméra EMCCD pour qu’elle enregistre les données à un intervalle d’image de 30 millisecondes. Sauvegardez les films enregistrés au format TIFF 16 bits.
Après l’acquisition des données, extrayez les pistes FRET des films enregistrés. Sélectionnez et enregistrez les pistes FRET au format TXT. Extrayez les données des fichiers TXT et calculez les valeurs FRET à l’aide de scripts faits maison dans MATLAB.
Ajustez les données smFRET par GaussAmp dans Origin pour obtenir l’histogramme de distribution.
