نحن ملتزمون بدراسة آلية اندماج الأغشية داخل الخلايا. في هذا البروتوكول ، نهدف إلى إدراك الديناميكيات التوافقية لبروتين اندماج غشاء الشبكة الإندوبلازمية أتلاستين خلال دورة التحلل المائي GTP بواسطة smFRET. قد يوجد أتلاستين كمونومر أو ثنائي في دورة التحلل المائي GTP.
في تجارب الجزيء الواحد ، من الصعب العثور على استراتيجيات مناسبة لوضع العلامات على البروتين وتثبيت الحركة ، وفيما يلي يعرض الديناميكيات التوافقية للأتلاستين طوال دورة التحلل المائي GTP. بالمقارنة مع FRET السائبة ، يمكن ل smFRET مراقبة مطابقات البروتين بدقة في ظل حالات تحميل النيوكليوتيدات المختلفة ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة مباشرة لسلوك جزيئات المغير. استخدمنا smFRET لحل دورة التحلل المائي GTP للأتلاستين بشكل كامل خلال استراتيجيات الموضع المختلفة.
نعتقد أن النتائج التي توصلنا إليها ستعزز المزيد من الديناميكيات التوافقية في دراسة بروتينات التحلل المائي GTP ، وتوفر تفسيرات جديدة للعملية البيولوجية النادرة. لتنظيف سطح الغطاء ، استخدم الملقط لالتقاط ثمانية أغطية ، وضعها في وعاء تلطيخ. أضف 50 مل من الأسيتون لتغطية الغطاء ، وضع جرة التلوين في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة.
شطف الأغطية ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج ، واغسلها بالميثانول في منظف بالموجات فوق الصوتية. بعد ذلك ، أضف محلول سمكة الضاري المفترسة إلى برطمان التلوين ، وقم بتسخينه في غلاية حمام مائي على حرارة 95 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد تبريد البرطمان إلى درجة حرارة الغرفة ، اشطف الغطاء ست مرات بالماء المقطر المزدوج.
أضف محلول ميثوكسيد الصوديوم في وعاء التلوين ، وضعه في منظف الموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة. بعد شطف الأغطية بالماء ، أضف الماء المقطر المزدوج إلى جرة التلوين ، وضعها في منظف الموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة. قم بتثبيت الأغطية في جرة التلوين وجففها بالنيتروجين.
انقل الأغطية المجففة إلى برطمان تلطيخ آخر ، واخبزي البرطمان في فرن تجفيف على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتبريد البرطمان إلى درجة حرارة الغرفة في مجفف. أضف 47.5 مل من الميثانول ، و 2.5 مل من حمض الأسيتيك ، و 0.5 مل من ثلاثي إيثوكسيسيلان إلى دورق واخلطه بالتساوي.
انقلي الخليط إلى برطمان التلوين واحتضنه لمدة 10 دقائق. اشطف الأغطية ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج في جرة التلوين ، وصوتنة لمدة خمس دقائق. بعد شطف الأغطية بالماء وتجفيفها بالنيتروجين كما هو موضح ، ضع الغطاءات في طبق بتري قطره 10 سم.
قم بإذابة SVA-mPEG و SVA-mPEG-Biotin في محلول عالي الملح بنسبة 1: 100. أسقط المزيج المحضر على غطاء وقم بتغطيته بغطاء آخر. احتضن الأغطية بالرطوبة المناسبة لمدة ساعتين أو طوال الليل.
بعد التعديل ، افصل الأغطية واشطفها بالماء منزوع الأيونات وجففها بالنيتروجين. ضع الغطاء المعدل بعناية في أنبوب سعة 50 مل. بعد تنقية مجال GTPase للبروتين الشبيه بالدينامين أتلاستين أو ATL المعبر عنه في خلايا الإشريكية القولونية Rosetta ، قم بتغيير المخزن المؤقت للبروتين إلى مخزن الإيثيوتينيل الحيوي للبروتين باستخدام مرشح طرد مركزي 10 كيلودالتون.
بالنسبة لبيوتينيل البروتين ، امزج 100 ميكرولتر لكل من 100 ملليمولار ATP ، و 100 مللي مولار أسيتات المغنيسيوم ، و 500 ميكرومولار D-biotin ، و 10 ميكرولتر من 100 ميكرومولار BirA biotin ligase ، و 50 ميكرومولار من البروتين إلى حجم نهائي قدره مليلتر واحد. احتضن الخليط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة D-biotin الحر باستخدام مرشح طرد مركزي بوزن جزيئي 10 كيلودالتون.
احتضان 20 ميكرولترا من البروتين البيوتينيل مع 20 ميكرولترا من الستربتافيدين 15 ميكرومولار لمدة 20 دقيقة على الثلج. الكشف عن كفاءة بيوتينيل البروتين باستخدام SDS-PAGE. قم بإذابة الفلوروفورات LD555 و LD655 في ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى تركيز نهائي يبلغ خمسة مللي مولار.
لتحضير المخزن المؤقت لوضع العلامات ، اخلطي 25 ملليمولار HEPES و 150 مللي مولار كلوريد البوتاسيوم وخمسة مللي مولار كلوريد المغنيسيوم. قم بتغيير المخزن المؤقت للبروتين إلى المخزن المؤقت لوضع العلامات باستخدام مرشح طرد مركزي 10 كيلودالتون. بالنسبة لمقايسات smFRET داخل الجزيئات ، امزج ATL1cyto-TK مع LD555 و LD655 بنسبة 1: 1.2: 1.2 إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر.
يحتضن الخليط لمدة خمس ساعات عند أربع درجات مئوية. بالنسبة لمقايسات smFRET بين الجزيئات ، احتضان ATL1cyto-K مع LD555 و ATL1cyto-K الحيوي مع LD655 لمدة خمس ساعات عند أربع درجات مئوية. لتحضير غرفة تثبيت البروتين ، قم بلصق شريحة الغطاء المجهر المعدلة بعناية بشريط مخصص على الوجهين.
قم بتركيب الخراطيم والنصائح لتشكيل غرفة ميكروفلويديك بست قنوات. لتصحيحات رسم الخرائط ، أضف 10 ميكرولتر من جزيئات البوليسترين بنسبة 10٪ على شريحة مجهرية وقم بتغطيتها بغطاء غطاء. بعد ذلك ، تحت مجهر مضان الانعكاس الداخلي الكلي ، حدد مجال رؤية يحتوي على جزيئات البوليسترين والتقط مقطع فيديو في وضع المجال الساطع.
استخدم برنامجا نصيا مخصصا لمحاذاة الموقع المركزي لنفس جسيم البوليسترين في كل من القناتين المانحة والمتقبلة. احفظ ملف الخريطة كملف TXT. بالنسبة لتجارب smFRET بين الجزيئات ، امزج LD555 المسمى ATL1cyto-K مع LD655 المسمى ATL1cyto-K-biotin بنسبة واحد إلى واحد مع تركيز نهائي يبلغ مللي مولار واحد من GTP-gamma-S.
احتضن الخليط على الثلج لمدة ساعة لتضميع البروتينات. امزج LD555 المسمى ATL1cyto-T مع LD655 المسمى ATL1cyto-K-biotin بنسبة واحد إلى واحد مع مللي مولار واحد من GTP-gamma-S لتجارب ATL1cyto-T و ATL1cyto-K بين الجزيئات smFRET. احتضان الخليط على الثلج لمدة ساعة للحصول على بروتينات مختفوقة.
بعد ذلك ، بالنسبة لمقايسات smFRET داخل الجزيئات ، احتضن LD555 و LD655 المسمى ATL1cyto-TK مع مللي مولار واحد من الناتج المحلي الإجمالي على الجليد لمدة ساعة واحدة. بالنسبة للتجارب بين الجزيئات ، احتضن 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الستربتافيدين لمدة 10 دقائق لشل حركة البروتينات. بالنسبة للمقايسات داخل الجزيئات ، أضف 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد المضاد للبيوتينيل واحتضانه لمدة 10 دقائق لشل حركة البروتينات.
بعد الحضانة ، أضف ثنائي ATL1 المخفف إلى البروتين الموجود في القناة واتركه يشل ثلولا لمدة 10 دقائق. اغسل القناة مرتين باستخدام مخزن مؤقت للحضانة. أضف حمض البنزويك و PCD إلى القناة بتركيز نهائي قدره 2.5 ملليمولار.
حدد الليزر 532 نانومتر كمصدر لضوء الإثارة. اضبط كاميرا EMCCD لتسجيل البيانات بفاصل إطارات يبلغ 30 مللي ثانية. احفظ الأفلام المسجلة بتنسيق TIFF 16 بت.
بعد الحصول على البيانات ، استخرج مسارات FRET من الأفلام المسجلة. حدد مسارات FRET واحفظها بتنسيق TXT. استخرج البيانات من ملفات TXT ، واحسب قيم FRET باستخدام البرامج النصية محلية الصنع في MATLAB.
قم بتركيب بيانات smFRET بواسطة GaussAmp في Origin للحصول على الرسم البياني للتوزيع.
