Dans le modèle de silicose de souris décrit généré par perfusion intra-laser de poussière de silice cristalline, toutes les suspensions de CSD ont simulé plusieurs fois l’apparition et le développement de la silicose humaine dans une large mesure. Cette méthode permet de gagner du temps et de gagner du temps, ainsi que d’être pratique et efficace. De plus, ne cause aucune lésion mécanique aux voies respiratoires supérieures due à l’opération.
Cette méthode pourrait également être utilisée pour préparer des modèles de maladies de virus, de bactéries, et cetera. La démonstration de la procédure sera faite par Hangbing Cao, un étudiant de master de mon laboratoire, qualifié dans la préparation du modèle de souris de silicose. Commencez par préparer la poussière de silice cristalline ou CSD au moins un jour avant d’administrer les gouttes nasales.
Pour ce faire, broyez la silice dans un mortier d’agate pendant une demi-heure. Pour vérifier la taille et la forme des particules, préparez l’échantillon pour la microscopie électronique à balayage ou le MEB à l’aide d’un ruban conducteur pour lier les particules de silicium. À l’aide d’un sèche-cheveux, soufflez doucement les particules qui ne sont pas fermement liées avant de procéder à la capture de l’image.
Ensuite, mélangez la silice moulue et la solution saline stérile à une concentration de 20 milligrammes par millilitre à l’aide d’un agitateur à ultrasons. Enfin, faites vortex la suspension CSD préparée pendant 10 secondes. Administrer 50 microlitres de CSD à la souris anesthésiée par goutte à goutte nasale pendant quatre à huit secondes.
Traitez la souris témoin avec une quantité égale de solution saline, puis en tenant le corps de la souris avec la paume, pincez la peau à l’arrière du cou avec le pouce et l’index tout en fixant les membres postérieurs de la souris avec les autres doigts. Appuyez doucement sur la zone de battement du cœur de la souris avec l’autre index cinq à dix fois pendant cinq secondes. Chauffez le tissu pulmonaire enrobé de paraffine sur une plaque chauffante à 60 degrés Celsius pendant plus de quatre heures.
Pour dépatisser et hydrater la section de paraffine, faites tremper la lame dans du xylène pendant 30 minutes deux fois, puis trempez séquentiellement la lame pendant cinq minutes chacune dans de l’éthanol anhydre à 95 %, 85 % et 75 %, et enfin, dans de l’eau déminéralisée, puis placez la lame dans le seau de coloration à l’hématoxyline pendant 10 minutes avant de rincer doucement à l’eau courante pendant cinq minutes. Plongez-le dans le seau de coloration à l’éosine pendant 10 secondes. Après avoir déshydraté l’échantillon dans de l’éthanol anhydre à 75 %, 85 % et de l’éthanol anhydre pendant cinq minutes chacun, nettoyez la section de tissu en l’immergeant dans du xylène pendant cinq minutes et scellez-la avec environ 60 microlitres de gouttes de résine neutre.
Placez soigneusement la glissière de couvercle sur la section. Pour la coloration Masson, colorez les échantillons de paraffine déparaffinés et hydratés avec de l’hématoxyline de Weigert à 50 % fraîchement préparée pendant 10 minutes, puis après avoir trempé le tissu dans de la liquifaction d’éthanol acide pendant 10 secondes, rincez doucement la lame à l’eau courante pour le bleuissement des noyaux. Ensuite, colorez l’échantillon avec des gouttes de solution de coloration rouge pendant sept minutes et lavez-le avec une solution de travail à l’acide chlorhydrique à 30% pendant une minute.
Après avoir trempé la lame dans de l’alcool à 95 % pendant 20 secondes, déshydratez l’échantillon avec de l’éthanol anhydre pendant une à trois secondes deux fois et, comme démontré précédemment, nettoyez et scellez l’échantillon. Pour la coloration au rouge Sirius, infiltrez la section déparaffinée et hydratée pendant une heure avec la solution de coloration au rouge Sirius, puis colorez les noyaux cellulaires pendant huit à 10 minutes avec la solution de coloration à l’hématoxlyn de Mayer. Rincez-le doucement à l’eau courante pendant 10 minutes avant de le déshydrater, de le nettoyer et de le sceller.
Infiltrer l’échantillon de paraffine déparaffinée et hydratée avec 30 millilitres d’une solution de récupération d’antigène EDTA de trois milligrammes par millilitre. Faites bouillir l’échantillon pendant 20 à 30 minutes avant de le laver avec de l’eau déminéralisée et de l’incuber dans du PBST pendant cinq minutes. Faites tremper l’échantillon pendant 15 minutes avec une solution de peroxyde d’hydrogène à 0,3 % fraîchement préparée et lavez-le trois fois pendant cinq minutes chacune avec du PBST.
Perméabiliser la membrane de l’échantillon pendant 15 minutes avec une solution de Triton 100 à 0,3 % et bloquer avec 30 à 40 microlitres d’albumine sérique bovine à 5 % ou BSA pendant une heure. Après avoir retiré la solution bloquante, ajoutez les anticorps primaires NF-kappa B et CD-68 correctement dilués et incubez l’échantillon pendant la nuit à une température de deux à huit degrés Celsius dans une boîte humide IHC pour lames de microscope. Le lendemain, après avoir transféré l’échantillon à température ambiante pendant une heure, lavez-le trois fois pendant cinq minutes chacune avec du PBST.
Incuber l’échantillon pendant une heure dans des anticorps secondaires marqués à la peroxydase de raifort de lapin à température ambiante. Après l’incubation, lavez à nouveau les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacune avec du PBST, puis incubez l’échantillon avec le substrat DAB correspondant à l’anticorps marqué par l’enzyme pendant cinq à 20 minutes. Après avoir trempé la réaction avec de l’eau déminéralisée, contre-colorer l’échantillon pendant 30 secondes avec l’hématoxyline de Weigert.
Rincez-le à l’eau courante pendant une minute, déshydratez-le, nettoyez-le et scellez le tissu. Avant de procéder à l’analyse par transfert Western, homogénéiser le tissu avec la solution de travail RIPA sur de la glace pendant cinq minutes à l’aide d’une meuleuse électrique portative. Incuber pendant une heure sur de la glace en agitant et centrifuger l’homogénat à 14 800 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Prélevez le surnageant et déterminez la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA. Ajoutez 20 microlitres de tampon de charge 5X au surnageant, puis chauffez la solution de stockage de protéines de six microgrammes par microlitre préparée avec RIPA dans un bain métallique à 100 degrés Celsius pendant 20 minutes. Conservez 100 aliquotes de microlitres de la solution protéique dans chaque tube à moins 80 degrés Celsius.
Pour l’électrophorèse, diluez les aliquotes à deux à trois microgrammes par microlitre avec du lysat RIPA, puis ajoutez 20 microgrammes d’échantillon par puits pour faire couler le gel. Transférez la protéine dans une membrane PVDF pré-activée avec du méthanol pendant 20 secondes en utilisant la méthode de transfert humide avec un courant de 400 milliampères pendant une à deux heures. Après avoir lavé la membrane cinq fois pendant cinq minutes chacune avec une solution PBST, bloquez avec 5% BSA ou du lait écrémé pendant une heure.
Immergez les bandelettes dans la solution d’anticorps primaire contenant du NF-kappa B et de la bêta-actine diluée avec 5 % de BSA. Secouez doucement les bandes pendant la nuit à une température de deux à huit degrés Celsius avant de les laver avec du PBST. Ensuite, incubez les bandelettes, d’abord dans l’anticorps secondaire dilué pendant une heure à température ambiante en agitant doucement, puis avec un révélateur de chimiluminescence amélioré pendant trois minutes.
Exposez la bandelette à un imageur de gel pendant 20 secondes et mesurez la valeur grise de la bandelette pour évaluer le niveau de protéines par le logiciel système. Les images MEB du CSD ont montré que les particules étaient de forme irrégulière. La coloration au rouge Sirius réalisée pour mesurer le dépôt de collagène a montré que la progression de la fibrose pulmonaire chez la souris était considérablement accélérée lors de l’exposition au CSD pendant un mois.
La microscopie polarisante a révélé trois types différents de fibres de collagène, dont les fibres de collagène de type 1 indiquées en rouge sont un facteur de risque de silicose, cependant, aucune fibrose significative n’a été trouvée dans le groupe véhicule. C’est ce qu’indiquent également les scores de fibrose respectifs. La coloration HE du tissu pulmonaire de souris traité par CSD a montré des nodules de silice typiques caractérisés par une nécrose liquéfiée après phagocytose de CSD au centre entourée de macrophages à la périphérie.
La coloration de Masson a également montré que les nodules étaient enrichis en CSD accompagné d’une fibrose. La coloration immunohistochimique du CD-68 a en outre révélé la présence importante de macrophages dans le tissu pulmonaire. La microscopie à lumière polarisée a montré que ces macrophages avaient ingéré du CSD, causant de graves lésions pulmonaires.
La coloration immunohistochimique a montré une coloration NF-kappa B plus élevée, indiquant une réponse inflammatoire plus élevée dans le groupe traité par CSD que dans le groupe véhicule. Le transfert Western représentatif a également montré que les souris traitées par CSD avaient une expression plus élevée de NF-kappa B dans le poumon, et que la différence d’expression entre les deux groupes était significative. Pour éviter l’obstruction respiratoire et favoriser la récupération respiratoire, la zone cardiaque de la souris doit être massée doucement cinq à dix fois, comme démontré après une période de cinq secondes.
Ce modèle permet d’explorer certains mécanismes sous-jacents de la silicose et de faciliter le criblage de médicaments thérapeutiques, tout en établissant des paramètres cruciaux tels que la posologie et la durée. Cette technologie offre un moyen pratique, efficace et économique d’exposer des modèles de souris à des particules, qu’il s’agisse de bactéries supplémentaires. La surveillance du comportement des souris peut aider à déterminer les effets potentiels de l’inhalation de particules.
