In dem beschriebenen Maus-Silikose-Modell, das durch Intra-Laser-Infusion von kristallinem Quarzstaub erzeugt wurde, simulierten alle CSD-Suspensionen mehrfach das Auftreten und die Entwicklung von humaner Silikose in hohem Maße. Diese Methode ist zeitsparend und niveausparend sowie praktisch und effektiv. Darüber hinaus verursacht es keine mechanischen Verletzungen der oberen Atemwege durch die Operation.
Diese Methode könnte auch zur Herstellung von Krankheitsmodellen von Viren, Bakterien usw. verwendet werden. Das Verfahren wird von Hangbing Cao demonstriert, einem Meisterschüler aus meinem Labor, der sich mit der Herstellung des Silikose-Mausmodells auskennt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des kristallinen Quarzstaubs oder CSD mindestens einen Tag vor der Verabreichung der Nasentropfen.
Mahlen Sie dazu eine halbe Stunde lang Kieselsäure in einem Achatmörser. Um die Partikelgröße und -form zu überprüfen, bereiten Sie die Probe für die Rasterelektronenmikroskopie oder das REM vor, indem Sie ein leitfähiges Band verwenden, um die Siliziumpartikel zu binden. Blasen Sie mit einem Föhn die nicht fest gebundenen Partikel vorsichtig weg, bevor Sie mit der Aufnahme des Bildes fortfahren.
Als nächstes mischen Sie die gemahlene Kieselsäure und die sterile Kochsalzlösung in einer Konzentration von 20 Milligramm pro Milliliter mit einem Ultraschallschüttler. Zum Schluss die vorbereitete CSD-Suspension 10 Sekunden lang vortexen. Verabreichen Sie der anästhesierten Maus 50 Mikroliter CSD über einen Nasentropf für vier bis acht Sekunden.
Behandeln Sie die Steuermaus mit der gleichen Menge Kochsalzlösung, halten Sie dann den Körper der Maus mit der Handfläche fest, kneifen Sie mit Daumen und Zeigefinger in die Haut im Nacken, während Sie mit den anderen Fingern die Hinterbeine der Maus fixieren. Drücken Sie mit dem anderen Zeigefinger fünf bis zehn Sekunden lang sanft auf den Herzschlagbereich der Maus. Erhitzen Sie das in Paraffin eingebettete Lungengewebe auf einer heißen Platte bei 60 Grad Celsius über vier Stunden lang.
Um den Paraffinabschnitt zu entwachsen und zu hydratisieren, weichen Sie den Objektträger zweimal 30 Minuten lang in Xylol ein, tauchen Sie den Objektträger dann nacheinander für jeweils fünf Minuten in wasserfreies 95%85%und 75%iges Ethanol und schließlich in deionisiertes Wasser, legen Sie den Objektträger dann 10 Minuten lang in den Hämatoxylin-Färbeeimer, bevor Sie ihn fünf Minuten lang vorsichtig unter fließendem Wasser abspülen. Tauchen Sie es für 10 Sekunden in den Eosin-Färbeeimer. Nachdem Sie die Probe jeweils fünf Minuten lang in 75 %, 85 %, 95 % und wasserfreiem Ethanol dehydriert haben, reinigen Sie den Gewebeabschnitt, indem Sie ihn fünf Minuten lang in Xylol eintauchen, und versiegeln Sie ihn mit etwa 60 Mikrolitern neutraler Harztropfen.
Legen Sie den Abdeckschieber vorsichtig über den Abschnitt. Für die Masson-Färbung färben Sie die entwachsten und hydratisierten Paraffinproben 10 Minuten lang mit frisch zubereitetem 50%Weigert-Hämatoxylin und spülen Sie den Objektträger nach dem 10-sekündigen Einweichen des Gewebes in saurer Ethanolverflüssigung vorsichtig mit fließendem Wasser ab, um die Kernbläue zu verhindern. Anschließend färben Sie die Probe sieben Minuten lang mit Tropfen roter Färbelösung und waschen Sie sie eine Minute lang mit 30%iger Salzsäure-Arbeitslösung.
Nachdem der Objektträger 20 Sekunden lang in 95%igen Alkohol getaucht wurde, wird die Probe zweimal für ein bis drei Sekunden mit wasserfreiem Ethanol dehydriert, und wie zuvor gezeigt, wird die Probe gereinigt und versiegelt. Für die Sirius-Rot-Färbung infiltrieren Sie den entwachsten und hydratisierten Abschnitt für eine Stunde mit Sirius-Rot-Färbelösung und färben dann die Zellkerne acht bis 10 Minuten lang mit Mayer-Hämatoxlyn-Färbelösung. Spülen Sie es 10 Minuten lang vorsichtig unter fließendem Wasser ab, bevor Sie den Objektträger dehydrieren, reinigen und versiegeln.
Infiltrieren Sie die entwachste und hydratisierte Paraffinprobe mit 30 Millilitern einer EDTA-Antigen-Rückgewinnungslösung mit drei Milligramm pro Milliliter. Kochen Sie die Probe 20 bis 30 Minuten lang, bevor Sie sie mit deionisiertem Wasser waschen und fünf Minuten lang in PBST inkubieren. Weichen Sie die Probe 15 Minuten lang in frisch zubereiteter 0,3%iger Wasserstoffperoxidlösung ein und waschen Sie sie dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBST.
Permeabilisieren Sie die Membran der Probe für 15 Minuten mit 0,3%iger Triton 100-Lösung und blockieren Sie mit 30 bis 40 Mikrolitern 5%igem Rinderserumalbumin oder BSA für eine Stunde. Nach dem Entfernen der Blockierungslösung werden die entsprechend verdünnten Primärantikörper NF-kappa B und CD-68 zugegeben und die Probe über Nacht bei zwei bis acht Grad Celsius in einer IHC-Nassbox für Objektträger inkubiert. Am nächsten Tag, nachdem Sie die Probe für eine Stunde auf Raumtemperatur gebracht haben, waschen Sie sie dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBST.
Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang in Kaninchen-Anti-Maus-Meerrettichperoxidase-markierten Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation werden die Proben erneut dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBST gewaschen und dann die Probe fünf bis 20 Minuten lang mit dem DAB-Substrat inkubiert, das dem enzymmarkierten Antikörper entspricht. Nach dem Abschrecken der Reaktion mit deionisiertem Wasser wird die Probe 30 Sekunden lang mit Weigert-Hämatoxylin gegengefärbt.
Spülen Sie es eine Minute lang unter fließendem Wasser ab, entwässern, reinigen und versiegeln Sie das Gewebe. Bevor Sie mit der Western-Blot-Analyse fortfahren, homogenisieren Sie das Gewebe mit RIPA-Arbeitslösung auf Eis fünf Minuten lang mit einem elektrischen Handschleifer. Eine Stunde lang auf Eis mit Schütteln inkubieren und das Homogenat bei 14.800 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Sammeln Sie den Überstand und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Protein-Assay-Kit. Geben Sie 20 Mikroliter 5X-Ladepuffer in den Überstand und erhitzen Sie dann die mit RIPA hergestellte Proteinspeicherlösung mit sechs Mikrogramm pro Mikroliter in einem Metallbad bei 100 Grad Celsius für 20 Minuten. Lagern Sie 100 Mikroliter Aliquots der Proteinlösung in jedem Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius.
Für die Elektrophorese verdünnen Sie die Aliquoten auf zwei bis drei Mikrogramm pro Mikroliter mit RIPA-Lysat und fügen Sie dann 20 Mikrogramm Probe pro Vertiefung hinzu, um das Gel laufen zu lassen. Überführen Sie das Protein für 20 Sekunden auf eine mit Methanol voraktivierte PVDF-Membran im Nasstransferverfahren mit 400 Milliampere Strom für ein bis zwei Stunden. Nachdem Sie die Membran fünfmal für jeweils fünf Minuten mit PBST-Lösung gewaschen haben, blockieren Sie sie eine Stunde lang mit 5 % BSA oder Magermilch.
Tauchen Sie die Streifen in die primäre Antikörperlösung, die NF-kappa B und Beta-Aktin enthält, verdünnt mit 5%BSA. Schütteln Sie die Streifen über Nacht bei zwei bis acht Grad Celsius vorsichtig, bevor Sie sie mit PBST waschen. Als nächstes inkubieren Sie die Streifen, zuerst in dem verdünnten sekundären Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln und dann mit verbessertem Chemilumineszenzentwickler für drei Minuten.
Belichten Sie den Streifen 20 Sekunden lang einem Gel-Imager und messen Sie den Grauwert des Streifens, um den Proteingehalt mithilfe der Systemsoftware zu bestimmen. Die REM-Bilder von CSD zeigten, dass die Partikel unregelmäßig geformt waren. Die Sirius-Rot-Färbung, die zur Messung der Kollagenablagerung durchgeführt wurde, zeigte, dass das Fortschreiten der Lungenfibrose bei Mäusen nach einer CSD-Exposition für einen Monat signifikant beschleunigt wurde.
Die Polarisationsmikroskopie ergab drei verschiedene Arten von Kollagenfasern, von denen die rot dargestellten Kollagenfasern vom Typ 1 ein Risikofaktor für Silikose sind, jedoch wurde in der Vehikelgruppe keine signifikante Fibrose gefunden. Darauf zeigten auch die jeweiligen Fibrose-Scores. Die HE-Färbung von CSD-behandeltem Lungengewebe der Maus zeigte typische Silica-Knötchen, die durch eine verflüssigte Nekrose nach Phagozytose von CSD im Zentrum gekennzeichnet sind, umgeben von Makrophagen in der Peripherie.
Die Masson-Färbung zeigte auch, dass die Knötchen mit CSD angereichert waren, begleitet von einer Fibrose. Die immunhistochemische Färbung von CD-68 zeigte außerdem das breite Vorkommen von Makrophagen im Lungengewebe. Polarisationsmikroskopie zeigte, dass diese Makrophagen CSD aufgenommen hatten, was zu schweren Lungenschäden führte.
Die immunhistochemische Färbung zeigte eine höhere NF-Kappa-B-Färbung, was auf eine höhere Entzündungsreaktion in der CSD-behandelten Gruppe als in der Vehikelgruppe hindeutet. Der repräsentative Western Blot zeigte auch, dass die mit CSD behandelten Mäuse eine höhere NF-kappa-B-Expression in der Lunge aufwiesen, und der Unterschied in der Expression zwischen den beiden Gruppen war signifikant. Um eine Atemblockade zu vermeiden und die Erholung der Atemwege zu fördern, muss der Herzbereich der Maus fünf bis zehn Mal sanft massiert werden, wie nach einem Zeitraum von fünf Sekunden nachgewiesen wird.
Dieses Modell kann einige zugrunde liegende Mechanismen der Silikose untersuchen und das therapeutische Wirkstoff-Screening unterstützen, zusammen mit der Festlegung entscheidender Parameter wie Dosierung und Dauer. Diese Technologie bietet ein bequemes, effektives und wirtschaftliches Mittel, um Mausmodelle Feinstaub auszusetzen, unabhängig davon, ob dadurch Bakterien hinzugefügt werden. Die Überwachung des Verhaltens von Mäusen kann dabei helfen, die möglichen Auswirkungen des Einatmens von Feinstaub zu bestimmen.
