Cette méthode permet de comprendre comment les taux de sécrétion changent avec le temps et comment les cellules réagissent aux signaux solides variant dans le temps. Les principaux avantages de cette technique sont que son faible coût nécessite peu de formation et que la configuration du système de profusion peut être adaptée à de nouvelles expériences. Commencez par remplir une seringue avec une solution de fond et chargez-la dans la première pompe à seringue.
Remplissez une autre seringue avec une solution traceuse et chargez-la dans la deuxième pompe à seringue. Connectez les deux seringues à deux des trois ports d’un robinet d’arrêt à quatre voies à l’aide de connecteurs luer. Fermez le robinet d’arrêt à la solution d’arrière-plan et pompez la solution de traçage dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce qu’il s’écoule de l’orifice ouvert.
Arrêtez la pompe et n’ajustez pas la seringue davantage. Assurez-vous que la barre mobile des pompes à seringue est poussée contre les pistons de la seringue afin que le débit commence immédiatement au démarrage de la pompe. Fermez le robinet d’arrêt à la solution de traceur et pompez la solution d’arrière-plan dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce que toute la solution résiduelle de traceur ait été évacuée du port ouvert.
Arrêtez la pompe et n’ajustez pas la seringue davantage. Configurez le composant du système de flux souhaité pour l’analyse RTD. Insérez l’extrémité dans un distributeur d’embout de pipette et pompez la solution de fond à travers le composant jusqu’à ce qu’il soit entièrement rempli.
Réglez la pompe de la solution de traçage sur le débit souhaité. Fermez le robinet d’arrêt sur la solution d’arrière-plan et démarrez le flux de la solution de traçage. Dans le même temps, démarrez le collecteur de fractions.
Continuez l’écoulement de la solution traceuse pendant une courte période de temps pour approximer une entrée d’impulsion du traceur. Une durée d’impulsion de 10 minutes est recommandée pour les RTD à un débit d’un millilitre par heure. Arrêtez la pompe de solution de traceur à la fin de la période d’impulsion de la solution de traceur.
Fermez rapidement le robinet d’arrêt à la solution de traçage et démarrez le flux de la solution d’arrière-plan au même débit. Laissez la solution d’arrière-plan circuler et collecter des fractions jusqu’à ce que tout le traceur ait traversé le système et dans les fractions collectées. Dans des conditions stériles, insérez les bouchons avec des aiguilles dans les cultures de plaques de puits avec les aiguilles tirées vers le haut.
Une fois le bouchon en place, abaissez les aiguilles à la hauteur souhaitée pour la perfusion, car la hauteur de l’aiguille de sortie détermine le niveau de liquide stable. Boucher les aiguilles avec des capuchons mâles et garder toute la plaque de puits dans un incubateur fixé à 37 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Préparez les deux milieux à utiliser pour la perfusion, en étiquetant le milieu qui sera distribué en premier comme un et l’autre milieu deux.
Pour chaque culture à perfuser, remplissez une seringue avec un milieu pour durer toute la durée de sa dispension plus suffisamment de volume pour remplir initialement le système de perfusion. Remplissez une deuxième seringue avec un milieu deux pour durer toute la durée de sa distribution. Connectez les deux seringues à deux des trois orifices d’un robinet d’arrêt à quatre voies.
Une longueur de tube pour connecter les seringues aux robinets d’arrêt peut être nécessaire. Préparez les robinets d’arrêt en fermant le robinet d’arrêt pour le moyen un et en distribuant le milieu deux dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce qu’il commence à couler le port ouvert. Fermez ensuite le robinet d’arrêt pour le milieu deux et distribuez le milieu un dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce que tout le milieu résiduel deux ait été évacué de l’orifice ouvert.
Fixez le tuyau en amont à l’orifice ouvert du robinet d’arrêt à l’aide d’un connecteur femelle à barbe. Insérez un connecteur mâle à barbe à l’autre extrémité du tube. Distribuer le milieu un de la seringue jusqu’à ce que le tube en amont soit rempli de milieu et procéder à la préparation du tube en aval comme démontré précédemment.
Insérez un connecteur mâle à barbe dans une extrémité du tube en aval et recouvrez-le d’un capuchon femelle. Apportez soigneusement tous les tubes préparés, les seringues et la plaque de puits à l’incubateur qui sera utilisé pour la perfusion. Placez la pompe à seringue et le collecteur de fractions aux endroits souhaités près de l’incubateur.
Placez la pompe à seringue sur ou près de l’incubateur et placez le collecteur de fraction à côté de l’incubateur près du port. Chargez les seringues dans la pompe. Regroupez les extrémités coiffées de tous les tubes en amont et en aval et poussez-les de l’extérieur de l’incubateur vers l’intérieur à travers le port.
Insérez les extrémités ouvertes des tubes en aval dans les extrémités de la pipette de distribution du distributeur à plusieurs têtes du collecteur de fractions. À l’intérieur de l’incubateur, tirez autant de mou que possible des tubes en amont dans l’incubateur pour maximiser la longueur des tubes à travers lesquels le fluide qui s’écoule peut recevoir de la chaleur et du dioxyde de carbone. Pour chaque puits bouché, décapsulez rapidement les aiguilles et les tubes en amont et en aval de ce puits, puis fixez-les ensemble avec leurs connecteurs luer.
Une fois que toutes les pièces sont connectées, faites fonctionner brièvement la pompe à seringue à une vitesse relativement élevée pour vous assurer que tous les flux s’écoulent correctement. À ce stade, si vous souhaitez commencer l’expérience avec les tubes en aval remplis du milieu, continuez à faire fonctionner la pompe jusqu’à ce que tous soient remplis, sinon, arrêtez la pompe. Réglez le débit de la pompe à seringue pour le milieu un et la fréquence de collecte des fractions et démarrez les deux machines simultanément pour commencer l’expérience.
Lorsque la source de milieu doit être changée, arrêtez rapidement la pompe à seringue pour la source moyenne. Tournez le robinet d’arrêt fermé à moyen un et démarrez la pompe à seringue pour le milieu deux. Si vous le souhaitez plus tard, remettez la source à la source moyenne de la même manière.
Collectez des fractions pour la durée d’expérience souhaitée. Les concentrations de traceurs dans les fractions de deux expériences de RTD ont été mesurées et entrées dans le RTD à partir des données du script MATLAB pour produire les deux RTD. Des tubes simples et plusieurs morceaux de tubes en série s’adaptent bien par un seul modèle de dispersion axiale et l’ajout d’une plaque perfusée de 48 puits en ligne a provoqué un écart négligeable permettant à la fois au RTD à tube d’un mètre et au RTD de l’ensemble du système de s’adapter aux fonctions de dispersion axiale.
Un exemple de mauvais ajustement du modèle a été démontré à l’aide du modèle de dispersion axiale adapté aux données RTD du tube d’un mètre et a été tracé à côté des données. Les suppositions initiales des paramètres ont été modifiées pour produire un bon ajustement du modèle où tau était approximativement égal au volume du système de perfusion divisé par son débit volumétrique. Une impulsion de 90 minutes de TNF-alpha a été définie comme le signal d’entrée du système et a été convoluée au RTD de tube d’un mètre pour déterminer le signal TNF-alpha à l’entrée de la plaque de puits.
Le signal d’entrée a également été convolué avec le RTD de l’ensemble du système pour déterminer le signal TNF-alpha à la sortie du système dans les fractions collectées. Les cellules HEK 293 ont été conçues pour sécréter GLuc entraîné par un promoteur contenant l’élément de réponse NF-kappaB. L’expérience a révélé une augmentation significative de l’expression et une diminution lente de l’expression de GLuc entraînée par NF-kappaB après une exposition au TNF-alpha.
Les variantes du système sont décrites dans le document d’accompagnement, y compris une configuration plus simple pour les expériences qui ne nécessitent pas de signaux d’entrée et d’exposition des cellules à des profils de soluté conjonctif pharma-hu.
