La migration cellulaire collective est souvent guidée par le gradient des molécules de signalisation. Dans cette vidéo, nous démontrons comment quantifier les forces cellulaires lors de la migration collective guidée par le gradient biochimique. Ainsi, nous intégrons la puce microfluidique avec la microscopie de traction, puis nous utilisons la puce microfluidique pour générer le gradient biochimique, et nous utilisons la microscopie de traction pour mesurer la force cellulaire.
Le Dr Hwanseok Jang, un étudiant de troisième cycle dans mon laboratoire, démontrera la procédure. Préparez la solution PDMS en mélangeant l’élastomer de base et l’agent curateur à un rapport de dix pour un. Placer 15 millilitres de l’élastomer de base dans un tube conique de 50 millilitres et ajouter 1,5 millilitres d’agent curatif.
Préparez deux de ces tubes. Vortex le mélange PDMS pendant cinq minutes avant de centrifuger à 196 g de temps pendant une minute pour enlever les bulles. Pour fabriquer le pochoir PDMS, versez environ un millilitre du mélange PDMS sur la gaufrette tout en évitant les régions à motifs SU-8 de sorte que le PDMS touche le côté des piliers SU-8, mais pas le haut du modèle SU-8.
Placez la gaufrette sur une surface plane pendant plus de 30 minutes à température ambiante, puis guérir le PDMS dans un four sec à 80 degrés Celsius pendant plus de deux heures. Peler soigneusement le PDMS du moule SU-8, couper la membrane PDMS mince à l’aide d’un poinçon creux de 14 millimètres. Retirer la poussière à la surface des morceaux PDMS à l’aide de ruban adhésif avant d’autoclaving les pochoirs PDMS.
Pour fabriquer du microcanal PDMS, versez environ 30 millilitres de mélange PDMS sur le moule SU-8. Degas pendant 30 minutes dans une chambre à vide, puis guérir le PDMS dans un four sec à 80 degrés Celsius pendant plus de deux heures. Peler soigneusement le PDMS du moule SU-8, et couper le PDMS à une taille de 24 millimètres par 24 millimètres.
Dans chaque bloc PDMS, créer une prise et trois criques à l’aide d’un poinçon biopsie d’un millimètre. Fabriquez et silanize diapositives en verre tel que décrit dans le protocole de texte. Couvrir la surface bordée du verre inférieur de 100 microlitres de la solution bind-silane.
Après avoir laissé le verre à température ambiante pendant une heure, rincer le verre trois fois à l’eau déionisée. Laissez ensuite le verre sécher à température de l’air ambiant ou en soufflant de l’air comprimé. Préparer la solution de gel polyacrylamide tel que décrit dans le protocole texte.
Ensuite, transférer pour 10 microlitres de solution de gel mélangé sur le microwell rectangulaire et placer un glissement de couverture circulaire sur le dessus. Fixez l’assemblage du verre personnalisé, de la solution de gel, et couvrez le glissement sur le couvercle d’une plaque de six puits avec le ruban collant et retournez-le. Puis centrifugeuse pendant 10 minutes à 96 fois g pour amener les particules fluorescentes à la couche supérieure du gel polyacrylamide.
Retirer l’assemblage de la centrifugeuse et le placer sur une surface plane avec le couvercle orienté vers le bas. Après 30 minutes, retourner l’assemblage et le placer dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Remplir le plat de deux millilitres d’eau déionisée.
À l’aide de forceps, retirer délicatement le glissement du couvercle en le glissant d’un côté. Pour coder le collagène sur le gel polyacrylamide, dissoudre un milligramme par millilitre sulfo-SANPAH dans un tampon HEPES chaud de 50 millimères. Déposez 200 microlitres de la solution sur la surface du gel et activez-les par la lumière UV pendant 10 minutes.
Après l’activation uv, rincer le gel deux fois avec 0,1 molar HEPES tampon, puis une fois avec PBS. Codez le gel de polyacrylamide avec la solution de collagène à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, laver le gel trois fois avec PBS.
Plongez le pochoir PDMS autoclavé dans la solution F-127. Gardez-le dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant une heure. Lavez le pochoir PDMS avec du PBS trois fois et retirez le liquide du pochoir PDMS et du gel polyacrylamide.
Placez ensuite le pochoir PDMS sur le gel polyacrylamide et ajoutez du PBS au pochoir. Enlevez les bulles dans les trous du pochoir PDMS en pipetting doucement. Après avoir enlevé les bulles, dégagez le PBS de la surface du pochoir PDMS.
Maintenant, ajoutez 200 microlitres de la solution cellulaire sur le pochoir PDMS et placez le gel dans un incubateur pendant une heure afin que les cellules se fixent au gel de polyacrylamide. Après l’incubation, lavez doucement la solution cellulaire avec des supports de culture cellulaire et ajoutez plus de médias de culture cellulaire. Retirez le pochoir PDMS, vérifiez la formation d’îles cellulaires au microscope.
Ensuite, traitez la surface du microcanal PDMS avec du plasma d’oxygène pendant 30 secondes. Après avoir enlevé tout liquide sur le verre inférieur rempli de gel polyacrylamide, placez le microcanal PDMS sur le dessus du verre inférieur et placez l’assemblage sur le support en verre personnalisé. Remplissez le microcanal de milieu de culture cellulaire.
Pour préparer le tube d’entrée du système microfluidique intégré, connectez une aiguille taillée et une ligne de volume mini de 30 centimètres avec un robinet d’arrêt à trois sens. Préparez trois de ces arrangements. Pour les tubes de sortie, connectez une aiguille taillée et une ligne de volume mini de 75 centimètres avec un robinet d’arrêt à trois sens.
Remplissez les lignes de tubes avec le milieu préchauffé pendant une heure. Préparer les réservoirs en enlevant les pistons des seringues et en reliant les tuyaux d’entrée. Branchez les connecteurs d’aiguille de chaque ligne de tube dans les trois criques et une sortie du dispositif microfluidique.
Remplissez chaque réservoir de trois millilitres de milieu frais ou conditionné. Pour l’essai de gradient, remplissez le réservoir gauche d’entrée avec 20 nanogrammes par facteur milliliter de croissance d’hépatocyte, ou HGF, dans le milieu de culture cellulaire. Pour la visualisation du gradient de concentration, ajouter 200 microgrammes par millilitre de colorant fluorescent au réservoir d’entrée gauche.
Connectez la ligne de tubes de sortie à une pompe à seringues. Placez le système microfluidique intégré sur la scène d’un microscope épifluorescent conventionnel. Prenez des images toutes les 10 minutes jusqu’à 24 heures à l’aide d’un microscope automatisé logé dans un incubateur.
À chaque fois, prenez un ensemble d’images à l’aide d’une lentille objective 4X dans trois canaux différents, y compris une image de phase pour visualiser la migration cellulaire, une image fluorescente verte pour visualiser les perles fluorescentes intégrées dans le gel, et une image fluorescente rouge pour visualiser le gradient de concentration d’un produit chimique. Après avoir pris des images en accéléré, infuser la solution Trypsin-EDTA à 0,25 % en microcanaux pour détacher les cellules du gel polyacrylamide. Lors de l’élimination complète des cellules du gel, prendre une image fluorescente verte pour être utilisé comme une image de référence pour la microscopie de traction.
Procédez à l’analyse des données telle que décrite dans le protocole textuel. Pour mesurer la force contractile et le stress intercellulaire, la microscopie de traction et la microscopie de stress monocouche ont été combinées avec le canal microfluidique. Les cartes ont été tracées en coordination radio avec traction extérieure en utilisant la couleur chaude et la traction vers l’intérieur en utilisant la couleur froide.
À l’époque zéro, toutes les îles ont montré des distributions de traction similaires avec une forte traction vers l’intérieur sur le bord et la fluctuation à l’intérieur de l’île. Après 10 heures d’application du gradient HGF, alors que le degré d’expansion de l’île était différent dans chaque colonne, les distributions de traction étaient en grande partie similaires au temps zéro. La traction moyenne n’a pas changé pendant 10 heures.
Lors du calcul du stress monocouche, cependant, chaque colonne a montré des tendances différentes. Là où la concentration de HGF était faible, la tension moyenne à l’intérieur des îles a été maintenue autour de 200 pascals sur une période de 10 heures. Là où la concentration de HGF était élevée, la tension moyenne dans les îles a graduellement diminué de 230 pascals à 100 pascals sur 10 heures, comme indiqué précédemment.
Là où la concentration de HGF était élevée sur la moitié gauche et faible sur la moitié droite de l’île, la tension moyenne a été maintenue autour de 150 pascals. Remplir le canal microfluidique doit être doux. Il est important d’éliminer les bulles piégées dans le canal tout en ne perturbant pas les îlots de microcell cellules mères.
En utilisant ce système intégré, on peut l’étudier comment le collectif cellulaire réagit mécaniquement à divers gradients chimiques, tels que les attracteurs de chimio ou les facteurs de croissance. Cette plate-forme nous aidera à explorer davantage la mécanique de la migration cellulaire collective sous gradients chimiques, qui est la clé pour comprendre la régénération, la métastase du cancer et le développement.
