Ce protocole permet de vérifier l’existence de Wolbachia dans les cellules, ce qui est la base de la compréhension de l’interaction entre Wolbachia et son hôte. Dans ce protocole, quatre méthodes ont été utilisées pour détecter avec succès l’infection intracellulaire à Wolbachia, ce qui a corroboré et amélioré la précision de la détection de l’infection à Wolbachia des cellules. La démonstration de la procédure sera assurée par Qiuqiu Xiao, un étudiant de troisième cycle du Key Laboratory of Modern Pathogen Biology and Characteristics.
Commencez par observer les cellules Aa23 et Aa23-T non colorées à un grossissement de 100x à l’aide de la microscopie optique. Cultivez les cellules pendant cinq à sept jours pour atteindre 70 à 80% de confluence par flacon. À l’aide d’une pipette, transférer 1 mL du milieu de culture dans un tube de microcentrifugation.
Centrifuger à 100 RCF pendant cinq minutes pour récolter les cellules. Retirez le surnageant et conservez la pastille de cellule résultante à moins 20 degrés Celsius. Cultivez les cellules pendant cinq à sept jours pour atteindre une confluence de 90 à 100 % par flacon.
Remettre en suspension les granulés dans 0,40 mL de PBS et transférer 50 microlitres de cette solution dans un tube de microcentrifugeuse. Ajouter cinq microlitres de 20 mg/mL de protéinase K et incuber à 55 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, incubez les tubes à 99 degrés Celsius pendant 15 minutes pour obtenir l’ADN brut et le stocker à moins 20 degrés Celsius.
Pour effectuer la PCR, préparez un mélange réactionnel total de 20 microlitres et définissez les conditions de PCR comme décrit dans le manuscrit textuel. Détectez l’ADN sur un gel d’agarose à 1% à l’aide d’un imageur de gel. Effectuez une amplification PCR quantitative à l’aide de TB Green dans un système de PCR en temps réel et enregistrez les résultats de chaque réaction.
Analysez l’ADN dans un volume de réaction total de 20 microlitres et définissez les conditions quantitatives de PCR décrites dans le manuscrit textuel. Calculez le nombre de copies de gènes WSP et RPS6 dans les cellules selon la courbe standard établie. Calculez ensuite la densité relative de Wolbachia par le nombre de copies de wsp/RPS6.
Analysez les données à l’aide d’un test t d’échantillons indépendants. Ajouter 200 microlitres de tampon de lyse à la pastille cellulaire et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifuger les lysats à 12 000 RCF pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le surnageant.
Analyser la concentration de wsp du surnageant à l’aide d’un kit de dosage de protéine bCA, en suivant les instructions du fabricant. Chargez des quantités égales de protéines sur un gel SDS-PAGE à 15%. Transférer la protéine dans les membranes de nitrocellulose et bloquer les membranes avec du lait écrémé à 5% pendant deux heures à température ambiante.
Ensuite, lavez les membranes trois fois avec TBST. Incuber les membranes pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec 100 microlitres d’anticorps polyclonaux anti-wsp préparés en diluant l’anticorps primaire avec du lait écrémé à 5%. Lavez l’anticorps primaire trois fois avec TBST.
Ajouter 100 microlitres d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort aux membranes et l’incuber sur un agitateur pendant une heure à température ambiante. Lavez les membranes trois fois avec TBST et mélangez 20 microlitres de solution A et 20 microlitres de solution B dans le kit de détection de chimiluminescence dans un rapport de un à un. Plongez simultanément toute la membrane dans la solution de luminescence et observez les signaux à l’aide d’un système d’imagerie multifonctionnel.
Sur une boîte de Petri confocale laser, incuber les cellules Aa23 et Aa23-T pendant trois à quatre jours à 28 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone atmosphérique. Lorsque la cellule atteint 60 à 70% de confluence, lavez les cellules trois fois avec PBS. Fixez les cellules dans un mL de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.
Lavez les cellules fixes à l’aide de PBST pendant cinq minutes et lavez les cellules deux fois avec PBS. Incuber la boîte de Petri dans un mL d’albumine sérique bovine à 3% pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ajouter 100 microlitres d’anticorps polyclonaux anti-wsp de souris et de sérum de souris aux lames et l’incuber pendant la nuit dans une boîte humide à quatre degrés Celsius.
Retirez la boîte de Petri de la boîte humide et remettez-la à température ambiante. Lavez-les trois fois avec pbS et retirez le PBS. Protégez les procédures suivantes de la lumière.
Incuber la boîte de Petri avec 100 microlitres d’un anticorps anti-souris de chèvre conjugué Alexa Fluor 488 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Incuber l’échantillon de boîte de Petri avec 50 microlitres de DAPI dilués dans du PBS à 10 microgrammes/mL à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis les laver trois fois avec du PBS. Observez l’immunocoloration au microscope confocal.
Avant de détecter Wolbachia, les cellules Aa23 et Aa23-T ont été observées au microscope optique pour déterminer les différences morphologiques entre les deux lignées cellulaires. Les cellules Aa23 et AA23-T avaient au moins deux morphologies cellulaires, mais aucune différence morphologique apparente n’a été observée entre les deux types de cellules. En utilisant les amorces diagnostiques 81F/691R, une amplification positive du gène Wolbachia wsp a été détectée dans les cellules Aa23 mais pas dans les cellules Aa23-T.
L’analyse de la densité de Wolbachia dans les lignées cellulaires a montré un rapport wsp/rps6 de 2,4 dans les cellules Aa23 mais pas de Wolbachia dans les cellules Aa23-T. L’analyse par transfert Western d’extraits de protéines a montré un fort signal wsp pour Aa23, mais aucun signal n’a été détecté pour Aa23-T. Le test d’immunofluorescence indirecte a détecté la protéine wsp dans les cellules Aa23, tandis que seul l’ADN coloré DAPI a été détecté dans les cellules Aa23-T.
S’assurer que les flacons de culture sont incubés à 28 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone atmosphérique pendant cinq à sept jours. Cette procédure peut être suivie par la microscopie électronique où il faut accorder une attention particulière à la préparation et au sectionnement des échantillons. Les quatre méthodes expérimentales utilisées dans cette étude ont confirmé la précision de la détection de l’infection à Wolbachia dans les cellules, qui est également applicable à d’autres types de cellules et de tissus.
