يساعد هذا البروتوكول على التحقق من وجود Wolbachia في الخلايا ، وهو أساس فهم التفاعل بين Wolbachia ومضيفها. في هذا البروتوكول ، تم استخدام أربع طرق للكشف بنجاح عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا ، والتي أكدت وحسنت دقة الكشف عن عدوى Wolbachia للخلايا. سيوضح الإجراء Qiuqiu Xiao ، وهو خريج من المختبر الرئيسي لبيولوجيا مسببات الأمراض الحديثة وخصائصها.
ابدأ بمراقبة خلايا Aa23 و Aa23-T غير الملطخة عند تكبير 100x باستخدام المجهر الضوئي. استزرع الخلايا لمدة خمسة إلى سبعة أيام للوصول إلى 70 إلى 80٪ من الالتقاء لكل قارورة. باستخدام ماصة ، انقل 1 مل من وسط الثقافة إلى أنبوب طرد مركزي صغير.
جهاز طرد مركزي في 100 RCF لمدة خمس دقائق لحصاد الخلايا. قم بإزالة السوبرناتانت وتخزين حبيبات الخلايا الناتجة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. استزرع الخلايا لمدة خمسة إلى سبعة أيام للوصول إلى 90 إلى 100٪ التقاء لكل قارورة.
أعد تعليق الكريات في 0.40 مل من PBS وانقل 50 ميكرولتر من هذا المحلول إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق. أضف خمسة ميكرولترات من 20 ملغم / مل بروتين K واحتضنها عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم احتضان الأنابيب عند 99 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للحصول على الحمض النووي الخام وتخزينه عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.
لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، قم بإعداد خليط تفاعل إجمالي من 20 ميكرولتر وقم بتعيين شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في مخطوطة النص. اكتشف الحمض النووي على هلام الأغاروز بنسبة 1٪ باستخدام جهاز تصوير هلام. قم بإجراء تضخيم PCR الكمي باستخدام TB Green في نظام PCR في الوقت الفعلي وسجل نتائج كل تفاعل.
تحليل الحمض النووي في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر وتعيين شروط PCR الكمية كما هو موضح في مخطوطة النص. احسب أرقام نسخ الجينات WSP و RPS6 في الخلايا وفقا للمنحنى القياسي المحدد. ثم احسب الكثافة النسبية ل Wolbachia بواسطة عدد نسخ wsp/RPS6.
تحليل البيانات باستخدام اختبار t عينات مستقل. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى حبيبة الخلية واحتضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي للليزات في 12،000 RCF لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية وشفط supernatant.
قم بتحليل تركيز wsp لل supernatant باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتحميل كميات متساوية من البروتين على جل SDS-PAGE بنسبة 15٪. انقل البروتين إلى أغشية النيتروسليلوز وقم بسد الأغشية بحليب منزوع الدسم بنسبة 5٪ لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
ثم اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST. احتضان الأغشية بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل wsp المحضرة عن طريق تخفيف الجسم المضاد الأساسي بحليب منزوع الدسم بنسبة 5٪. اغسل الجسم المضاد الأساسي ثلاث مرات باستخدام TBST.
أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع بيروكسيديز الفجل إلى الأغشية واحتضنها على شاكر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST وامزج 20 ميكرولتر من المحلول A و 20 ميكرولتر من المحلول B في مجموعة الكشف عن التلألؤ الكيميائي بنسبة واحد إلى واحد. اغمر الغشاء بأكمله في محلول التلألؤ في وقت واحد وراقب الإشارات باستخدام نظام تصوير متعدد الوظائف.
على طبق بتري متحد البؤرة بالليزر ، احتضن خلايا Aa23 و Aa23-T لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام عند 28 درجة مئوية تحت 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي. عندما تصل الخلية إلى 60 إلى 70٪ من الالتقاء ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. إصلاح الخلايا في مل واحد من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
اغسل الخلايا الثابتة باستخدام PBST لمدة خمس دقائق وأعد غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. احتضن طبق بتري في مل واحد من ألبومين مصل البقر بنسبة 3٪ لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للفئران ومصل الفأر إلى الشرائح واحتضنها بين عشية وضحاها في صندوق رطب عند أربع درجات مئوية.
أخرج طبق بتري من الصندوق الرطب وأعده إلى درجة حرارة الغرفة. اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بإزالة PBS. حماية الإجراءات التالية من الضوء.
احتضن طبق بتري مع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للماعز المقترن بالكسا فلور 488 عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. احتضن عينة طبق بتري مع 50 ميكرولتر من DAPI المخفف في PBS إلى 10 ميكروغرام / مل عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. راقب التلطيخ المناعي تحت المجهر البؤري.
قبل اكتشاف Wolbachia ، لوحظت خلايا Aa23 و Aa23-T تحت المجهر الضوئي لتحديد الاختلافات المورفولوجية بين خطي الخلية. كان لدى خلايا Aa23 و AA23-T مورفولوجيا خليتان على الأقل ولكن لم يتم ملاحظة أي اختلافات مورفولوجية واضحة بين نوعي الخلايا. باستخدام الاشعال التشخيصية 81F / 691R ، تم الكشف عن تضخيم إيجابي لجين Wolbachia wsp في خلايا Aa23 ولكن ليس في خلايا Aa23-T.
أظهر تحليل كثافة Wolbachia في خطوط الخلايا نسبة wsp / rps6 من 2.4 في خلايا Aa23 ولكن لا Wolbachia في خلايا Aa23-T. أظهر تحليل اللطخة الغربية لمستخلصات البروتين إشارة wsp قوية ل Aa23 ولكن لم يتم اكتشاف أي إشارة ل Aa23-T. كشف فحص التألق المناعي غير المباشر عن بروتين wsp في خلايا Aa23 ، في حين تم اكتشاف الحمض النووي الملون ب DAPI فقط في خلايا Aa23-T.
تأكد من احتضان قوارير الاستزراع عند 28 درجة مئوية تحت 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي لمدة خمسة إلى سبعة أيام. يمكن اتباع هذا الإجراء بواسطة المجهر الإلكتروني حيث يحتاج المرء إلى إيلاء اهتمام خاص لإعداد العينات وتقسيمها. أكدت الطرق التجريبية الأربع المستخدمة في هذه الدراسة دقة الكشف عن عدوى Wolbachia في الخلايا ، والتي تنطبق أيضا على أنواع أخرى من الخلايا والأنسجة.
