Cette méthode permet de quantifier les changements dans les propriétés physiques de la paroi cellulaire végétale au cours du développement et de relier ces changements microscopiques à la croissance d’un organe entier. Le principal avantage de cette technique est qu’elle n’est pas invasive et qu’elle ne nécessite aucun traitement permettant de quantifier in vivo les propriétés physiques de la paroi cellulaire et d’ajouter une résolution subcellulaire relativement rapide. Pour commencer, étalez une fine couche de colle de silicone dans la boîte de Petri avec un couvercle et laissez-la en l’air pendant 45 secondes.
À l’aide d’une pince à épiler, placez le semis sur la colle et orientez sa direction pour éviter tout contact entre les parties saillantes du plant et le porte-à-faux. Appuyez ensuite doucement sur la racine sur la couche de colle de silicone pour la lier fermement. Laissez-le pendant 45 secondes et ajoutez la solution PBS 1X.
Montez le porte-à-faux standard en nitrure de silicium avec une pointe pyramidale dans le support de sonde AFM pour fluide, et alignez le laser sur le porte-à-faux près de la position de la pointe. Déplacez ensuite la photodiode pour placer le spot laser au centre du détecteur. Calibrer la sensibilité de déviation en effectuant une indentation avec une taille de rampe de 3 micromètres, un taux d’indentation et de rétraction de 0,6 micromètre par seconde et un seuil de déclenchement de 0,5 volts.
Assurez-vous que la sonde n’interagit pas avec l’échantillon et calibrez la constante de ressort du porte-à-faux. À l’aide de l’utilitaire de réglage thermique, cliquez sur calibrer suivi de réglage thermique ou sur l’icône de réglage thermique dans la barre d’outils nanoscope et entrez la température en porte-à-faux. Après avoir sélectionné une gamme de fréquences, cliquez sur le bouton de fluide oscillateur harmonique de l’échantillon.
Ensuite, cliquez sur les données acquises dans le panneau de réglage thermique. Maintenant, ajustez la largeur médiane du filtre à trois. Ajustez la largeur du bac PSD pour réduire le bruit dans les données acquises en faisant la moyenne et définissez des limites d’ajustement autour du premier pic de résonance.
Cliquez sur calculer la constante de ressort K, puis cliquez sur oui dans la fenêtre contextuelle, en demandant à l’utilisateur si elle souhaite utiliser cette valeur. À l’aide du microscope optique inversé à un grossissement de l’oculaire de 10, 20 et 40 fois, positionner la sonde AFM sur la surface de la quatrième cellule épidermique allongée de la racine primaire en veillant à la positionner au centre de la cellule. Avec la valeur de la constante de ressort précédemment calculée, on obtient des courbes de force avec une taille de rampe de 3 micromètres, un seuil de déclenchement de 11 nanonewtons et un taux d’indentation et de rétraction de 0,6 micromètre par seconde en des points sélectionnés.
Obtenir des courbes de force à partir de trois cellules par racine pour chaque traitement et capturer au moins 150 courbes de force pour chaque racine. Ce graphique montre un résultat attendu lorsqu’une expérience d’indentation de force est menée sur des échantillons vivants positionnés au centre de la cellule de la zone d’élongation radiculaire. Lorsque la pointe AFM commence à indenter, la surface de la paroi cellulaire, la force commence à augmenter en raison de l’opposition de la paroi cellulaire à la diffamation.
L’augmentation de la force se poursuit jusqu’à ce que la valeur maximale de la force soit atteinte. Après ce point, la partie déchargement de l’indentation commence. La force augmente suivant une parabole dans la partie indentation, ce qui est important pour ajuster chaque courbe au modèle de prédiction pour les pénétrateurs pyramidaux utilisés pour les calculs.
En tant que paramètre approprié, la position du point de contact doit correspondre à la surface de la paroi cellulaire avant l’indentation et est considérée comme l’origine du déplacement de la pointe AFM. Courbes de force dans lesquelles il est impossible de détecter le point de contact avant l’indentation doivent être écartées. En outre, la courbe de chargement et de déchargement de l’expérience d’indentation de la force doit être dépourvue de bruit.
Après ajustement de chaque courbe de force au modèle, on a obtenu des histogrammes qui ont montré la distribution de la fréquence des valeurs obtenues du module de Young apparent. Cet histogramme montre la fréquence obtenue avec un ensemble de 201 indentations réussies sur neuf cellules différentes de trois plantes différentes de Columbia Zero cultivées dans des conditions de contrôle. L’indentation pourrait être difficile pour certains génotypes en raison de la morphologie de la racine.
Par exemple, le double mutant TTL 1 PRC 1-1 s’est développé dans un stress osmotique sévère. Ces histogrammes montrent la distribution de probabilité des valeurs obtenues du module de Young apparent à partir de neuf cellules différentes. Seul l’histogramme H qui correspond à une cellule pourrait être ajusté à une distribution gaussienne.
Le métal présenté ici pourrait être combiné avec d’autres techniques telles que des études de vitesse de croissance ou l’analyse de la composition chimique de la paroi cellulaire. Ces autres techniques compléteront davantage les informations pour comprendre comment la composition chimique sur les propriétés physiques de la paroi cellulaire affecte la croissance d’un organe.
