Nous remercions le Prof. Geoffrey Wasteneys, de l&#39;Université de la Colombie-Britannique, pour la RFP-TUB6 exprimant les graines et un critique anonyme pour les corrections utiles. Nous sommes reconnaissants au Prof. Hugh Dickinson pour nous avoir informé de l&#39;utilisation du film de cellulose comme support mécanique et de John Baker pour la photographie. Ce travail a été soutenu par des bourses de recherche BBSRC BB / G013993 / 1 et BB / D004055 / 1 à IM, et un prix de formation au doctorat BBSRC et Clarendon Scholarship à CK

1. Création de la Chambre <ol><li> À l&#39;aide d&#39;un coupe-verre, découpez des bandes de 3 mm de largeur à partir de la fin d&#39;une glissière de microscope de 1 mm d&#39;épaisseur. À l&#39;aide d&#39;un super-colle cyanoacrylate ou d&#39;un ruban adhésif double face, collez ces bandes de verre à environ 45 mm d&#39;écart sur la largeur d&#39;une deuxième glissière de microscope ( Figure 1A ). Une glissière par chambre est nécessaire, plus des glissières supplémentaires pour verser des dalles de gélose (une glissière produira 2-3 dalles de gélose). Les diapositives peuvent être réutilisées. </li><li> Entre les bandes de verre, formez un joint d&#39;étanchéité identique à partir de gomme poly (diméthylsiloxane) perméable aux gaz. Placez une boule de gomme de poly (diméthylsiloxane) sur la glissière ( Figure 1B ), mouillez une deuxième glissière avec une petite quantité d&#39;éthanol 100% absolu et aplatiez la boule de gomme de poly (diméthylsiloxane) avec la deuxième glissière jusqu&#39;à ce qu&#39;elle atteigne la hauteur Des bandes de verre ( figure 1C ). <ol><li> Si nécessaire, couper l&#39;excès de poly (centime d&#39;urgence)Thylsiloxane) avec une lame de rasoir et un aplatissement répété. </li></ol></li><li> À l&#39;aide d&#39;une fraise appropriée ou d&#39;une lame de rasoir humidifiée dans de l&#39;éthanol absolu, enlever la partie intérieure de la gomme de poly (diméthylsiloxane) pour créer la cavité qui tiendra plus tard la dalle de plomb et de gélose ( figure 1D ). </li><li> Coupez soigneusement le gel avec une lame de rasoir pour créer un joint d&#39;étanchéité avec une épaisseur de paroi finale d&#39;environ 2 mm ( Figure 1E ). La perméabilité des gaz à travers une barrière en poly (diméthylsilaxane) est indépendante des épaisseurs supérieures à 50 μm 11 . </li></ol> 2. Création de la plaque de milieu de croissance solidement agarifiée <ol><li> Sur une glissière à microscopie avec deux bandes de verre, placez une lamelle (22 mm x 50 mm) de sorte qu&#39;elle repose sur les deux bandes de verre. </li><li> Pipeter le milieu de croissance Murashige et Skoog à demi-résistance fondu contenant 1% p / v de saccharose et 1,5% p / v d&#39;agar (½ MS) dans l&#39;espace résultantDessous de la lamelle jusqu&#39;à ce que ce dernier soit complètement rempli (environ 1 ml de volume total) et laissez jusqu&#39;à ce que la gélose soit réglée (environ 5 minutes). Note: Les composés pharmacologiques peuvent être administrés par la dalle de gélose en ajoutant des concentrations appropriées au milieu liquide avant que la dalle ne soit versée. Ceci a été testé avec succès pour la dexaméthasone 12 , l&#39;isoxabène, le 2,6-dichlorobenzonitrile (DCB), l&#39;oryzaline et la latrunculine B. </li></ol> 3 . Fin de la configuration de la chambre <ol><li> Air équilibré PFD en secouant un petit volume de PFD dans un tube 7 . Ajouter une petite quantité (environ 200 μl) de PFD équilibrée à l&#39;air dans le puits du joint de gel, mais ne pas remplir complètement la chambre. Cette PFD aidera à éviter le piégeage des bulles d&#39;air sous la dalle de gélose lorsqu&#39;elle est placée dans la chambre. </li><li> Retirez le lamelle de la plaque de gélose (à l&#39;étape 2.2 ci-dessus) et utilisez une lame de rasoir pour couper une partie deTaille et forme sier. Ensuite, placez-le dans le puit du joint de gel ( Figure 1F ). Il devrait y avoir un écart de 2-4 mm sur le joint tout autour. </li><li> Remplissez complètement la chambre avec un PFD équilibré à l&#39;air. </li><li> Placez un ou plusieurs plants de A. thaliana (jusqu&#39;à 3 plants pour une imagerie de plus de 2 à 3 jours) sur la dalle de gélose avec les cotylédons et l&#39;hypocotyle suspendu au bord, flottant dans la PFD ( Figure 1G ). </li><li> Pour obtenir des semis, stériliser des graines avec de l&#39;éthanol à 70%, planter sur milieu ½ MS complété par 1% de saccharose et 0,8% d&#39;agar, stratifier pendant 2 à 4 jours à 4 ° C et pousser sur des plaques orientées verticalement à 22 ° C dans un 16 H lumière / 8 h régime sombre. Pour imaginer les racines latérales, cultiver les plantes pendant 7 à 10 jours avant de transférer dans les chambres d&#39;imagerie. </li><li> Pour fermer la chambre, appliquez une lamelle adaptée à l&#39;optique de l&#39;objectif, en appuyant doucement sur le bord d&#39;une glissière en verre jusqu&#39;à ce que la lamelleRepose sur les deux bandes de verre ( Figure 1H ). </li><li> Fixez la lamelle avec des bandes de ruban chirurgical micropore de 1,25 cm de largeur coupées en longueur à chaque extrémité si désiré ( Figure 1I ). Permettre au spécimen de s&#39;installer pendant environ 30 minutes avant l&#39;imagerie. Cela minimise le mouvement de l&#39;échantillon lors de l&#39;imagerie. </li><li> Effectuer l&#39;imagerie avec un microscope vertical pour maintenir un substrat contrôlé pour la croissance. Utilisez les objectifs 20X / 0.7NA ou 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

La méthode présentée ici est une stratégie simple pour l&#39;imagerie confocale haute résolution du développement de racines latérales pendant deux ou trois jours. Pour des périodes allant jusqu&#39;à 48 h, aucun effet néfaste du système d&#39;imagerie sur le développement de la racine latérale n&#39;a été observé. Après 48 h, la croissance moyenne des racines latérales a commencé à ralentir, même si un sous-ensemble important des racines (37%) a continué de croître à des taux comparables à la croissance moyenne des racines sur les plaques. Par conséquent, grâce à l&#39;imagerie, un nombre suffisamment élevé de racines, les racines dont la croissance ralentit après 48 h peuvent être exclues. Les tests systématiques des chambres d&#39;imagerie n&#39;ont pas été effectués pour des périodes supérieures à 72 h, mais des stratégies alternatives sont recommandées si des périodes d&#39;imagerie étendues sont souhaitées. Les chambres d&#39;imagerie peuvent être laissées au stade du microscope en permanence, si des conditions environnementales appropriées sont fournies ou supprimées dans une installation de croissance et périodiquement retournées au microscope. Cela permet de créer de nombreuses chambres en parallèle. &lt;/ P&gt; Un avantage des chambres décrites ici est que les racines latérales sont fixées dans leur position et peuvent être imagées à l&#39;aide de lentilles d&#39;immersion à eau haute résolution. La stabilité spatiale dépend de manière critique de la concentration en gélose utilisée dans la brame de gant de support. Initialement, on a testé une gamme de concentrations différentes de 0,8% d&#39;agar à 2% d&#39;agar, ce qui révèle que les concentrations élevées dans cette gamme ont localisé des racines fixes dans l&#39;espace, mais la croissance des racines a ralenti rapidement et certaines racines ont montré des signes de contraintes mécaniques, y compris une réduction de l&#39;allongement cellulaire. En revanche, les faibles concentrations d&#39;agar n&#39;ont pas fourni le support requis et les racines dérivées dans x, y et z pendant l&#39;imagerie. La dalle de gélose optimale de 1,5% corrige la position de l&#39;échantillon sans effets mécaniques défavorables. Dans ces conditions, après la décantation dans les 30 premières minutes environ, les racines sont stables pendant plusieurs heures, ce qui permet une acquisition de données pendant la nuit. Lors de l&#39;acquisition de données 4D, les plages de pile z étaient typiquement bRayonné de 5 à 10 μm supplémentaires, mais il s&#39;agissait principalement de supporter une croissance hors-plan des racines latérales plutôt que de la dérive z ou de l&#39;oscillation. Bien que la concentration en gélose standard offre une certaine résistance à la pénétration, les racines croit gravitropiquement finiront par pénétrer dans la gélose. Cependant, grâce à une modification mineure de la chambre d&#39;imagerie, la croissance des racines pourrait être maintenue parallèlement à la lamelle, ce qui permet d&#39;imaginer des racines latérales plus anciennes et des racines primaires. En outre, la chambre d&#39;imagerie basique pourrait facilement être personnalisée pour les hypocotyles. Les hypocotyls flottent plus librement dans ce système, de sorte que le support de l&#39;axe z pour l&#39;acquisition de l&#39;image a été augmenté habituellement à environ 20 μm. Dans cette étude, un microscope vertical a été utilisé partout, ce qui a permis de contrôler les propriétés du substrat. La chambre d&#39;imagerie peut être adaptable aux configurations de microscope inversé, mais l&#39;influence dépendante du temps de la lamelle rigide sur les organes d&#39;interception devra être évaluée. </p&gt; Littlejohn et ses collègues ont souligné que le PFD lui-même ne dissout pas facilement les molécules biologiques, ce qui signifie qu&#39;il ne peut pas être utilisé directement pour la distribution de composés pharmacologiques 7 . Ce problème a été surmonté en fournissant de tels composés à travers la dalle de milieu de croissance solidifié sur laquelle repose la dalle de gélose. Alors que les systèmes de perfusion resteront la méthode de choix pour les expériences de lavage, la chambre d&#39;imagerie a été utilisée avec succès pour l&#39;administration de dexaméthasone 12 et d&#39;autres composés. Une note, bien que cet article soit en préparation von Wagenheim et ses collègues 18 ont décrit une chambre pour l&#39;imagerie du développement de la racine latérale à l&#39;aide d&#39;une microscopie à la lumière.

Pour étudier les processus cellulaires et subcellulaires qui sous-tendent le développement de l&#39;usine, il existe une demande croissante de stratégies d&#39;imagerie à long terme à haute résolution à long terme. Un défi majeur dans de telles expériences d&#39;imagerie est le maintien de conditions physiologiques, y compris un échange gazeux suffisant, plus une réserve d&#39;eau et de nutriments 1 , 2 , 3 . Pour utiliser les objectifs avec des ouvertures numériques élevées pour une résolution optique optimale, les spécimens doivent être positionnés à proximité et orientés parallèlement à la lamelle. Le mouvement dans les directions x, y et z devrait idéalement être minimal lors de l&#39;imagerie. Alors que les semis sont souvent montés dans une solution aqueuse ou aqueuse pour une imagerie à court terme, l&#39;eau a une faible capacité à dissoudre CO 2 et O 2 (1,54 mg / mL et 0,04 mg / mL, respectivement à 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , ce qui rendIl est inadapté à des expériences prolongées. Les systèmes de perfusion qui maintiennent des niveaux constants d&#39;oxygène et de nutriments sont une solution à ce problème et ont été développés à la fois pour la microscopie de balayage laser confocal (CLSM) 1 , 2 , 3 et la microscopie à lumière (LSM) 5 . Des systèmes comme le RootChip 2 et le RootArray 3 ont été conçus spécifiquement pour l&#39;imagerie temporelle de développement de racines et impliquent la germination de graines dans un dispositif multi-spécimen personnalisé. Ces dispositions assurent une perturbation mécanique minimale et sont conçues pour l&#39;analyse parallèle de semences multiples, mais ne sont pas optimisées pour l&#39;imagerie des structures subcellulaires. Calder et ses collègues ont conçu une chambre d&#39;imagerie à perfusion plus compliquée optimisée pour l&#39;imagerie de structures subcellulaires dans lesquelles l&#39;échantillon est maintenu en position par un maillagePour permettre l&#39;utilisation de lentilles d&#39;immersion à grand grossissement 1 . Voici une solution alternative et simple à ce problème qui ne repose pas sur les systèmes de perfusion, mais utilise la perfluorodécaline (PFD), un perfluorocarbone qui a récemment gagné en popularité en tant que support de base pour l&#39;image d&#39; Arabidopsis 6 , 7 , 8 . Dans de telles applications, la capacité élevée de PFD pour la dissolution de CO 2 et O 2 (1,9 g / mL pour O 2 dans PFD par rapport à 0,04 mg / mL dans l&#39;eau) 9 permet l&#39;échange gazeux par le tissu immergé. En outre, le PFD n&#39;est pas fluorescent et son indice de réfraction (1.313) est comparable à celui de l&#39;eau (1.333) et est plus proche de celui du cytosol (~ 1.4) que l&#39;air (1.000) 6 . On a signalé que les hydrocarbures perflucides avaient un effet physiologique minimal sur une variété de plantes et de végétauxProblèmes 6 , avec des graines de radis gerrissant facilement lorsqu&#39;elles sont immergées dans la PFD et présentent une croissance et un développement normaux pendant au moins deux jours complets lorsqu&#39;ils sont alimentés en eau 10 . Des observations similaires ont été faites pour germer des graines d&#39; Arabidopsis 6 . Basé sur la diffusion estimée de Raman pour imaginer directement la distribution de PFD dans les tissus de feuilles d&#39; Arabidopsis après l&#39;infiltration, Littlejohn et ses collègues concluent que le PFD n&#39;est probablement pas absorbé par les cellules vivantes 8 . Le PFD a déjà été utilisé principalement pour l&#39;image des tissus aériens, où il augmente considérablement la profondeur d&#39;imagerie car il infiltrait facilement les espaces d&#39;air en raison de sa faible tension superficielle 6 . Ici, le PFD est adopté pour l&#39;imagerie confocale à long terme du développement de racines latérales. Dans cette configuration, une ou plusieurs plants sont placés sur une plaque de milieu de croissance solidifiée avec de l&#39;agar et immergée dans PFD. La PFD permet à gDans la chambre d&#39;imagerie, empêchant l&#39;anoxie. Le PFD est très volatil, de sorte qu&#39;il est retenu par un joint d&#39;étanchéité de gomme de poly (diméthylsiloxane) qui a également une perméabilité élevée aux gaz (1,5 x 10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 pour le CO 2 ) 11 . Les nutriments et l&#39;eau sont fournis par la dalle de milieu solidifié avec de l&#39;agar. En même temps, cette dalle de gélose appuie doucement la racine contre la lamelle, fixant ainsi sa position relative dans la chambre d&#39;imagerie et permettant l&#39;utilisation de lentilles d&#39;immersion à eau haute résolution. En outre, la dalle de gélose peut être utilisée pour administrer une gamme de traitements pharmacologiques, y compris la dexaméthasone, l&#39;oryzaline et l&#39;isoxabène. Les chambres d&#39;imagerie peuvent être assemblées en grand nombre à partir de lames de microscopie standard en utilisant un équipement minimal. Les chambres d&#39;imagerie ont été développées et caractérisées pour étudier le développement de la racine latérale, mais adaptées à l&#39;imagerie d&#39;autres organes de semis tels que des conseils de racines primaires etHypocotyls.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) gum&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td><td>Item # 132700</td><td>Carolina Observation Gel</td></tr><tr><td>Cavity Microscope Slides</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&amp;nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>Any &#039;super-glue&#039; suitable for glass will probably suffice</td></tr><tr><td>Cellulosic cellophane membrane</td><td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td><td></td><td>325P cellulose film; 80 mm disc</td></tr></tbody></table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

Plusieurs aspects du développement des plantes, comme la morphogenèse de la racine latérale, se produisent sur plusieurs périodes de temps. Pour étudier les processus sous-cellulaires et subcellulaires sous-jacents, des stratégies de microscopie temporelle à haute résolution qui préservent les conditions physiologiques sont nécessaires. Les tissus végétaux doivent avoir un approvisionnement en nutriments et en eau adéquat avec un échange gazeux soutenu, mais, lorsqu&#39;ils sont immergés et immobilisés sous une lamelle, ils sont particulièrement sensibles à l&#39;anoxie. Une stratégie qui a été utilisée avec succès est l&#39;utilisation d&#39;un système de perfusion pour maintenir un apport constant d&#39;oxygène et de nutriments. Cependant, de tels arrangements peuvent être compliqués, encombrants et nécessitent un équipement spécialisé. Présenté ici, il existe une stratégie alternative pour un système d&#39;imagerie simple utilisant la perfluorodécaline comme milieu d&#39;immersion. Ce système est facile à installer, nécessite un équipement minimal et est facilement monté sur une étape de microscope, permettant de configurer et d&#39;imaginer plusieurs chambres d&#39;imagerie au pairAllel. Dans ce système, les taux de croissance de la racine latérale sont indiscernables des taux de croissance dans des conditions standard sur les plaques d&#39;agar pendant les deux premiers jours, et la croissance de la racine latérale se poursuit à des taux réduits pendant au moins un autre jour. Les tissus végétaux sont alimentés en nutriments par une dalle de gélose qui peut également être utilisée pour administrer une gamme de composés pharmacologiques. Le système a été établi pour surveiller le développement de la racine latérale, mais est facilement adaptable à l&#39;image d&#39;autres organes végétaux tels que les hypocotyles et les racines primaires.

Les racines latérales se développent à des taux physiologiques dans les chambres d&#39;imagerie. Les longueurs de racines latérales des plantes dans les chambres d&#39;imagerie ont été mesurées à intervalles horaires ( Figure 2A , gauche, Film 1, n = 23) et les taux de croissance ont été comparés à ceux des racines latérales cultivées sur des plaques de Petri standard contenant le même milieu agar-solidifié ( Figure 2A , à droite, film 2, n = 23). Les taux de croissance peuvent varier considérablement entre les racines latérales, la longueur de la racine étant un facteur déterminant en raison des zones de croissance et de prolifération de plus en plus longues 13 . Par conséquent, des ensembles de racines latérales ont été sélectionnés pour représenter des racines de différentes longueurs initiales (allant de 50 μm à 1150 μm) à la fois dans la chambre d&#39;imagerie et dans la plaque de gélose. Longueur moyenne de la racine latérale au début de l&#39;expérienceÉtait similaire dans chaque ensemble (439 et 442 μm pour les chambres et les plaques d&#39;imagerie, respectivement). Dans l&#39;intervalle de temps analysé de 27 h, la croissance de la racine latérale était approximativement linéaire dans les chambres d&#39;imagerie et sur les plaques, avec un taux de croissance moyen de 52 μm / h (R 2 = 0,997) sur les plaques et de 51 μm / h dans les chambres d&#39;imagerie ( R 2 = 0,993) ( figure 2B ). Les taux de croissance des racines latérales individuelles sont très variables à la fois sur les plaques et dans les chambres d&#39;imagerie ( Figure 2C ), allant de 17 μm / h à 82 μm / h dans les chambres d&#39;imagerie et de 13 μm / h à 87 μm / h sur les plaques. Alors que les taux de croissance augmentaient généralement avec la longueur de la racine, les taux de croissance variaient encore sensiblement entre des racines de longueur similaire, mais la variance était similaire dans les chambres d&#39;imagerie et sur les plaques. Les racines latérales prolifèrent dans les chambres d&#39;imagerie et peuvent être imagées à l&#39;aide deGh objectifs d&#39;ouverture numérique. Les racines latérales qui coexistent le marqueur de la membrane plasma NPSN12-YFP 14 et le marqueur des microtubules UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 ont été imagés par CLSM 10 à des intervalles de 1 h pour documenter le comportement des microtubules lors de la prolifération cellulaire dans les chambres d&#39;imagerie ( Figure 2D , film 3). Dans ces chambres, les racines latérales étaient très stables dans leur position sur les axes x, y et z, ce qui permet d&#39;acquérir des piles confocales continues en plusieurs heures. Les cellules méristématiques proliféraient constamment, comme en témoigne la formation de bandes préprophasiques ( figure 2D , flèches vertes), les broches mitotiques ( figure 2D , flèches blanches) et les phragmoplastes ( figure 2D , flèches bleues). Comme pour les semis sur des assiettes de Petri,Cellules de racine complètement allongées dans les cheveux radiculaires initiés par les chambres d&#39;imagerie ( Figure 2A , Figure 2D , têtes de flèche), indiquant en outre que le développement s&#39;est déroulé comme prévu dans les chambres d&#39;imagerie. Pour fournir un large champ de vision, les images de la figure 2D ont été obtenues avec un objectif de 20x / 0.7 NA. Il a également été possible d&#39;obtenir des images haute résolution de racines latérales en utilisant un objectif d&#39;immersion en eau NA 63x / 1,2 NA à grande ouverture numérique ( Figure 2E ). La croissance latérale de la racine est maintenue dans les chambres d&#39;imagerie jusqu&#39;à trois jours. Pour déterminer combien de temps les chambres d&#39;imagerie pourraient soutenir la croissance de la racine latérale à des taux physiologiques, la longueur de racine latérale dans les chambres d&#39;imagerie (n = 27) et sur les plaques (n = 33) a été quantifiée à 0 h, 24 h, 48 h et 72 h. Les racines choSen étaient inférieurs à 200 μm à 0 h, avec une longueur de racine latérale moyenne de 117 μm dans les chambres d&#39;imagerie et 121 μm sur les plaques. Comme les racines plus courtes se développent plus lentement en moyenne ( figure 2C ), elles se sont développées moins souvent sur le bord de la plaque de gélose et ont été plus faciles à imaginer. La croissance moyenne de toutes les racines latérales n&#39;a pas été significativement différente dans les chambres d&#39;imagerie par rapport aux plaques de Petri dans les premières 48 h ( figure 3A ). Cependant, la croissance moyenne a été considérablement réduite entre 48 h et 72 h ( figure 3A ). Alors que les taux de croissance semblent généralement ralentir dans les chambres d&#39;imagerie après 48 h, les taux de croissance entre les individus restent très variables ( figure 3B , 3C ), ce qui signifie qu&#39;il existe un sous-ensemble important de racines latérales qui se développent à des taux comparables sur les plaques et dans les chambres Sur la période de croissance complète de 72 h. 23 des 33 racines latérales cultivéesSur les plaques (69,7%) atteignent une longueur dans un écart type de la longueur moyenne à 72 h (entre 927 et 3,163 μm, figure 3B , rouge). 10 des 27 (37,0%) des racines latérales dans les chambres d&#39;imagerie atteignent une longueur dans cet intervalle ( Figure 3B , rouge). Les chambres d&#39;imagerie peuvent facilement être adaptées pour les racines latérales plus anciennes, les racines primaires et les hypocotyles . Une des limites de la conception de la chambre d&#39;imagerie originale était que, bien que la dalle de gélose rigide fournissait une certaine résistance mécanique, les racines gravitropiquement croisées pénétraient finalement dans la dalle de gélose, ce qui entraînait une perte de qualité d&#39;image ( figure 4B ) et une croissance supérieure à la distance de travail de NA élevée Les lentilles, même l&#39;objectif relativement long de travail (0,3 mm) 63X / 1,3 NA CS2. Les jeunes racines latérales manquent de statolithLes cellules de columelles requises pour le gravitropisme 17 , elles ont d&#39;abord augmenté parallèlement à la lamelle dans les chambres d&#39;imagerie ( Figure 2E ). À mesure qu&#39;ils se développent et que les columelles et les statolithes se forment, les racines latérales présentent un gravitropisme positif croissant, tandis que les racines primaires présentent une forte réponse gravitrice à partir de la germination. Cela restreint à quelques heures la période pendant laquelle les racines primaires peuvent être imagées et limite sérieusement la longueur de départ des racines latérales qui peuvent être imagées en continu pendant 48 h ou plus. Pour surmonter cette limitation, la chambre a été modifiée de telle sorte que la croissance soit maintenue parallèlement à la lamelle coulée par une membrane de cellophane cellulosique qui agit comme une barrière de pénétration à la surface de la dalle de gélose ( figure 4A ). Les premières tentatives utilisant une dalle de gélose à 1,5% ont entraîné une réduction de la croissance des racines dans les 24 premières heures, peut-être par des contraintes mécaniques. Des concentrations d&#39;agar plus faibles dans la dalle ont été testées etD il a été constaté que dans les chambres avec une dalle contenant 0,8% d&#39;agar et de film de cellulose, les taux de croissance des racines latérales jeunes ne différaient pas de manière significative par rapport aux taux de croissance dans les chambres conventionnelles pendant les 48 premières heures. Pendant 0-24 h, la croissance moyenne de la racine dans les chambres de cellulose et les chambres conventionnelles était de 242 μm et 262 μm respectivement (p = 0.78 T-Test de l&#39;élève) et 24-48 h était de 330 μm et 355 μm 1 respectivement (p = 0,67 Student&#39;s T-test); N = 12 et n = 11, respectivement. Cet arrangement empêchait efficacement les racines latérales de s&#39;éloigner de la lamelle, de la gélose et permettait également l&#39;imagerie des racines primaires jusqu&#39;à 48 h ( figure 4C ). Pour tester si les chambres d&#39;imagerie pouvaient être adaptées pour des organes autres que des racines, on choisit les hypocotyls Arabidopsis. Les hypocotyls sont sensiblement plus épais que les racines, alors dans la chambre d&#39;imagerie classique, le plus haut cLes coups ont été pressés contre la lamelle, ce qui a entraîné une déformation. Une autre conception a donc été développée à l&#39;aide de diapositives à cavité contenant une dépression ovale dans leur centre ( Figure 4D ). Dans cette configuration, une plaque d&#39;agar de 1 mm d&#39;épaisseur (préparée comme au 2.2 ci-dessus) a été positionnée avec une extrémité faisant saillie de quelques mm dans la cavité coulissante ( figure 4D ). Les hypocotyls ont été positionnés au-dessus de la cavité dans la glissière alors que la racine était positionnée au-dessus de la partie horizontale. Cela a assuré que le plant a été fixé dans l&#39;espace par la racine, mais l&#39;hypocotyle n&#39;a pas été écrasé. Bien que les taux de croissance dans les chambres par rapport aux plaques n&#39;aient pas été systématiquement quantifiés, les hypocotyles dans les chambres d&#39;imagerie présentaient la vague de croissance longitudinale bien décrite migrant l&#39;hypocotyle ( Figure 4E , 4F ) 16 . <img alt="Figure 1"Class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1 : Assemblage d&#39;une chambre d&#39;imagerie. Tous les détails sont décrits dans le texte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" /> Figure 2 : Les racines latérales poussent dans des conditions physiologiques dans les chambres d&#39;imagerie. ( A ) Développement de la racine latérale d&#39;Arabidopsis dans une chambre d&#39;imagerie (gauche) et sur une plaque (à droite) sur 25 h (lumière constante, incubation horizontale, imagerie simultanée). Barres d&#39;échelle = 200 μm. ( B ) Plot montrant des longueurs de racines latérales supérieures à 27 h (mesurées en 1 h), de racines latérales comme indiqué dans ( A ). IndividRacines tracées en gris (n = 23 pour plaques et chambres d&#39;imagerie), longueur moyenne en cercles rouges. Barres d&#39;erreur = 1 SD. La ligne rouge est ajustée linéairement par des longueurs moyennes. ( C ) Plot montrant le taux de croissance moyen pour toutes les racines latérales indiquées en ( B ) par rapport à leur longueur initiale. ( D ) Projections d&#39;intensité maximale des piles confocales 3D acquises à partir de racines latérales exprimant NPSN12-YFP et RFP-TUB6 à des points de temps consécutifs. Inser: grossissement de la zone en boîte. Flèches vertes: bandes préprophasiques; Flèches blanches: broches mitotiques; Flèches bleues: phragmoplastes; Pointes de flèche: les cheveux racines. ( E ) Projections d&#39;intensité maximale des images haute résolution acquises à partir d&#39;une racine latérale jeune de la ligne transgénique montrée en ( D ) en utilisant un objectif 63X / 1.2 NA et un prélèvement Nyquist (dimensions des pixels de 77 nm x 77 nm) à 0 h et 16 H; Les astérisques localisent des cellules identiques à chaque point de temps; La flèche indique une cellule qui se divise entre 0h et 16 h.Barres d&#39;échelle = 50 μm (AC); 20 μm (E). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" /> Figure 3 : Développement de racines latérales à long terme dans les chambres d&#39;imagerie. ( A ) Parcelle montrant la croissance absolue moyenne de la racine dans trois intervalles consécutifs de 24 h dans les chambres d&#39;imagerie par rapport aux plaques. Ns indique p&gt; 0,05; *** indique p &lt;0,001 (test t d&#39;étudiant). N = 33 (plaques) et n = 27 (chambres d&#39;imagerie). ( B ) Tracer les longueurs de racines latérales à des points de temps consécutifs sur toutes les racines utilisées dans (A). Rouge: toutes les racines latérales avec une longueur finale dans 1 SD de la moyenne de toutes les racines latérales cultivées sur plaques (entre 927 et 3163 μm). ( C ) Maximum enProjections de tension des piles confocales 3D représentatives du marqueur plasma-membrane NPSN12-YFP dans les racines latérales, acquises à des moments consécutifs de plus de 72 h. Barres d&#39;échelle = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" /> Figure 4 : Les chambres d&#39;imagerie peuvent être adaptées pour d&#39;autres organes végétaux. ( A - C ) Adaptation de la chambre d &#39;imagerie pour les racines primaires. ( A ) Schéma de conception de chambre d&#39;imagerie. Ceci est identique à la conception standard ( Figure 1 ) en dehors de deux modifications: la dalle moyenne MS contient 0,8% d&#39;agar au lieu de 1,5% d&#39;agar, et un film de cellulose (rouge) est placé entre la gélose et la plante pour éviter la croissanceDans la gélose. ( B ) les projections de l&#39;intensité maximale XY (supérieure) et XZ (bas) des piles confocales 3D représentatives du marqueur plasma-membrane NPSN12-YFP dans la racine primaire d&#39;un plant de 7 jours d&#39;imagerie à 0 h et 48 h dans une image conventionnelle chambre. Notez que la racine se développe dans la gélose en raison de sa réponse gravitrice. ( C ) XY (haut) et XZ (en bas) des projections d&#39;intensité maximale des piles confocales 3D représentatives du marqueur plasma-membrane NPSN12-YFP dans la racine primaire d&#39;un grappin de sept jours reproduit à 0 h et 48 h dans l&#39;imagerie Chambre avec film de cellulose. Avant l&#39;application, le film de cellulose a été stérilisé dans de l&#39;éthanol à 80% et trempé dans un milieu liquide ½ MS. Notez que la croissance gravitrice de la racine dans la gélose est empêchée. ( D - F ) Adaptation de chambre d &#39;imagerie pour hypocotyls. ( D ) Schéma montrant la conception de la chambre d&#39;imagerie hypocotylique. Un joint de gomme poly (diméthylsiloxane) (gris) est fabriquéRouge sur une glissière cavité entre deux bandes de verre (jaune). Une plaque de 1,5% d&#39;agar d&#39;épaisseur uniforme (beige) est placée sur la glissière, atteignant partiellement dans la cavité. La chambre est remplie de PFD (bleu). Des semelles sont placées sur la dalle de gélose de telle sorte que l&#39;hypocotyle occupe la région en pente descendante de la plaque de gélose dans la cavité tandis que la racine est positionnée sur la partie horizontale de la gélose. La chambre est fermée avec une lamelle. ( E ) Projections d&#39;intensité maximale des piles confocales 3D représentatives du marqueur plasma-membrane NPSN12-YFP dans un hypocotyle d&#39;un plant de deux jours reproduit pendant 48 heures à des moments consécutifs. ( F ) Croissance longitudinale en deux intervalles de temps consécutifs de cellules individuelles le long de l&#39;axe basal à apical (positions relatives à 0 h le long de l&#39;axe représenté par E) de l&#39;hypocotyl montré dans ( E ). Notez la vague de croissance précédemment décrite en migration de l&#39;hypocotyle 16 . Barres d&#39;échelle = 100 μM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" /> Film 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">Cliquez ici pour télécharger ce film.</a> <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" /> Movie 2: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">Cliquez ici pour télécharger ce film.</a> <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" /> Film 3: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">S&#39;il vous plaît c</a>Lèche ici pour télécharger ce film.

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A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Présenté ici, il s&#39;agit d&#39;une technique simple pour l&#39;imagerie confocale temporelle à haute résolution du développement de la racine et de l&#39;hypocotylie pendant jusqu&#39;à 3 jours en utilisant des objectifs d&#39;ouverture numérique élevée et la perfluorodécaline comme milieu d&#39;immersion.

Une chambre simple pour l&#39;imagerie confocale à long terme du développement racinaire et hypocotylique

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K vues.  University of Oxford.  Présenté ici, il s'agit d'une technique simple pour l'imagerie confocale temporelle à haute résolution du développement de la racine et de l'hypocotylie pendant jusqu'à 3 jours en utilisant des objectifs d'ouverture numérique élevée et la perfluorodécaline comme milieu d'immersion. 

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Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Recherche

Biologie du développement

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

Time-lapse d&#39;imagerie par fluorescence de la croissance racinaire d&#39;Arabidopsis avec la manipulation rapide de l&#39;environnement root en utilisant le RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Bio-ingénierie

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivre imagerie confocale de développement Arabidopsis Fleurs

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Neurosciences

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

À long terme, à haute résolution d&#39;imagerie confocal Time Lapse d&#39;<em&gt; Cotylédon Arabidopsis</emEpiderme&gt; cours de germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biologie

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Mesure spatiale et temporelle Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de plantes d&#39;Arabidopsis

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Fiche Fluorescence Microscopy Lumière de racines de plante qui pousse sur la surface d&#39;un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Une chambre simple pour l'imagerie confocale à long terme du développement racinaire et hypocotylique

Résumé

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en cours d'analyse

Time-lapse d'imagerie par fluorescence de la croissance racinaire d'Arabidopsis avec la manipulation rapide de l'environnement root en utilisant le RootChip

Vivre imagerie confocale de développement Arabidopsis Fleurs

Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

À long terme, à haute résolution d'imagerie confocal Time Lapse d'

Mesure spatiale et temporelle Ca

Fiche Fluorescence Microscopy Lumière de racines de plante qui pousse sur la surface d'un gel