Dans cette vidéo, nous montrerons comment quantifier la transduction de l’AAV dans la rétine de souris en utilisant la méthode de PCR par gouttelettes numériques, qui est extrêmement sensible et effectue une quantification absolue de l’ADN cible. Nous avons développé cette méthode principalement pour les grandes constructions AVV qui ne nous permettent pas d’utiliser un gène rapporteur comme les constructions basées sur CRISPR. En utilisant cette méthode, nous pouvons simplement quantifier le taux de transduction des AAV dans la rétine.
Cette méthode repose sur la sensibilité et la quantification absolue de la PCR numérique des gouttelettes et donne des résultats simples. Dans cette vidéo, nous montrerons comment quantifier la transduction de l’AAV dans la rétine de souris en utilisant la méthode de PCR par gouttelettes numériques, qui est extrêmement sensible et effectue une quantification absolue de l’ADN cible. Nous avons développé cette méthode principalement pour les constructions de grande surface qui ne nous permettent pas d’utiliser un gène rapporteur comme les constructions basées sur CRISPR.
En utilisant cette méthode, nous pouvons simplement quantifier le taux de transduction des AAV dans la rétine. Cette méthode repose sur la sensibilité et la quantification absolue des deux gouttelettes PCR et donne des résultats simples. En raison de l’efficacité de la méthodologie de PCR par gouttelettes numériques, plusieurs laboratoires passent déjà de la PCR quantitative en temps réel à la PCR numérique par gouttelettes ou au titrage AAV.
Cette méthode peut également fournir une base pour la quantification de l’ADN mitochondrial dans la rétine, ainsi que pour vérifier l’efficacité de la correction de mutation basée sur CRISPR pour la thérapie génique dans la rétine de la souris. Préparez le mélange de transfection avec le plasmide auxiliaire AAV, le plasmide de capside AAV, le vecteur AAV et la solution PI à la demande de cinq millilitres. Ajouter le mélange de transfection préparé de cinq millilitres dans le milieu de culture.
Incuber les cellules transfectées à 37 degrés Celsius. Collectez les supports 48 à 60 heures après la transfection. Digérer le milieu avec des ADN à une concentration finale de 250 unités par millilitre pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et le centrifuger à 4 000 g quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.
Pré-mouillez la membrane de cellulose régénérée avec du PBS. Filtrer le média avec un filtre à seringue de 0,22 micromètre dans la membrane de cellulose régénérée pré-mouillée pour les Dalton de 100 kilos. Centrifuger la membrane de cellulose régénérée à 4 000 G à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes et jeter le milieu.
Lavez et centrifugez la membrane de cellulose régénérée avec du PBS contenant 0,001% de F68 pluronique trois fois à 4000 G quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Collectez les AAV concentrés dans la partie supérieure de la membrane de cellulose régénérée et allouez-les pour une utilisation ultérieure. Ici, nous avons montré comment faire une production AAV à plus petite échelle.
Après avoir vérifié ce protocole, vous devriez être en mesure de faire des AVV qui sont suffisants pour voir l’expression rapporteure dans la rétine. Vous pouvez également suivre le protocole de PCR numérique pour pouvoir titrer les AAV produits. Appliquer une goutte de 0,5% de tropicamide et de 2,5% de chlorhydrate de phényléphrine contenant du collyre avant l’anesthésie pour dilater les pupilles.
Anesthésiez les souris avec de l’isoflurane et vérifiez les réflexes. Appliquer 0,3% de tobramycine et 0,1% de dexaméthasone goutte ophtalmique stérile sur chaque œil avant la procédure d’injection. Utilisez le crochet chirurgical pour stabiliser la paupière supérieure.
Tirez légèrement en arrière pour exposer la partie dorsale de l’œil. Collez le crochet sur la bande pour le maintenir en position. Retirez la conjonctive avec les ciseaux à iris incurvé pour exposer la sclérotique de l’œil.
Utilisez une seringue à insuline 30G fraîche et stérile pour percer la sclérotique. Insérez l’aiguille de la micro seringue à travers la même ponction à l’aide d’un micro-manipulateur. Placez le bout de l’aiguille derrière la lentille au milieu de la coupe oculaire.
Injecter un micro litre de solution d’AAV lentement dans le vitré de l’œil. Laissez l’aiguille en place pendant une minute et retirez-la lentement. Appliquer un traitement en gel topique anti-inflammatoire et antibactérien contenant 0,3% de tobramycine et 0,1% dexaméthasone sur la coupe oculaire.
Appliquez une goutte de 0,5% de tropicamide. Et 2,5% de chlorhydrate de phényléphrine contenant du collyre avant l’anesthésie pour dilater les pupilles. Appliquer du carbamide deux milligrammes par gramme de gel topique sur la surface des yeux.
Ajustez le support de la souris au besoin pour centrer l’œil de la souris. Effectuer une imagerie du fond d’œil et de la fluorescence sur les deux yeux pour suivre l’expression de TdTomato une semaine et deux semaines après l’injection intravitréenne. Euthanasier les animaux en utilisant l’inhalation de dioxyde de carbone avant la procédure.
Déplacez le globe oculaire vers l’avant à l’aide d’une pince fendeuse de 13,5 centimètres. Retirez la lentille avec les restes du vitré. Coupez la connexion du globe oculaire au nerf optique avec une pince incurvée de précision et pressez doucement la rétine avec la même pince incurvée.
Isolez l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’ADN génomique tissulaire à base de film de digestion de la protéinase K commercialisé. Digérer complètement la rétine à 55 degrés Celsius 200 G pendant 30 minutes avec la protéinase K.Lyse rétine et suivre le sprotocol du fabricant. Dans ces protocoles, nous avons montré l’imagerie par injection intravitréenne de la florescence du fond d’œil, ainsi que l’isolement de la rétine et de l’ADN génomique.
Ce sont des procédures très critiques pour la rétine, et en suivant ce protocole, vous devriez être en mesure d’injecter les AAV produits et de suivre leur profil d’expression. Et louche cette efficacité de transduction en quantifiant les génomes AAV dans l’ADN génomique rétinien. Ici, vous pouvez voir l’application de base de la PCR numérique par gouttelettes, où vous pouvez faire une quantification absolue du génome AAV qui transduit dans les cellules rétiniennes.
Diluer les ADN génomiques des rétines injectées dans une solution pluronique F 68 à 0,05 % pour atteindre une concentration finale d’un nanogramme par microlitre pour chaque échantillon. Effectuez la génération de gouttelettes dans un mélange de réactions PCR de 20 microlitres, y compris un nanogramme d’ADN génomique 125 nanomolaires et 2X super mélange à feuilles persistantes. Chargez le mélange d’échantillons dans la partie centrale de la cartouche pour la génération de gouttelettes.
Ensuite, ajoutez 70 microlitres d’huile de génération de gouttelettes dans la rangée inférieure de la cartouche. Placez le joint sur le dessus de la cartouche. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’espace entre le joint et la cartouche.
Ensuite, placez-le dans le générateur de gouttelettes. Prenez doucement environ 40 microlitres de gouttelettes qui sont générées dans la cloche supérieure. Ajouter la solution de gouttelettes à la plaque de réaction PCR semi-jupe de 96 puits.
Scellez la plaque PCR avec un scellant à plaque PCR à l’aide d’une feuille d’étanchéité en aluminium. Placez la plaque PCR dans le cycleur thermique thermoscellé à 96 puits. Utilisez le protocole ddPCR indiqué dans l’article.
Placez la plaque PCR dans le lecteur de gouttelettes pour analyser les données. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’effectuer la technique de PCR numérique de base. Vous pouvez également utiliser des cellules sollicitées avec des quantités mineures de matériau, ce qui est idéal pour la technique de PCR numérique.
Cependant, vous devez ajuster soigneusement la quantité d’ADN cible pour ne pas dépasser la limite de la PCR numérique par gouttelettes. Voici l’organigramme de la procédure expérimentale. Nous avons effectué une production d’AAV à petite échelle, qui est suivie d’un titrage d’AAV.
Ensuite, nous avons effectué une injection intravitréenne. Ensuite, nous avons quantifié l’intensité fluorescente par imagerie par fluorescence du fond d’œil. Ensuite, isolé les rétines de souris et extrait l’ADN génomique des rétines pour la ddPCR.
Le titrage de l’AAV est également essentiel pour pouvoir quantifier correctement la transduction de l’AAV. La ddPCR dépend de la génération de gouttelettes qui a dilué la généome AAV cible. Les résultats représentatifs de la ddPCR montrent des gouttelettes positives et négatives pour le génome de l’AVV.
Positif au-dessus du seuil et négatif est en dessous. Après multiplication avec les facteurs de dilution, le titre des AAV s’est avéré être de 10 à 12 dans les copies du génome par millilitre. Afin de quantifier correctement l’efficacité de la transduction de l’AAV, plusieurs rétines ont été injectées.
Les animaux injectés ont été photographiés et l’intensité moyenne de fluorescence a été calculée. À deux semaines, les rétines ont été isolées. Et ddPCR a été effectué à l’aide d’amorces WPRE et 18 S.
L’intensité de fluorescence des rétines injectées par AAV a été corrélée avec les calculs du génome AAV, montrant la puissance de la méthodologie. Ici, nous avons montré plusieurs techniques, y compris l’injection intravitréenne de préparation aAV à petite échelle.
